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Neuroscience

Microtransplantation de membranes synaptiques pour réactiver les récepteurs synaptiques humains pour les études fonctionnelles

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/64024
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1The Mitchell Center for Neurodegenerative Diseases, Department of Neurology, University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

Summary

Le protocole démontre qu’en effectuant une microtransplantation de membranes synaptiques en ovocytes Xenopus laevis , il est possible d’enregistrer des réponses cohérentes et fiables de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique et des récepteurs de l’acide γ-aminobutyrique.

Abstract

Les récepteurs ionotropes excitateurs et inhibiteurs sont les principales portes des flux ioniques qui déterminent l’activité des synapses au cours de la communication neuronale physiologique. Par conséquent, des altérations de leur abondance, de leur fonction et de leurs relations avec d’autres éléments synaptiques ont été observées comme un corrélat majeur des altérations de la fonction cérébrale et des troubles cognitifs dans les maladies neurodégénératives et les troubles mentaux. Comprendre comment la fonction des récepteurs synaptiques excitateurs et inhibiteurs est altérée par la maladie est d’une importance cruciale pour le développement de thérapies efficaces. Pour obtenir des informations pertinentes pour la maladie, il est important d’enregistrer l’activité électrique des récepteurs de neurotransmetteurs qui restent fonctionnels dans le cerveau humain malade. Jusqu’à présent, il s’agit de l’approche la plus proche pour évaluer les altérations pathologiques de la fonction des récepteurs. Dans ce travail, une méthodologie est présentée pour effectuer la microtransplantation de membranes synaptiques, qui consiste à réactiver des membranes synaptiques à partir de tissus cérébraux humains congelés contenant des récepteurs humains, par son injection et sa fusion postérieure dans la membrane des ovocytes Xenopus laevis . Le protocole fournit également la stratégie méthodologique pour obtenir des réponses cohérentes et fiables des récepteurs de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPA) et de l’acide γ-aminobutyrique (GABA), ainsi que de nouvelles méthodes détaillées utilisées pour la normalisation et l’analyse rigoureuse des données.

Introduction

Les troubles neurodégénératifs affectent un grand pourcentage de la population. Bien que leurs conséquences dévastatrices soient bien connues, le lien entre les altérations fonctionnelles des récepteurs des neurotransmetteurs, qui sont essentiels au fonctionnement du cerveau, et leur symptomatologie est encore mal compris. La variabilité interindividuelle, la nature chronique de la maladie et l’apparition insidieuse des symptômes ne sont que quelques-unes des raisons qui ont retardé la compréhension des nombreux troubles cérébraux où les déséquilibres chimiques sont bien documentés 1,2. Les modèles animaux ont généré des informations inestimables et élargi nos connaissances sur les mécanismes sous-jacents à la physiologie et à la physiopathologie dans les systèmes évolutifs conservés; cependant, plusieurs différences interespèces entre les rongeurs et les humains empêchent l’extrapolation directe de la fonction des récepteurs des modèles animaux au cerveau humain3. Ainsi, les premiers efforts pour étudier les récepteurs humains natifs ont été développés par le laboratoire de Ricardo Miledi en utilisant des tissus enlevés chirurgicalement et des échantillons congelés. Ces expériences initiales ont utilisé des membranes entières qui comprennent des récepteurs synaptiques et extra synaptiques neuronaux ainsi que des récepteurs de neurotransmetteurs non neuronaux, et bien qu’elles fournissent des informations importantes sur les états malades, on craint que le mélange de récepteurs ne complique l’interprétation des données 4,5,6,7. Il est important de noter que les synapses sont la cible principale de nombreux troubles neurodégénératifs 8,9; par conséquent, les tests pour tester les propriétés fonctionnelles des synapses affectées sont fondamentaux pour obtenir des informations sur les changements pertinents pour la maladie affectant la communication synaptique. Ici, une modification de la méthode originale est décrite: la microtransplantation des membranes synaptiques (MSM), qui se concentre sur la caractérisation physiologique des préparations de protéines synaptiques enrichies et a été appliquée avec succès à l’étude des synaptosomes 10,11,12,13,14,15 . Avec cette méthodologie, il est possible de transplanter des récepteurs synaptiques qui travaillaient autrefois dans le cerveau humain, intégrés dans leurs propres lipides natifs et avec leur propre cohorte de protéines associées. De plus, comme les données des HARSAH sont quantitatives, il est possible d’utiliser ces données pour les intégrer à de grands ensembles de données protéomiques ou de séquençage10.

Il est important de noter que de nombreuses analyses pharmacologiques et biophysiques des récepteurs synaptiques sont effectuées sur des protéines recombinantes16,17. Bien que cette approche fournisse un meilleur aperçu des relations structure-fonction des récepteurs, elle ne peut pas fournir d’informations sur les complexes complexes de récepteurs multimériques trouvés dans les neurones et leurs changements dans la maladie. Par conséquent, une combinaison de protéines natives et recombinantes devrait fournir une analyse plus complète des récepteurs synaptiques.

Il existe de nombreuses méthodes pour préparer les synaptosomes 10,11,12,13,14,15 qui peuvent être ajustés pour les besoins d’un laboratoire. Le protocole part de l’hypothèse que les préparations enrichies en synaptomoses ont été isolées et sont prêtes à être traitées pour des expériences de microtransplantation. En laboratoire, la méthode Syn-Per est utilisée en suivant les instructions du fabricant. Ceci est fait en raison de la reproductibilité élevée dans les expériences électrophysiologiques10,11. Il existe également une abondante littérature expliquant comment isoler les ovocytes Xenopus 18,19, qui peuvent également être achetés prêts pour l’injection20.

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Protocol

Toutes les recherches sont effectuées conformément aux directives institutionnelles et approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à Irvine (IACUC-1998-1388) et de la branche médicale de l’Université du Texas (IACUC-1803024). Le cortex temporal d’un cerveau non atteint de la maladie d’Alzheimer (MA) (femme, 74 ans, intervalle post-mortem 2,8 h) et d’un cerveau atteint de la maladie d’Alzheimer (femme, 74 ans, intervalle post-mortem 4,5 h) ont été fournis par le centre de recherche sur la maladie d’Alzheimer de l’Université de Californie Irvine (UCI-ADRC). Le consentement éclairé pour le don de cerveau a été obtenu par l’UCI-ADRC.

REMARQUE: Le tissu cérébral humain non fixé doit être traité comme une source d’agents pathogènes à diffusion hématogène (BBP). En conséquence, une formation BBP est nécessaire avant de commencer les expériences. Ce protocole est exécuté dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL2) selon les exigences BSL2. Les lignes directrices et les précautions à l’intérieur du laboratoire comprennent : aucun aliment ou boisson autorisé dans le laboratoire, les bonnes pratiques de laboratoire doivent être suivies, l’équipement de protection individuelle (gants, blouse, pas de chaussures à bout ouvert) est requis et la porte doit être fermée en tout temps.

1. Préparation de micro-injection d’ovocytes Xenopus

  1. Pour fabriquer des aiguilles d’injection, tirez des tubes de borosilicate de 3,5 pouces à l’aide d’un extracteur de micropipette. Une fois les aiguilles de micro-injection tirées, utilisez un microscope et une lame de rasoir pour couper suffisamment de la pointe de l’aiguille afin que la microinjection puisse être effectuée (généralement entre 2 et 3 mm).
    REMARQUE: La longueur de la pointe de l’aiguille à couper peut varier.
  2. Préparer 1x la solution de Barth en ajoutant 200 mL de solution mère de Barth (5x) à 800 mL d’eau distillée. Remplissez une plaque de culture tissulaire à fond plat de 24 puits avec 18 °C 1x de solution de Barth.
    1. Préparez la solution mère de 5x Barth comme suit. Dans 1 L d’eau distillée, ajouter 25,71 g de NaCl (chlorure de sodium), 0,372 g de KCl (chlorure de potassium), 0,301 g de CaCl2 (dichlorure de calcium), 0,389 g de Ca(NO3)2(4H2O) (nitrate de calcium tétrahydraté), 1,01 g de MgSO4(7H2O) (sulfate de magnésium heptahydraté), 1,008 g deNaHCO3 (bicarbonate de sodium), et 11,91 g d’HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique).
  3. Isolez les ovocytes Xenopus en utilisant les protocoles décrits dans18,19 et en utilisant un stéréoscope agrandi 2x, en sélectionnant des ovocytes de stade V-VI d’apparence saine. Placez environ 10 ovocytes par puits et utilisez l’un des puits pour abriter des ovocytes non injectés à utiliser comme cellules de contrôle lors de l’enregistrement.
  4. Récupérez une petite boîte de Petri, de 1 cm de haut et 6 cm de diamètre, et placez une maille de nylon à l’intérieur afin qu’elle recouvre le fond du plat. Ensuite, versez 15 mL de 1x solution de Barth à utiliser pour effectuer des microinjections des ovocytes.
  5. Placez un nanoinjecteur le long de la ligne médiane de la plate-forme du microscope. Tournez l’aimant en position Off et déplacez lentement le nanoinjecteur vers la position souhaitée tout en le soutenant soigneusement. Lorsque le nanoinjecteur est correctement positionné, retournez l’aimant en position complètement allumée et assurez-vous qu’il est sécurisé.
  6. Pour une taille d’échantillon de 50,6 nL, utilisez les paramètres suivants sur le côté du nanoinjecteur : 1 est D (vers le bas), 2 est D, 3 est U (vers le haut), 4 est D et 5 est U. Positionnez un morceau de thermoplastique auto-scellant, ou bouchon de tube de microcentrifuge, sur le support du microscope, en l’alignant sur la trajectoire du nanoinjecteur.
    REMARQUE: 50 nL est proche de la quantité maximale de matériel injecté que le cytoplasme peut supporter21.
  7. Remplissez une seringue à insuline d’environ la moitié de son volume avec de l’huile minérale (environ 0,5 mL/cc). À l’aide de cette seringue, remplissez l’aiguille de micro-injection avec de l’huile minérale. Assurez-vous qu’une perle d’huile visible est visible à l’extrémité de l’aiguille.
  8. Exposez le piston du nanoinjecteur à un minimum de 1-2 cm. Pour ce faire, maintenez le bouton VIDE enfoncé jusqu’à ce que le piston soit visible à la longueur souhaitée. Une fois le piston exposé, placez lentement et soigneusement l’aiguille en verre de micro-injection remplie d’huile minérale sur le piston du nanoinjecteur et assurez-vous qu’elle s’adapte bien à travers le joint torique à résistance noire et s’arrête à l’anneau de résistance blanc. Assurez-vous de ne pas plier le piston du nanoinjecteur dans le processus.
  9. Une fois que l’aiguille en verre de micro-injection est sécurisée et en place, appuyez sur VIDE pour vider toute bulle d’air potentielle. Nettoyez doucement, avec un mouchoir en papier, l’excès d’huile minérale.

2. Chargement de l’échantillon

  1. Préparer des préparations enrichies synaptomomiques (échantillons) de la région du cerveau humain d’intérêt décrite au 10,11,12,13,14,15, et les stocker dans des aliquotes d’environ 5 μL à -80 °C jusqu’au moment de l’injection.
  2. Avant l’injection, transférer l’aliquote sur de la glace humide et la garder sur la glace en tout temps, sauf pour la sonication et la récupération. Le nombre et les types d’échantillons seront déterminés par le plan expérimental.
  3. Soniquer les échantillons sélectionnés 3x dans un bain avec de la glace humide flottante pour éviter l’échauffement de l’échantillon. Utilisez 5 cycles s à chaque fois, en attendant 1 min sur de la glace humide entre les cycles.
  4. Placer 1 μL d’échantillon sur le thermoplastique. Effectuez une indentation dans la surface, si nécessaire, avant le placement de l’échantillon pour empêcher le mouvement de l’échantillon.
  5. Utilisez les boutons du manipulateur qui maintiennent le nanoinjecteur pour positionner l’aiguille et la déplacer vers l’échantillon à remplir. Une fois que l’embout de l’aiguille est dans l’échantillon, appuyez sur le bouton FILL et maintenez-le enfoncé jusqu’à ce qu’un échantillon suffisant soit prélevé. Environ 0,5 μL est nécessaire pour 10 ovocytes. À l’aide des boutons, déplacez l’aiguille du nanoinjecteur à la position la plus élevée.

3. Injection des ovocytes

REMARQUE: Des membranes synaptomomiques normalisées du cortex rat sont également injectées dans toutes les expériences dans un ensemble d’ovocytes pour mesurer les changements dans la capacité de fusion entre différents lots d’ovocytes.

  1. Placez les ovocytes sélectionnés sur la petite boîte de Petri qui a la maille de nylon ajustée et la solution de Barth (environ 10 ovocytes). Disposer les ovocytes de manière à ce qu’ils ne soient pas les uns sur les autres; cela sera utile pendant le processus d’injection.
  2. À l’aide des boutons du manipulateur qui maintiennent le nanoinjecteur, déplacez l’aiguille vers les ovocytes. Une fois l’aiguille immergée dans la solution de Barth, utilisez la pédale du nanoinjecteur pour vous assurer que l’aiguille de micro-injection libère l’échantillon. Si l’échantillon est libéré, il sera visible à partir de la vue du microscope.
  3. Une fois qu’il est établi avec certitude que l’échantillon est libéré, passez à la microinjection de l’ovocyte. Si l’échantillon n’est pas libéré, répétez le processus de remplissage de l’aiguille.
  4. Pénètrez dans l’ovocyte juste sous la surface avec l’aiguille, pas plus profondément, et utilisez la pédale pour injecter l’échantillon. La pédale émettra un bip sonore lorsque l’échantillon sera libéré. Attendez environ 2-3 s. Si l’injection a réussi, la cellule se dilatera. Une fois que cela se produit, utilisez les boutons du manipulateur pour sortir de la cellule.
    REMARQUE: La fusion des membranes dans l’ovocyte est un processus polarisé; par conséquent, l’ovocyte doit être injecté dans le côté animal de la cellule, de préférence au-dessus de l’équateur, avec l’angle de l’aiguille vers le côté animal pour maximiser la fusion membranaire.
  5. Déplacez la boîte de Petri de sorte que l’ovocyte suivant soit aligné avec l’aiguille et répétez le processus jusqu’à ce que tous les ovocytes de la boîte aient été injectés. Répétez ce processus jusqu’à ce que le nombre souhaité d’ovocytes ait été injecté. Assurez-vous qu’un puits d’ovocytes est laissé non injecté pour être utilisé comme témoin.
  6. Une fois que tous les ovocytes ont été injectés, rétractez le nanoinjecteur à sa position d’origine et retirez l’aiguille.

4. Enregistrement des courants ioniques à l’aide d’une pince de tension à deux électrodes

  1. Pour fabriquer deux aiguilles d’électrode de serrage de tension d’électrode (TEVC), tirez des tubes en verre borosilicate poli au feu de 15 cm de long à l’aide de l’extracteur de micropipette. Une fois la traction terminée, remplir avec 3 M KCl à l’aide de longues aiguilles capillaires, ou bien, immerger et faire bouillir les aiguilles dans une solution de 3 M KCl pendant 15 min sous vide continu. La température élevée aide au remplissage des électrodes et à l’élimination des bulles d’air.
    1. Préparez une solution de remplissage d’électrode de 3 M KCl en utilisant du KCl sous forme cristalline et de l’eau désionisée, et en suivant attentivement ces étapes afin que le potentiel de référence des électrodes ne soit pas modifié. Sécher soigneusement le KCl dans un four pendant 2-3 h. À l’aide d’une balance analytique, peser soigneusement 223,68 g de KCl. Transférer le KCl dans une bouteille en verre de 1 L. Utilisez cette solution pour chlorer les fils d’électrodes d’argent.
      REMARQUE: Pour tirer des électrodes en verre, le livre de recettes de la pipette peut être téléchargé ici: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf.
  2. Allumez tous les équipements utilisés pour l’enregistrement des courants ioniques : systèmes principaux, vannes de solution, lumière de microscope, systèmes de vannes, pince à ovocytes et système de vide. Allumez l’ordinateur de bureau, connectez-vous à WinEDR V3.9.1. et assurez-vous que le programme est en cours d’exécution et que les valeurs d’installation sont correctes comme suit: enregistrer sur le disque, définir la durée d’enregistrement et effacer l’option du simulateur.
    1. Indiquez les valeurs de configuration initiales suivantes pour l’amplificateur : pour la section de l’électrode de tension (Vm), désactivez la compensation de capacité négative (-C) ; pour la section des électrodes de bain (Im), réglez le sélecteur de gain (plage de 0,1 à 10) à 10 et l’interrupteur à bascule à trois positions qui sélectionne le multiplicateur de gain (x0,1, x1,0 et x10) à x1,0. Les voyants LED indiqueront la sélection du multiplicateur de gain; pour la section de serrage, éteignez le sélecteur de mode de serrage, réglez le contrôle de gain CC sur IN et le contrôle de gain en boucle ouverte à bande passante complète (plage de 0 à 2000) à environ 1200; pour les commandes, réglez à 40 mV et réglez les commandes de maintien négatives et le multiplicateur d’échelle sur x2; pour l’électrode de courant, utilisez le décalage Ve pour établir une référence zéro avant d’empaler l’ovocyte.
    2. Pour enregistrer, ouvrez le logiciel WinEDR V3.9.1, accédez au menu supérieur et sélectionnez Fichier > Ouvrir un nouveau fichier. Créez votre propre dossier et enregistrez le fichier.
    3. Ensuite, dans le menu principal, sélectionnez Enregistrer > Enregistrer sur le disque. Lorsque les deux électrodes sont à l’intérieur de l’ooctyte, allumez la sonnerie dans le contrôleur de vanne VC-8 et tournez la pince sur Slow dans l’amplificateur OC-725C. Ensuite, revenez au logiciel WinEDR et sélectionnez Enregistrer en haut à gauche de l’écran.
    4. Dans le graphique des marques en bas à gauche, notez votre potentiel de membrane initial et appuyez sur Entrée. Au fur et à mesure que l’expérience se poursuit, vous pouvez écrire le nom des médicaments utilisés. Une fois l’expérience terminée, sélectionnez Arrêter en haut à gauche de l’écran.
      REMARQUE: Nous utilisons le logiciel WinEDR ou WinWCP pour effectuer TEVC car ceux-ci sont gratuits et bien adaptés aux expériences, mais tout autre logiciel disponible peut être utilisé.
  3. Composez toutes les solutions médicamenteuses nécessaires pour effectuer l’expérience (par exemple, GABA, Kainate) et confirmez que les valves de solution fonctionnent correctement en les allumant et en les éteignant et en observant le déplacement des valves à pincement.
  4. Remplissez les tubes en versant la solution correspondante sur le récipient à seringue relié au tube et étiquetez le contrôleur de valve pour qu’il soit en corrélation avec les tubes de solution. Assurez-vous que le flux de solution est stable, qu’il n’y a pas de bulles et que le système de vide fonctionne correctement.
  5. Configurez le microscope et la zone de la chambre d’enregistrement. Placez les ponts de gélose (voir ci-dessous) dans les trous circulaires respectifs derrière la chambre d’enregistrement (distale de la zone de manutention), reliant les puits pour les électrodes utilisées comme référence au sol et la chambre d’enregistrement. Ajoutez la solution de travail de Ringer (1x) à la chambre d’enregistrement et aux puits d’électrodes de référence au sol.
    1. Les ponts de gélose sont des tubes borosilicate en forme de U, de 2 à 3 cm de long, remplis de gélose à 3% dans la solution de Ringer. Fabriquez des tubes en forme de U en coupant des tubes de 15 cm de long, en les pliant sur la flamme nue, puis en les remplissant de gélose chaude à 3% à l’aide d’une seringue à insuline. Conservez les ponts de gélose remplis dans la solution de Ringer au réfrigérateur jusqu’à utilisation.
    2. Faire 20x la solution mère de Ringer comme suit: Dans 1 L d’eau distillée, ajouter 134,4 g de NaCl, 2,982 g de KCl, 5,29 g de CaCl2 et 23,83 g d’HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique). Pour 1x la solution de travail de Ringer, dans une fiole jaugée, ajouter 200 mL de solution mère de Ringer (20x) à 3 800 mL d’eau distillée.
  6. Préparer des électrodes en argent chloré avant chaque expérience par électrolyse en plaçant des fils d’argent dans une solution de 3 M KCl et en connectant l’électrode d’argent à la borne positive d’une batterie de 9 V. Après environ 3 min, une couche brune solide d’AgCl est déposée dans l’électrode. Placez les fils d’électrode en argent chloré dans le boîtier de l’électrode.
    REMARQUE: Les électrodes chlorées de référence au sol et d’enregistrement sont des électrodes en argent / chlorure d’argent (Ag / AgCl).
  7. Retirez les aiguilles de borosilicate de la solution de KCl. Utilisez une seringue pour extraire une petite quantité de solution de KCl de l’extrémité ouverte de l’aiguille de l’électrode et remplacez la solution de KCl par de l’huile minérale; cela évitera l’évaporation de l’eau et les changements dans la concentration de KCl dans l’aiguille. Faites glisser l’aiguille de verre sur le fil d’électrode en argent chloré et serrez-les en place.
  8. À l’aide des manipulateurs droit et gauche qui maintiennent les électrodes, guidez les aiguilles des électrodes dans la chambre d’enregistrement remplie de la solution de Ringer.
  9. Vérifiez la résistance de chaque électrode en mettant à zéro les boutons de décalage Vm et Ve, puis en appuyant sur les boutons de test d’électrode . La résistance doit être comprise entre 0,5 et 3 MΩ (directement lue comme 5-30 mV à l’écran). Si la résistance est hors de portée, remplacez-la à l’aide de nouvelles microélectrodes.
  10. Remplissez la chambre d’enregistrement avec la solution fraîche de Ringer. À l’aide d’une pipette en verre, placez un ovocyte non injecté ou microtransplanté au centre de la chambre d’enregistrement. Assurez-vous que l’ovocyte est clairement visible au microscope, avec le côté animal vers le haut (voir note à l’étape 3.4).
  11. Guidez l’électrode dans la solution de Ringer jusqu’à ce qu’ils touchent la membrane ovocytaire. Percez doucement la membrane ovocytaire du côté animal (voir NOTE à l’étape 3.4) avec les deux électrodes et enregistrez le potentiel de la membrane au repos. Activez le flux de solution de la sonnerie.
  12. À l’aide de l’amplificateur à pince à ovocytes, changez le mode en Pince de tension et réglez la tension de maintien de -80 mV. Le courant sur le moniteur doit être négatif, généralement entre 0 et 0,4 microampères.
  13. Créez un nouveau fichier pour enregistrer l’enregistrement en tant que fichier > nouveau > Enregistrez l’enregistrement sur le logiciel. Démarrez l’enregistrement, appuyez sur Enregistrer > Enregistrer sur disque. Ajoutez des informations pertinentes au fichier à l’aide de la boîte de dialogue de la boîte de marquage (nom du test, médicaments utilisés, etc.).
  14. Appliquez des agonistes (p. ex. GABA, glutamate ou kainate) pour la stimulation chimique en ouvrant les valves et en les perfusant dans la chambre d’enregistrement pendant 15 s. Habituellement, utilisez un gain de 10x pour tracer le nombre maximum de points et reconstruire la réponse. Si les courants sont très faibles, augmentez l’amplification, ou le gain, afin qu’ils soient évalués et visibles. Prenez toujours note de ces changements.
    NOTE: La durée de la perfusion dépend du paradigme expérimental. Si l’objectif principal est de mesurer l’amplitude maximale, 15 s suffiront pour atteindre le pic pour le GABA ou le plateau pour le kainate.
  15. Surveillez toujours les niveaux de solution. La solution de Ringer devra être remplie fréquemment car elle est utilisée entre toutes les utilisations de la solution. Une fois l’enregistrement terminé, tournez la pince de tension en position OFF et éteignez la vanne de solution du sonneur. Retirez l’ovocyte. Arrêtez l’enregistrement et enregistrez le fichier. Répétez ces étapes pour tous les ovocytes injectés.

5. Analyse des enregistrements TEVC

  1. Enregistrez une copie des enregistrements sur une clé USB. À partir de là, ouvrez le fichier souhaité à analyser. Dans le fichier qui s’ouvre, l’enregistrement peut être visualisé, marqué et mesuré. L’analyse la plus courante comprend la mesure de l’amplitude maximale, du temps d’activation, de la désensibilisation et de la description des applications répétitives.
  2. Mesurez la réponse maximale DE L’AMPA et la réponse maximale de l’AMPA. Pour acquérir ces mesures, établissez d’abord un niveau zéro ou une ligne de base en trouvant la ligne rouge avec le curseur et en la faisant glisser vers le courant généré par l’application Ringer ou la ligne de base.
  3. Une fois le niveau zéro établi, déterminez les mesures de réponse à l’aide de la souris pour faire glisser le curseur de lecture vert et vertical vers la partie souhaitée du traceur graphique. Si vous le souhaitez, exportez les traces à analyser dans tout autre logiciel préféré
    REMARQUE: Si le niveau zéro ne peut pas être défini ou s’il y a trop de bruit indiqué sur le traceur, exportez le fichier WinEDR vers un logiciel d’analyse hors ligne, qui permettra des modifications pour fournir une base de référence de niveau et l’ajout de filtres afin de réduire le bruit.

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Representative Results

Quelques heures après l’injection, les membranes synaptiques, porteuses de leurs récepteurs de neurotransmetteurs et de leurs canaux ioniques, commencent à fusionner avec la membrane plasmique de l’ovocyte. La figure 1 montre des enregistrements des récepteurs AMPA et GABAA microtransplantés en ovocytes Xenopus. Pour la majeure partie de l’analyse, les réponses de deux ou trois ovocytes par échantillon ont été mesurées, en utilisant deux ou trois lots d’ovocytes de grenouilles différentes, pour un total de six à neuf ovocytes par échantillon. Ceci est fait pour une grande cohorte de sujets humains pour observer les différences de groupe. L’analyse est simple et mesure l’amplitude des réponses. Il est important de noter que la fusion des membranes transplantées est un processus polarisé, donc la sélection du site d’injection est très importante. L’injection dans l’hémisphère végétal ou dans l’équateur donne des résultats cohérents, tous les ovocytes injectés insérant avec succès des récepteurs et générant des courants ioniques qui suivent une distribution unimodale22. Fait intéressant, lorsque les membranes ont été initialement injectées dans le pôle animal, les réponses ovocytaires ont suivi une distribution bimodale: un groupe d’ovocytes n’avait aucune réponse ou très faible tandis que l’autre groupe avait des réponses importantes, encore plus grandes que celles des ovocytes injectés dans le pôle végétal ou dans l’équateur. Pour déterminer si certains des ovocytes injectés dans le pôle animal avaient de faibles réponses parce que les membranes humaines étaient injectées et piégées dans le noyau de l’ovocyte, un mélange de membranes isolées de l’organe électrique de Torpedo et d’ADNc codant pour la sous-unité GABAρ1 a été injecté dans le pôle du côté animal. Les récepteurs nicotiniques des membranes Torpedo ont montré une activation rapide et une désensibilisation rapide lors de la perfusion de l’acétylcholine23, tandis que la sous-unité ρ1 forme des récepteurs GABAρ1 homomériques qui ne se désensibilisent pas lors de la perfusion continue de GABA 24,25,26,27. Si l’échantillon co-injecté était accidentellement livré dans le noyau et non dans le cytoplasme, alors l’ADNc serait transcrit en ARN et traduit en récepteurs GABAρ1 fonctionnels. La figure 2 montre que lorsque l’injection était dirigée vers le noyau, les ovocytes ayant des réponses élevées à l’acétylcholine n’exprimaient pas les récepteurs GABAρ1; à l’inverse, les ovocytes ayant une réponse nulle ou faible à l’acétylcholine exprimaient des récepteurs GABA. Les résultats de cette expérience indiquent, premièrement, que dans les ovocytes à faible réponse, des membranes ont été accidentellement déposées dans le noyau de l’ovocyte; deuxièmement, l’injection de membranes lance-torpilles dans le noyau n’interfère pas beaucoup avec la transcription de l’ADNc ρ1. Quelques ovocytes co-injectés ont eu de grandes réponses à la fois à l’acétylcholine et au GABA, suggérant une rupture du noyau pendant l’injection. L’insertion améliorée de membranes transplantées dans l’hémisphère animal de l’ovocyte reflète la localisation polarisée des récepteurs de neurotransmetteurs exprimés hétérologuement 26,28. Par conséquent, en injectant dans l’hémisphère animal sans cibler le noyau, il est possible d’obtenir des réponses plus importantes. Ceci est important pour étudier des échantillons avec une faible densité de récepteurs, par exemple de tissus de la maladie d’Alzheimer (MA) avec un faible nombre de récepteurs (Figure 3).

Figure 1
Figure 1 : Courants ioniques représentatifs des ovocytes. Des courants ioniques provenant d’ovocytes injectés avec des membranes de récepteurs synaptiques humains ont été enregistrés. Les récepteurs AMPA ont été activés avec 100 mM de Kainate, et les récepteurs GABAA avec 1 mM de GABA. VH = -80 mV. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Co-injection de Torpedo et GABAρ1. La co-injection de membranes filtrées (0,1 μm) de l’organe électrique de Torpedo, riche en récepteurs de l’acétylcholine, et l’ADNc codant pour le récepteur GABAρ1 dans le pôle animal ont produit principalement deux groupes d’ovocytes en fonction de leurs réponses: un groupe d’ovocytes (A) avait de grandes réponses à l’acétylcholine (Ach; 1 mM) mais aucune réponse à 1 μM GABA (tension serrée à -80 mV), et les ovocytes du groupe (B) avaient des réponses nulles ou faibles à l’ACh mais des réponses importantes au GABA. (C) Le graphique montre la moyenne ± erreur-type de la moyenne (MEB) du courant de crête dans le groupe 1 (n = 5 ovocytes) et le groupe 2 (n = 11 ovocytes). Un ovocyte du groupe 2 avait de grandes réponses GABA et ACh suggérant une rupture du noyau; par conséquent, la distribution des réponses a été faussée à des valeurs faibles, comme le montre la différence entre la moyenne et la médiane de la distribution du courant membranaire (22 nA vs 6 nA). Ce résultat indique que l’une des causes des ovocytes à faible réponse est que les membranes sont injectées et piégées dans le noyau de l’ovocyte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Insertion polarisée de membranes cellulaires dans les ovocytes xenopus. Réponses GABA et kainate des ovocytes injectés dans les pôles animal ou végétal, avec des membranes non filtrées obtenues à partir d’un cerveau non AD (femelle, 74 ans, intervalle post-mortem 2,8 h) et d’un cerveau AD (femelle, 74 ans, intervalle post-mortem 4,5 h). Les ovocytes injectés près du pôle animal, sans cibler le noyau, ont donné des réponses plus importantes que les ovocytes injectés dans le pôle végétal, permettant ainsi l’étude d’échantillons de tissus avec un très faible nombre de récepteurs. Test t de Student entre les pôles végétaux et animaux : ** p < 0,01, *** p < 0,001, Barres indiquent la moyenne ± MEB du courant de crête, n = 5 ovocytes par colonne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’analyse des complexes protéiques natifs du cerveau humain est nécessaire pour comprendre les processus homéostatiques et pathologiques dans les troubles cérébraux et développer des stratégies thérapeutiques pour prévenir ou traiter les maladies. Ainsi, les banques de cerveaux contenant des échantillons congelés instantanément sont une source inestimable d’une grande richesse d’informations physiologiques, pour la plupart inexploitée 29,30. Une préoccupation initiale de l’utilisation de tissu post-mortem est la possibilité évidente d’une dégradation de l’ARNm ou des protéines qui pourrait confondre l’interprétation des données. Par exemple, le pH du cerveau montre systématiquement une corrélation positive avec la quantification de l’ARNm par PCR quantitative en temps réel, et cette corrélation est indépendante de la pathologie31. Les différences de pH entre les sujets peuvent entraîner des différences de quantification de l’ARNm avec de grandes variances qui peuvent obscurcir l’interprétation des résultats32. Fait intéressant, malgré la quantification plus faible des transcriptions d’ARNm à mesure que le pH s’acidifie, les covariances entre les différents transcriptions sont maintenues33, fournissant un cadre pour obtenir un profilage fiable du transcriptome des états pathologiques. Il est important de noter que, bien que l’ARNm soit hautement dégradable, les protéines transmembranaires dans le tissu post-mortem sont très résistantes à la dégradation34. Des expériences antérieures en laboratoire ont démontré que les récepteurs GABA et glutamate du cerveau humain sont fonctionnels après des intervalles post-mortem extrêmement importants35. De plus, la méthode MSM permet de mesurer directement les effets de facteurs de confusion potentiels tels que le pH au moment du décès, l’état agonal et la dégradation de l’ARNm et des protéines directement sur la fonction des récepteurs, fournissant ainsi des moyens d’utiliser ces informations dans l’analyse et l’interprétation des données.

Modifications et dépannage de la technique
Comme mentionné précédemment, le MSM est une légère modification de la transplantation originale de membranes totales, qui est une méthode qui a été largement validée et confirmée par de nombreux laboratoires universitaires et l’industrie pharmaceutique 12,36,37,38,39,40. Par exemple, la microtransplantation des récepteurs a été importante dans le développement du LY3130481 d’Eli Lilly, qui est un antagoniste sélectif TARP gamma-8 des récepteurs AMPA qui montre la sélectivité de la région du cerveau12. Le MSM suit le même principe de microtransplantation en utilisant des préparations enrichies en synaptomes; par conséquent, il est important d’avoir de bonnes préparations synaptomomiques. Nous utilisons la méthode Syn-Per car les résultats obtenus avec cette procédure sont très cohérents et l’amplitude des courants ioniques est très bien corrélée avec les niveaux de protéines synaptiques dans les expériences protéomiques10. Cependant, la microtransplantation ou le MSM peut être adapté pour étudier les récepteurs de nombreuses sources (par exemple, les membranes d’insectes38,39, le neurolemme40) avec d’excellents résultats. Il y a certains troubles où les synapses sont fortement affectées comme la maladie d’Alzheimer, ou sont disponibles en faibles quantités; dans ce cas, l’injection des membranes du côté animal aide à obtenir des courants plus importants. L’augmentation de la quantité de protéines injectées augmente également la fusion des membranes et la taille des réponses. Bien qu’il existe une corrélation négative entre la concentration de membranes injectées et la survie des ovocytes, il est possible de trouver une concentration appropriée de membranes qui permet l’analyse expérimentale donnée.

Limites des HSH
Le MSM est une méthode quantitative qui a été développée pour l’étude des récepteurs humains ou des canaux ioniques; par conséquent, il est bien adapté pour étudier les tissus avec une disponibilité limitée. Parce que les ovocytes Xenopus n’ont pas de récepteurs endogènes de glutamate ou de GABA, toute réponse au GABA ou au glutamate dans les ovocytes microtransplantés provient des récepteurs injectés qui ont fusionné avec la membrane des ovocytes. Cependant, une limitation importante du MSM est l’étude des canaux ioniques ou des transporteurs qui sont également exprimés de manière endogène dans les ovocytes, car la séparation des courants ioniques des canaux/transporteurs microtransplantés et endogènes est difficile. De futures études faisant taire les gènes endogènes pourraient être utiles avec cette limitation.

L’importance des méthodes existantes est que le MSM incorpore la membrane native avec ses protéines et récepteurs correspondants, et fournit ainsi un environnement plus physiologique pour l’analyse. Il a été constaté que les propriétés des récepteurs dans leur membrane native sont conservées après la transplantation dans les ovocytes, comme observé dans les récepteurs de neurotransmetteurs de type AMPA GluR1, α7-AcChoRs et α4β2-AcChoRs à partir de cellules cultivées41.

Les applications futures de la technique comprennent l’étude des propriétés électrophysiologiques de différentes protéines et récepteurs d’intérêt dans les membranes de cellules et de tissus cultivés et non cultivés provenant de cerveaux humains sains et malades.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les subventions NIA/NIH R01AG070255 et R01AG073133 à AL. Nous remercions également le centre de recherche sur la maladie d’Alzheimer de l’Université de Californie à Irvine (UCI-ADRC) d’avoir fourni le tissu humain présenté dans ce manuscrit. L’UCI-ADRC est financé par la subvention NIH/NIA P30 AG066519.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For Microinjection
3.5" Glass Capillaries Drummond 3-000-203-G/X
24 well, flat bottom Tissue Culture Plate Thermofisher FB012929
Flaming/Brown type micropipette puller Sutter P-1000
Injection Dish Thermofisher 08-772B
Microcentrifuge Tubes Thermofisher 02-682-002
Mineral Oil Thermofisher O121-1
Nanoject II Drummond 3-000-204
Nylon mesh Industrial Netting WN0800
Parafilm Thermofisher S37440
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Syringe Thermofisher 14-841-31
Ultrasonic cleaning bath Thermofisher FS20D
Xenopus laevis frogs Xenopus 1 4217
For Two Electrode Voltage clamp
15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries Sutter B200-116-15
Any PC computer or laptop
Low-pass Bessel Filter Warner Instruments LPF-8
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Two electrode voltage clamp workstation Warner Instruments TEV-700
ValveLink 8.2 Perfusion Controller Automate Scientific SKU:01-18
WInEDR Free software University of Strathclyde Glasgow https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
X Series Multifunction DAQ National Instruments NI USB-6341
Reagents
Calcium dichloride Thermofisher C79
Calcium nitrate tetrahydrate Thermofisher C109
Collagenase Sigma-Aldrich C0130
GABA Sigma-Aldrich A2129
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) Thermofisher BP310
Kainic acid Tocris 0222
Magnesium sulfate heptahydrate Thermofisher M63
Potassium chloride Thermofisher P217
Sodium bicarbonate Thermofisher S233
Sodium chloride Thermofisher S271-1
Ultrafree-0.1 µm MC filter, Amicon

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References

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Neurosciences numéro 185
Microtransplantation de membranes synaptiques pour réactiver les récepteurs synaptiques humains pour les études fonctionnelles
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Miller, B., Powell, A., Gutierrez,… More

Miller, B., Powell, A., Gutierrez, B. A., Limon, A. Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies. J. Vis. Exp. (185), e64024, doi:10.3791/64024 (2022).

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