Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Mikrotransplantation av synaptiska membran för att återaktivera humana synaptiska receptorer för funktionella studier

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/64024
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1The Mitchell Center for Neurodegenerative Diseases, Department of Neurology, University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

Summary

Protokollet visar att genom att utföra mikrotransplantation av synaptiska membran i Xenopus laevis-oocyter är det möjligt att registrera konsekventa och tillförlitliga svar av α-amino-3-hydroxi-5-metyl-4-isoxazolpropionsyra och γ-aminosmörsyrareceptorer.

Abstract

Excitatoriska och hämmande jonotropa receptorer är de viktigaste portarna av jonflöden som bestämmer synapsernas aktivitet under fysiologisk neuronal kommunikation. Därför har förändringar i deras överflöd, funktion och relationer med andra synaptiska element observerats som ett viktigt korrelat av förändringar i hjärnfunktion och kognitiv försämring vid neurodegenerativa sjukdomar och psykiska störningar. Att förstå hur funktionen hos excitatoriska och hämmande synaptiska receptorer förändras av sjukdom är av avgörande betydelse för utvecklingen av effektiva terapier. För att få sjukdomsrelevant information är det viktigt att registrera den elektriska aktiviteten hos neurotransmittorreceptorer som förblir funktionella i den sjuka mänskliga hjärnan. Hittills är detta det närmaste tillvägagångssättet för att bedöma patologiska förändringar i receptorernas funktion. I detta arbete presenteras en metod för att utföra mikrotransplantation av synaptiska membran, som består av att återaktivera synaptiska membran från snapfryst mänsklig hjärnvävnad innehållande humana receptorer, genom dess injektion och bakre fusion i membranet av Xenopus laevis-oocyter . Protokollet tillhandahåller också den metodologiska strategin för att erhålla konsekventa och tillförlitliga svar av α-amino-3-hydroxi-5-metyl-4-isoxazolpropionsyra (AMPA) och γ-aminosmörsyra (GABA) receptorer, samt nya detaljerade metoder som används för normalisering och rigorös dataanalys.

Introduction

Neurodegenerativa störningar påverkar en stor andel av befolkningen. Även om deras förödande konsekvenser är välkända, är kopplingen mellan de funktionella förändringarna av neurotransmittorreceptorer, som är kritiska för hjärnfunktionen, och deras symptomatologi fortfarande dåligt förstådd. Interindividuell variabilitet, sjukdomens kroniska natur och lömsk debut av symtom är bara några av orsakerna som har försenat förståelsen av de många hjärnsjukdomar där kemiska obalanser är väl dokumenterade 1,2. Djurmodeller har genererat ovärderlig information och utökat vår kunskap om mekanismerna bakom fysiologi och patofysiologi i evolutionära bevarade system; emellertid utesluter flera skillnader mellan arter mellan gnagare och människor direkt extrapolering av receptorfunktionen från djurmodeller till den mänskliga hjärnan3. Således utvecklades initiala ansträngningar för att studera inhemska mänskliga receptorer av Ricardo Miledis laboratorium med kirurgiskt borttagen vävnad och frysta prover. Dessa initiala experiment använde hela membran som inkluderar neuronala synaptiska och extra synaptiska receptorer såväl som icke-neuronala neurotransmittorreceptorer, och även om de ger viktig information om sjuka tillstånd, finns det en oro för att blandningen av receptorer komplicerar tolkningen av data 4,5,6,7. Viktigt är att synapser är det viktigaste målet i många neurodegenerativa störningar 8,9; Därför är analyser för att testa de funktionella egenskaperna hos drabbade synapser grundläggande för att få information om sjukdomsrelevanta förändringar som påverkar synaptisk kommunikation. Här beskrivs en modifiering av den ursprungliga metoden: mikrotransplantation av synaptiska membran (MSM), som fokuserar på den fysiologiska karakteriseringen av berikade synaptiska proteinpreparat och har framgångsrikt tillämpats för att studera råtta och humana synaptosomer 10,11,12,13,14,15 . Med denna metod är det möjligt att transplantera synaptiska receptorer som en gång arbetade i den mänskliga hjärnan, inbäddade i sina egna inhemska lipider och med sin egen kohort av associerade proteiner. Eftersom MSM-data är kvantitativa är det dessutom möjligt att använda dessa data för att integrera med stora proteomiska eller sekvenseringsdatauppsättningar10.

Det är viktigt att notera att många farmakologiska och biofysiska analyser av synaptiska receptorer görs på rekombinanta proteiner 16,17. Även om detta tillvägagångssätt ger bättre inblick i struktur-funktion relationer av receptorer, det kan inte ge information om komplexa multimera receptorkomplex som finns i nervceller och deras förändringar i sjukdom. Därför bör en kombination av inhemska och rekombinanta proteiner ge en mer omfattande analys av synaptiska receptorer.

Det finns många metoder för att förbereda synaptosomer 10,11,12,13,14,15 som kan justeras för kraven i ett laboratorium. Protokollet börjar med antagandet att synaptosomala berikade preparat isolerades och är redo att bearbetas för mikrotransplantationsexperiment. I labbet används Syn-Per-metoden enligt tillverkarens instruktioner. Detta görs på grund av hög reproducerbarhet i elektrofysiologiska experiment 10,11. Det finns också riklig litteratur som förklarar hur man isolerar Xenopus-oocyter 18,19, som också kan köpas redo för injektion20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

All forskning utförs i enlighet med institutionella riktlinjer och godkänns av den institutionella djurvårds- och användningskommittén vid University of California Irvine (IACUC-1998-1388) och University of Texas Medical Branch (IACUC-1803024). Temporal cortex från en icke-Alzheimers sjukdom (AD) hjärna (kvinna, 74 år, postmortemintervall 2,8 h) och en AD-hjärna (kvinna, 74 år, intervall efter döden 4,5 h) tillhandahölls av University of California Irvine Alzheimers sjukdom forskningscenter (UCI-ADRC). Informerat samtycke till hjärndonation erhölls av UCI-ADRC.

OBS: Ofixerad mänsklig hjärnvävnad bör behandlas som en källa till blodburna patogener (BBP). Följaktligen behövs BBP-utbildning före start av experiment. Detta protokoll utförs i ett biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) laboratorium enligt BSL2-krav. Riktlinjer och försiktighetsåtgärder inom laboratoriet inkluderar: ingen mat eller dryck tillåten i laboratoriet, god laboratoriepraxis måste följas, personlig skyddsutrustning (handskar, klänning, inga öppna skor) krävs och dörren måste alltid stängas.

1. Xenopus oocyt mikroinjektion beredning

  1. För att göra injektionsnålar, dra 3,5 tum borosilikatrör med en mikropipettdragare. När mikroinjektionsnålarna har dragits, använd ett mikroskop och ett rakblad för att skära av tillräckligt med nålspetsen så att mikroinjektion kan utföras (vanligtvis mellan 2-3 mm).
    OBS: Längden på nålens spets att skära kan variera.
  2. Förbered 1x Barths lösning genom att tillsätta 200 ml Barths stamlösning (5x) till 800 ml destillerat vatten. Fyll en 24-brunns, platt botten vävnadsodlingsplatta med 18 ° C 1x Barths lösning.
    1. Förbered 5x Barths lagerlösning enligt följande. Tillsätt 25,71 g NaCl (natriumklorid), 0,372 g KCl (kaliumklorid), 0,301 gCaCl2 (kalciumdiklorid), 0,389 g Ca(NO3)2(4H2O) (kalciumnitrattetrahydrat), 1,01 gMgSO4(7H2O) (magnesiumsulfatheptahydrat), 1,08 gNaHCO3 (natriumbikarbonat) i 1 liter destillerat vatten. och 11,91 g HEPES (4-(2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyra).
  3. Isolera Xenopus-oocyter med hjälp av de protokoll som beskrivs i 18,19 och med 2x förstorat stereoskop, välja friska, stadium V-VI-oocyter. Placera cirka 10 oocyter per brunn och använd en av brunnarna för att hysa icke-injicerade oocyter som ska användas som kontrollceller vid registreringar.
  4. Hämta en liten petriskål, 1 cm lång och 6 cm i diameter, och placera nylonnät inuti så att det täcker botten av skålen. Häll sedan 15 ml 1x Barths lösning som ska användas för att utföra mikroinjektioner av oocyterna.
  5. Placera en nanoinjektor längs mikroskopplattformens mittlinje. Vrid magneten till av-läge och flytta långsamt nanoinjektorn till önskat läge medan du stöder den försiktigt. När nanoinjektorn är korrekt placerad, vrid magneten tillbaka till helt på-läge och se till att den är säker.
  6. För en provstorlek på 50,6 nL, använd följande inställningar på sidan av nanoinjektorn: 1 är D (ner), 2 är D, 3 är U (upp), 4 är D och 5 är U. Placera en bit självtätande termoplast eller mikrocentrifugrörslock på mikroskopstativet och justera det med nanoinjektorns bana.
    OBS: 50 nL är nära den maximala mängden injicerat material som cytoplasman tål21.
  7. Fyll en insulinspruta ungefär hälften av volymen med mineralolja (ca 0,5 ml/cc). Använd denna spruta och fyll mikroinjektionsnålen med mineralolja. Se till att en synlig oljepärla syns vid nålspetsen.
  8. Utsätt nanoinjektorkolven till minst 1-2 cm. Gör detta genom att hålla ner EMPTY-knappen tills kolven är synlig i önskad längd. När kolven är exponerad placerar du långsamt och försiktigt den mineraloljefyllda mikroinjektionsglasnålen på nanoinjektorkolven och ser till att den passar bra genom den svarta motstånds-O-ringen och stannar vid den vita motståndsringen. Se till att inte böja nanoinjektorkolven i processen.
  9. När mikroinjektionsglasnålen är säker och på plats trycker du på EMPTY för att tömma eventuella luftbubblor. Rengör försiktigt överskottet av mineralolja med en pappersnäsduk.

2. Laddar provet

  1. Bered synaptosomala berikade preparat (prover) från den humana hjärnregionen av intresse enligt beskrivningen i 10,11,12,13,14,15 och förvara dem i alikvoter om ca 5 μl vid -80 °C fram till injektionsögonblicket.
  2. Före injektion, överför alikvoten till våt is och håll den på is hela tiden förutom ultraljudsbehandling och hämtning. Antalet och typerna av prover kommer att bestämmas av den experimentella designen.
  3. Ultraljudsprov de valda proverna 3x i ett bad med flytande våt is för att undvika uppvärmning av provet. Använd 5 s cykler varje gång och vänta 1 min på våt is mellan cyklerna.
  4. Placera 1 μl prov på termoplasten. Gör en indragning i ytan, om det behövs, före provtagningen för att förhindra att provet rör sig.
  5. Använd vreden på manipulatorn som håller nanoinjektorn för att placera nålen och flytta den mot provet som ska fyllas. När nålspetsen är i provet, tryck och håll ned FILL-knappen tills tillräckligt med prov har tagits upp. Cirka 0,5 μl krävs för 10 oocyter. Använd vreden och flytta nanoinjektorns nål tillbaka till det högsta läget.

3. Injicera oocyterna

OBS: Standardiserade synaptosomala membran i råttbarken injiceras också i alla experiment i en uppsättning oocyter för att mäta förändringar i fusionskapacitet mellan olika satser av oocyter.

  1. Placera utvalda oocyter på den lilla petriskålen som har det monterade nylonnätet och Barths lösning (cirka 10 oocyter). Ordna oocyter så att de inte ligger ovanpå varandra; Detta kommer att vara till hjälp under injektionsprocessen.
  2. Använd vreden på manipulatorn som håller nanoinjektorn och flytta nålen mot oocyterna. När nålen är nedsänkt i Barths lösning, använd fotpedalen för nanoinjektorn för att se till att mikroinjektionsnålen släpper provet. Om provet släpps kommer det att synas från mikroskopvyn.
  3. När det är säkert fastställt att provet släpps, gå vidare till mikroinjektion av äggcellen. Om provet inte släpps, upprepa processen att fylla nålen.
  4. Penetrera äggcellen precis under ytan med nålen, inte djupare, och använd fotpedalen för att injicera provet. Fotpedalen ger ett pipljud när provet släpps. Vänta ca 2-3 s. Om injektionen lyckades kommer cellen att expandera. När detta händer, använd vreden på manipulatorn för att lämna cellen.
    OBS: Fusion av membran i äggcellen är en polariserad process; Därför bör äggcellen injiceras i djursidan av cellen, helst ovanför ekvatorn, med nålens vinkel mot djursidan för att maximera membranfusionen.
  5. Flytta petriskålen så att nästa äggcell är i linje med nålen och upprepa processen tills alla oocyter i skålen har injicerats. Upprepa denna process tills önskat antal oocyter har injicerats. Se till att en brunn av oocyter lämnas icke-injicerad för att användas som kontroll.
  6. När alla oocyter har injicerats, dra tillbaka nanoinjektorn till sitt ursprungliga läge och ta bort nålen.

4. Inspelning av jonströmmar med hjälp av en tvåelektrodspänningsklämma

  1. För att göra två elektrodspänningsklämma (TEVC) elektrodnålar, dra 15 cm långa brandpolerade borosilikatglasrör med hjälp av mikropipettdragaren. När dragningen är klar fyller du med 3 M KCl med långa kapillärnålar, alternativt sänker du ner och kokar nålarna i 3 M KCl-lösning i 15 minuter under ett kontinuerligt vakuum. Den höga temperaturen hjälper till att fylla elektroderna och avlägsna luftbubblor.
    1. Förbered en 3 M KCl elektrodfyllningslösning genom att använda KCl i kristallin form och avjoniserat vatten och följ dessa steg noggrant så att elektrodernas referenspotential inte ändras. Torka KCl försiktigt i ugn i 2-3 h. Väg försiktigt 223,68 g KCl. Använd en analysbalans och Överför KCl till en 1 L glasflaska. Använd denna lösning för att klorera silverelektrodtrådar.
      OBS: För att dra glaselektroder kan pipettkokboken laddas ner här: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf.
  2. Slå på all utrustning som används för inspelning av jonströmmar: huvudsystem, lösningsventiler, mikroskopljus, ventilsystem, oocytklämma och vakuumsystem. Slå på den stationära datorn, logga in på WinEDR V3.9.1. och se till att programmet körs och att inställningsvärdena är korrekta enligt följande: spela in på disk, ställ in inspelningstid och rensa simulatoralternativet.
    1. Ange följande initiala inställningsvärden för förstärkaren: för spänningselektrodsektionen (Vm), stäng av den negativa kapacitetskompensationen (-C); för badelektrodsektionen (Im), ställ in förstärkningsväljaren (intervall från 0,1 till 10) på 10 och vippomkopplaren med tre lägen som väljer förstärkningsmultiplikatorn (x0,1, x1,0 och x10) vid x1,0. LED-lamporna indikerar valet av förstärkningsmultiplikator; för klämsektion, stäng av klämlägesväljaren, ställ in DC-förstärkningskontrollen på IN och förstärkningskontrollen med full bandbredd öppen slinga (intervall 0 till 2000) till cirka 1200; för kommandon, ställ in på 40mV och ställ in hållkontrollerna negativa och skala multiplikator för att vara i x2; för strömelektrod, använd Ve-förskjutningen för att upprätta en nollreferens innan du spetsar äggcellen.
    2. För att spela in, öppna WinEDR V3.9.1-programvaran, gå till toppmenyn och välj Arkiv > Öppna ny fil. Skapa din egen mapp och spara filen.
    3. Välj sedan Spela in > Spela in på disk i huvudmenyn. När de två elektroderna är inuti ooctyten, slå på ringsignalen i VC-8-ventilregulatorn och vrid klämman till Långsam i OC-725C-förstärkaren. Gå sedan tillbaka till WinEDR-programvaran och välj Spela in längst upp till vänster på skärmen.
    4. I markeringsdiagrammet längst ner till vänster skriver du ner din ursprungliga membranpotential och trycker på Enter. När experimentet fortsätter kan du skriva ner namnet på de läkemedel som används. När experimentet är över väljer du Stoppa längst upp till vänster på skärmen.
      OBS: Vi använder WinEDR- eller WinWCP-programvara för att utföra TEVC eftersom dessa är gratis och väl lämpade för experiment, men all annan programvara som är tillgänglig kan användas.
  3. Gör upp alla läkemedelslösningar som behövs för att utföra experimentet (t.ex. GABA, Kainate) och bekräfta att lösningsventilerna fungerar korrekt genom att slå på och av dem och observera förskjutningen av klämventilerna.
  4. Fyll rören genom att hälla motsvarande lösning på sprutbehållaren som är ansluten till röret och märk ventilregulatorn för att korrelera med lösningsrören. Se till att lösningsflödet är stabilt, att det inte finns några bubblor och att vakuumsystemet fungerar korrekt.
  5. Ställ in mikroskopet och inspelningskammaren. Placera agarbroarna (se nedan) i respektive cirkulära hål bakom inspelningskammaren (distal från hanteringsområdet), anslut brunnarna för elektroderna som används som jordreferens och inspelningskammaren. Lägg till Ringers arbetslösning (1x) i inspelningskammaren och jordreferenselektrodbrunnarna.
    1. Agarbroar är U-formade borosilikatrör, 2-3 cm långa, fyllda med 3% agar i Ringers lösning. Gör U-formade rör genom att skära 15 cm långa rör, böja dem på öppen eld och sedan fylla dem med varm 3% agar med en insulinspruta. Förvara fyllda agarbroar i Ringers lösning i kylen tills de används.
    2. Gör 20x Ringers stamlösning enligt följande: Tillsätt 134,4 g NaCl, 2,982 g KCl, 5,29 gCaCl2 och 23,83 g HEPES (4-(2-hydroxietyl)-1-piperazineetansulfonsyra i 1 liter destillerat vatten. För 1x Ringers arbetslösning, i en mätkolv, tillsätt 200 ml av Ringers stamlösning (20x) till 3 800 ml destillerat vatten.
  6. Förbered klorerade silverelektroder före varje experiment genom elektrolys genom att placera silvertrådar i 3 M KCl-lösning och ansluta silverelektroden till den positiva terminalen på ett 9 V-batteri. Efter ca 3 min avsätts ett fast brunt lager agcl i elektroden. Placera de klorerade silverelektrodtrådarna i elektrodhuset.
    OBS: Markreferens och registrering av klorerade elektroder är silver/ silverkloridelektroder (Ag / AgCl).
  7. Ta bort borosilikatnålarna från KCl-lösningen. Använd en spruta för att extrahera en liten mängd KCl-lösning från den öppna änden av elektrodnålen och ersätt KCl-lösningen med mineralolja; Detta kommer att undvika vattenavdunstning och förändringar i KCl-koncentrationen i nålen. Skjut glasnålen över den klorerade silverelektrodtråden och dra åt dem på plats.
  8. Använd höger och vänster manipulatorer som håller elektroderna och styr elektrodnålarna in i inspelningskammaren som är fylld med Ringers lösning.
  9. Kontrollera motståndet för varje elektrod genom att nollställa Vm- och Ve-förskjutningsknapparna och sedan trycka på elektrodtestknapparna . Motståndet bör vara mellan 0,5-3 MΩ (direkt läst som 5-30 mV i skärmen). Om motståndet ligger utanför intervallet, byt ut med nya mikroelektroder.
  10. Fyll inspelningskammaren med ny Ringers lösning. Använd en glaspipett och placera en icke-injicerad eller en mikrotransplanterad oocyt i mitten av inspelningskammaren. Se till att äggcellen är väl synlig under mikroskopet, med djursidan uppåt (se ANMÄRKNING i steg 3.4).
  11. Led elektroden in i Ringers lösning tills de vidrör äggcellsmembranet. Genomborra försiktigt äggcellsmembranet på djursidan (se ANMÄRKNING i steg 3.4) med båda elektroderna och registrera vilomembranets potential. Aktivera Ringers lösningsflöde.
  12. Använd oocytklämförstärkaren, ändra läget till Spänningsklämma och ställ in hållspänningen på -80 mV. Strömmen på bildskärmen bör vara negativ, vanligtvis mellan 0 och 0,4 mikroampere.
  13. Skapa en ny fil för att spara inspelningen som Fil > Ny > Spara inspelningen på programvaran. Börja spela in, tryck på Spela in > Spela in på disk. Lägg till relevant information i filen med hjälp av dialogrutan markera rutan (testnamn, använda läkemedel osv.).
  14. Applicera agonister (t.ex. GABA, glutamat eller kainat) för kemisk stimulering genom att öppna ventilerna och perfusera dem i inspelningskammaren i 15 s. Använd vanligtvis en förstärkning på 10x för att plotta det maximala antalet punkter och rekonstruera svaret. Om strömmarna är mycket små, öka förstärkningen, eller förstärkningen, för att de ska kunna utvärderas och synas. Notera alltid dessa ändringar.
    OBS: Varaktigheten av perfusionen beror på det experimentella paradigmet. Om det huvudsakliga målet är att mäta maximal amplitud räcker det med 15 s för att nå toppen för GABA eller platån för kainate.
  15. Övervaka alltid lösningsnivåer. Ringers lösning måste fyllas på ofta eftersom den används mellan alla lösningsanvändningar. När inspelningen är klar vrider du spänningsklämman till OFF-läge och stänger av ringerens lösningsventil. Ta bort äggcellen. Stoppa inspelningen och spara filen. Upprepa dessa steg för alla injicerade oocyter.

5. Analysera TEVC-inspelningar

  1. Spara en kopia av inspelningarna på en USB-enhet. Därifrån öppnar du önskad fil som ska analyseras. I filen som öppnas kan inspelningen visas, markeras och mätas. Den vanligaste analysen inkluderar mätning av maximal amplitud, aktiveringstid, desensibilisering och genomgång av repetitiva applikationer.
  2. Mät ampa-maximala svar och GABA-toppsvaret. För att hämta dessa mätningar, upprätta först en nollnivå eller baslinje genom att hitta den röda linjen med markören och dra den till strömmen som genereras av Ringer-applikationen eller baslinjen.
  3. När nollnivån har fastställts bestämmer du svarsmätningarna genom att använda musen för att dra den gröna, vertikala avläsningsmarkören till önskad del av grafspåraren. Om så önskas exporterar du spåren som ska analyseras i någon annan föredragen programvara
    Obs: Om nollnivån inte kan definieras eller om det finns för mycket brus som anges på spåraren, exportera WinEDR-filen till en offline analytisk programvara, som möjliggör ändringar för att ge en nivåbaslinje och tillägg av filter för att minska bruset.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Inom några timmar efter injektionen börjar de synaptiska membranen, som bär sina neurotransmittorreceptorer och jonkanaler, smälta samman med oocytplasmamembranet. Figur 1 visar inspelningar av AMPA- och GABAA-receptorer mikrotransplanterade till Xenopus-oocyter. För större delen av analysen mättes svaren från två eller tre oocyter per prov, med användning av två eller tre satser oocyter från olika grodor, för totalt sex till nio oocyter per prov. Detta görs för att en stor kohort av mänskliga ämnen ska observera gruppskillnader. Analysen är enkel och mäter amplituden av svar. Det är viktigt att notera att fusionen av de transplanterade membranen är en polariserad process, så valet av injektionsstället är mycket viktigt. Injektion i vegetabilisk halvklot eller i ekvatorn ger konsekventa resultat, med alla injicerade oocyter som framgångsrikt sätter in receptorer och genererar jonströmmar som följer en unimodal fördelning22. Intressant nog, när membranen ursprungligen injicerades i djurpolen, följde äggcellsvaren en bimodal fördelning: en grupp oocyter hade inga eller mycket låga svar medan den andra gruppen hade stora svar, ännu större än de från oocyter som injicerades i vegetabilisk pol eller i ekvatorn. För att avgöra om några av de oocyter som injicerades i djurpolen hade låga svar eftersom de mänskliga membranen injicerades och fångades i oocytens kärna, injicerades en blandning av membran isolerade från det elektriska organet i Torpedo och cDNA-kodning för GABAρ1-underenheten i stången på djursidan. Nikotinreceptorerna från Torpedomembranen visade en snabb aktivering och snabb desensibilisering under perfusion av acetylkolin23, medan ρ1-underenheten bildar homomera GABAρ1-receptorer som inte desensibiliserar under kontinuerlig perfusion av GABA 24,25,26,27. Om det saminjicerade provet av misstag levererades in i kärnan och inte cytoplasman, skulle cDNA transkriberas till RNA och översättas till funktionella GABAρ1-receptorer. Figur 2 visar att när injektionen riktades mot kärnan uttryckte oocyter med höga svar på acetylkolin inte GABAρ1-receptorer; omvänt uttryckte oocyter med noll eller lågt svar på acetylkolin GABA-receptorer. Resultaten av detta experiment indikerar för det första att i oocyter med låg respons deponerades membran av misstag i oocytens kärna; för det andra stör injektionen av torpedmembran i kärnan inte mycket med transkriptionen av ρ1 cDNA. Några saminjicerade oocyter hade stora svar på både acetylkolin och GABA, vilket tyder på bristning av kärnan under injektionen. Den förbättrade införandet av transplanterade membran i äggcellens djurhalva speglar den polariserade lokaliseringen av de heterologt uttryckta neurotransmittorreceptorerna 26,28. Därför, genom att injicera i djurhalvan utan att rikta in kärnan, är det möjligt att få större svar. Detta är viktigt för att studera prover med låg densitet av receptorer, till exempel från Alzheimers sjukdom (AD) vävnad med lågt antal receptorer (Figur 3).

Figure 1
Figur 1: Representativa jonströmmar av oocyter. Jonströmmar från oocyter injicerade med membran från humana synaptiska receptorer registrerades. AMPA-receptorer aktiverades med 100 mM Kainate, och GABAA-receptorer med 1 mM GABA. VH = -80 mV. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Samtidig injektion av Torpedo och GABAρ1. Samtidig injektion av filtrerade membran (0,1 μm) från torpedens elektriska organ, rik på acetylkolinreceptorer, och cDNA-kodning för GABAρ1-receptorn i djurpolen producerade huvudsakligen två grupper av oocyter baserat på deras svar: en grupp oocyter (A) hade stora svar på acetylkolin (Ach; 1 mM) men inga svar på 1 μM GABA (spänning fastklämd till -80 mV), och oocyter i grupp (B) hade noll eller låga svar på ACh men stora svar på GABA. (C) Diagrammet visar medelvärdet ± medelvärdet av medelvärdet (SEM) av toppströmmen i grupp 1 (n = 5 oocyter) och grupp 2 (n = 11 oocyter). En oocyt i grupp 2 hade stora GABA- och ACh-svar som tyder på bristning av kärnan; följaktligen var fördelningen av svaren skev till låga värden, vilket noterades av skillnaden mellan medelvärde och median för fördelningen av membranström (22 nA vs 6 nA). Detta resultat indikerar att en av orsakerna till oocyter med lågt svar är att membranen injiceras och fångas in i oocytens kärna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Polariserad insättning av cellmembran i Xenopus-oocyter . GABA- och kainatsvar av oocyter injicerade i djuret eller vegetabiliska poler, med ofiltrerade membran erhållna från en icke-AD-hjärna (kvinnlig, 74 år gammal, postmortemintervall 2,8 h) och en AD-hjärna (kvinna, 74 år, postmortemintervall 4,5 h). Oocyter injicerade nära djurpolen, utan att rikta in sig på kärnan, gav större svar än oocyter injicerade i vegetalpolen, vilket möjliggjorde studier av vävnadsprover med mycket lågt antal receptorer. Elevens t-test mellan vegetal- och djurpoler: ** p < 0,01, *** p < 0,001, Staplar indikerar medelvärde ± SEM av toppström, n = 5 oocyter varje kolumn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Analys av inhemska proteinkomplex från mänskliga hjärnor behövs för att förstå homeostatiska och patologiska processer vid hjärnsjukdomar och utveckla terapeutiska strategier för att förebygga eller behandla sjukdomar. Således är hjärnbanker som innehåller snapfrysta prover en ovärderlig källa till en stor och mestadels outnyttjad mängd fysiologisk information29,30. Ett första problem med att använda postmortemvävnad är den tydliga möjligheten till mRNA- eller proteinnedbrytning som kan förvirra tolkningen av data. Till exempel visar hjärnans pH konsekvent en positiv korrelation med kvantifieringen av mRNA genom kvantitativ realtid-PCR, och denna korrelation är oberoende av patologin31. Skillnader mellan ämnen i pH kan leda till skillnader i mRNA-kvantifiering med stora varianser som kan dölja tolkningen av resultat32. Intressant nog, trots den lägre kvantifieringen av mRNA-transkript när pH-värdet surgörs, upprätthålls kovarianserna mellan de olika transkripten33, vilket ger en ram för att erhålla tillförlitlig transkriptomprofilering av patologiska tillstånd. Viktigt är att medan mRNA är mycket nedbrytbart, är transmembranproteiner i postmortemvävnaden mycket resistenta mot nedbrytning34. Tidigare experiment i labbet har visat att GABA- och glutamatreceptorer i den mänskliga hjärnan är funktionella efter extremt stora postmortemintervall35. Dessutom tillåter MSM-metoden att direkt mäta effekterna av potentiella förvirrande faktorer som pH vid dödsögonblick, agonaltillstånd och mRNA- och proteinnedbrytning direkt på receptorernas funktion, vilket ger sätt att använda denna information i analys och tolkning av data.

Modifieringar och felsökning av tekniken
Som nämnts tidigare är MSM en liten modifiering av den ursprungliga transplantationen av totala membran, vilket är en metod som har validerats och bekräftats i stor utsträckning av många laboratorier inom akademiker och läkemedelsindustrin 12,36,37,38,39,40. Till exempel var mikrotransplantation av receptorer viktig i utvecklingen av Eli Lillys LY3130481, som är en TARP gamma-8-selektiv antagonist av AMPA-receptorer som visar hjärnregionens selektivitet12. MSM följer samma mikrotransplantationsprincip med synaptosomala berikade preparat; därför är det viktigt att ha bra synaptosomala preparat. Vi använder Syn-Per-metoden eftersom resultaten som erhålls med denna procedur är mycket konsekventa och jonströmmarnas amplitud korrelerar mycket bra med nivåerna av synaptiska proteiner i proteomiska experiment10. Mikrotransplantationen eller MSM kan dock anpassas för att studera receptorer från många källor (t.ex. insektsmembran38,39, neurolemma40) med utmärkta resultat. Det finns vissa sjukdomar där synapser påverkas starkt som Alzheimers sjukdom, eller finns i låga mängder; i detta fall hjälper injektion av membranen i djursidan att få större strömmar. Att öka mängden protein som injiceras ökar också fusionen av membran och storleken på svaren. Även om det finns en negativ korrelation mellan koncentrationen av injicerade membran och överlevnaden av oocyter, är det möjligt att hitta en lämplig koncentration av membran som möjliggör den givna experimentella analysen.

Begränsningar av MSM
MSM är en kvantitativ metod som utvecklades för studier av mänskliga receptorer eller jonkanaler; därför är den väl lämpad att studera vävnad med begränsad tillgänglighet. Eftersom Xenopus-oocyter inte har endogena glutamat- eller GABA-receptorer kommer något svar på GABA eller glutamat i mikrotransplanterade oocyter från de injicerade receptorerna som smälte samman med oocyternas membran. En viktig begränsning av MSM är dock studien av jonkanaler eller transportörer som också uttrycks endogent i oocyter, eftersom separationen av jonströmmar från mikrotransplanterade och endogena kanaler / transportörer är svår. Framtida studier som tystar endogena gener kan vara till hjälp med denna begränsning.

Betydelsen för befintliga metoder är att MSM införlivar det ursprungliga membranet med dess motsvarande proteiner och receptorer, och därmed ger en mer fysiologisk miljö för analysen. Det har visat sig att egenskaperna hos receptorerna i deras ursprungliga membran behålls efter transplantation till oocyterna, vilket observerats i neurotransmittorreceptorer AMPA-typ GluR1, α7-AcChoRs och α4β2-AcChoRs från odlade celler41.

Framtida tillämpningar av tekniken inkluderar studier av de elektrofysiologiska egenskaperna hos olika proteiner och receptorer av intresse för membran hos odlade och icke-odlade celler och vävnader från friska och sjuka mänskliga hjärnor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NIA/NIH-bidrag R01AG070255 och R01AG073133 till AL. Vi tackar också University of California Irvine Alzheimers sjukdom research center (UCI-ADRC) för att ha tillhandahållit den mänskliga vävnaden som visas i detta manuskript. UCI-ADRC finansieras av NIH/NIA-bidrag P30 AG066519.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For Microinjection
3.5" Glass Capillaries Drummond 3-000-203-G/X
24 well, flat bottom Tissue Culture Plate Thermofisher FB012929
Flaming/Brown type micropipette puller Sutter P-1000
Injection Dish Thermofisher 08-772B
Microcentrifuge Tubes Thermofisher 02-682-002
Mineral Oil Thermofisher O121-1
Nanoject II Drummond 3-000-204
Nylon mesh Industrial Netting WN0800
Parafilm Thermofisher S37440
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Syringe Thermofisher 14-841-31
Ultrasonic cleaning bath Thermofisher FS20D
Xenopus laevis frogs Xenopus 1 4217
For Two Electrode Voltage clamp
15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries Sutter B200-116-15
Any PC computer or laptop
Low-pass Bessel Filter Warner Instruments LPF-8
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Two electrode voltage clamp workstation Warner Instruments TEV-700
ValveLink 8.2 Perfusion Controller Automate Scientific SKU:01-18
WInEDR Free software University of Strathclyde Glasgow https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
X Series Multifunction DAQ National Instruments NI USB-6341
Reagents
Calcium dichloride Thermofisher C79
Calcium nitrate tetrahydrate Thermofisher C109
Collagenase Sigma-Aldrich C0130
GABA Sigma-Aldrich A2129
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) Thermofisher BP310
Kainic acid Tocris 0222
Magnesium sulfate heptahydrate Thermofisher M63
Potassium chloride Thermofisher P217
Sodium bicarbonate Thermofisher S233
Sodium chloride Thermofisher S271-1
Ultrafree-0.1 µm MC filter, Amicon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furcila, D., Defelipe, J., Alonso-Nanclares, L. A study of amyloid-β and phosphotau in plaques and neurons in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Journal of Alzheimer's Disease. 64 (2), 417-435 (2018).
  2. Varol, E., Sotiras, A., Davatzikos, C. HYDRA: revealing Heterogeneity of imaging and genetic patterns through a multiple max-margin discriminative analysis framework. Neuroimaje. 145, 346-364 (2017).
  3. Hodge, R. vD., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
  4. Wu, J., et al. GABAA receptor-mediated excitation in dissociated neurons from human hypothalamic hamartomas. Experimental Neurology. 213 (2), 397-404 (2008).
  5. Miledi, R., Eusebi, F., Martínez-Torres, A., Palma, E., Trettel, F. Expression of functional neurotransmitter receptors in Xenopus oocytes after injection of human brain membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 13238-13242 (2002).
  6. Zwart, R., Mazzo, F., Sher, E. Microtransplantation of human brain receptors into oocytes to tackle key questions in drug discovery. Drug Discovery Today. 24 (2), 533-543 (2019).
  7. Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Miledi, R. Microtransplantation of neurotransmitter receptors from postmortem autistic brains to Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10973-10977 (2008).
  8. Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
  9. Taoufik, E., Kouroupi, G., Zygogianni, O., Matsas, R. Synaptic dysfunction in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases: An overview of induced pluripotent stem-cell-based disease models. Open Biology. 8 (9), 180138 (2018).
  10. Zeppillo, T., et al. Functional impairment of cortical AMPA receptors in schizophrenia. Schizophrenia Research. , (2020).
  11. Lauterborn, J. C., et al. Increased excitatory to inhibitory synaptic ratio in parietal cortex samples from individuals with Alzheimer's disease. Nature Communications. 12 (1), 2603 (2021).
  12. Mazzo, F., et al. Reconstitution of synaptic Ion channels from rodent and human brain in Xenopus oocytes: a biochemical and electrophysiological characterization. Journal of Neurochemistry. 138 (3), 384-396 (2016).
  13. Sanna, E., et al. Expression of native GABA(A) receptors in Xenopus oocytes injected with rat brain synaptosomes. Journal of Neurochemistry. 67 (5), 2212-2214 (1996).
  14. Sanna, E., et al. Functional changes in rat nigral GABA(A) receptors induced by degeneration of the striatonigral GABAergic pathway: An electrophysiological study of receptors incorporated into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 70 (6), 2539-2544 (1998).
  15. Sandoval, M., et al. Antagonistic effects of TrkB and p75NTR on NMDA receptor currents in post-synaptic densities transplanted into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 101 (6), 1672-1684 (2007).
  16. Perrais, D., Pinheiro, P. S., Jane, D. E., Mulle, C. Antagonism of recombinant and native GluK3-containing kainate receptors. Neuropharmacology. 56 (1), 131-140 (2009).
  17. Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364 (6438), 355-362 (2019).
  18. Bröer, S. Xenopus laevis Oocytes. Membrane Transporters in Drug Discovery and Development: Methods and Protocols. , 295-310 (2010).
  19. Newman, K., Aguero, T., King, M. Lou Isolation of xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (2), 86-91 (2018).
  20. Lin-Moshier, Y., Marchant, J. S. The Xenopus oocyte: A single-cell model for studying Ca2+ signaling. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (3), 185-191 (2013).
  21. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Microinjection of Xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
  22. Eusebi, F., Palma, E., Amici, M., Miledi, R. Microtransplantation of ligand-gated receptor-channels from fresh or frozen nervous tissue into Xenopus oocytes: A potent tool for expanding functional information. Progress in Neurobiology. 88 (1), 32-40 (2009).
  23. Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 5224-5228 (1995).
  24. Cutting, G. R., et al. Cloning of the γ-aminobutyric acid (GABA) ρ1 cDNA: A GABA receptor subunit highly expressed in the retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (7), 2673-2677 (1991).
  25. Calvo, D. J., Vazquez, A. E., Miledi, R. Cationic modulation of ρ1-type γ-aminobutyrate receptors expressed in Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 12725-12729 (1994).
  26. Martínez-Torres, A., Miledi, R. Expression of γ-aminobutyric acid ρ1 and ρ1Δ450 as gene fusions with the green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 1947-1951 (2001).
  27. Ochoa-De La Paz, L. D., Estrada-Mondragón, A., Limón, A., Miledi, R., Martínez-Torres, A. Dopamine and serotonin modulate human GABAρ1 receptors expressed in Xenopus laevis oocytes. ACS Chemical Neuroscience. 3 (2), 96-104 (2012).
  28. Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Eusebi, F., Miledi, R. Properties of GluR3 receptors tagged with GFP at the amino or carboxyl terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (39), 15526-15530 (2007).
  29. C, S. N. A Rosetta stone for analysis of human membrane protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10641-10642 (2008).
  30. Eleonora, P., et al. GABAA-current rundown of temporal lobe epilepsy is associated with repetitive activation of GABAA "phasic" receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (52), 20944-20948 (2007).
  31. Bond, B. C., et al. The quantification of gene expression in an animal model of brain ischaemia using TaqManTM real-time RT-PCR. Molecular Brain Research. 106 (1-2), 101-116 (2002).
  32. Preece, P., Cairns, N. J. Quantifying mRNA in postmortem human brain: influence of gender, age at death, postmortem interval, brain pH, agonal state and inter-lobe mRNA variance. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 60-71 (2003).
  33. Preece, P., et al. An optimistic view for quantifying mRNA in post-mortem human brain. Molecular Brain Research. 116 (1-2), 7-16 (2003).
  34. Stan, A. D., et al. Human postmortem tissue: What quality markers matter. Brain Research. 1123 (1), 1-11 (2006).
  35. Scaduto, P., Sequeira, A., Vawter, M. P., Bunney, W., Limon, A. Preservation of global synaptic excitatory to inhibitory ratio during long postmortem intervals. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  36. Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (11), 5224-5228 (1995).
  37. Le Mauff, A., et al. Nicotinic acetylcholine receptors in the synganglion of the tick Ixodes ricinus: Functional characterization using membrane microtransplantation. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 14, 144-151 (2020).
  38. Crespin, L., Legros, C., List, O., Tricoire-Leignel, H., Mattei, C. Injection of insect membrane in Xenopus oocyte: An original method for the pharmacological characterization of neonicotinoid insecticides. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 77, 10-16 (2016).
  39. Soualah, Z., et al. GABAA Receptor Subunit Composition Drives Its Sensitivity to the Insecticide Fipronil. Frontiers in Neuroscience. 15, 1-13 (2021).
  40. Symington, S. B., Murenzi, E., Toltin, A. C., Lansky, D., Clark, J. M. Realizing the potential: improving a microtransplantation assay based on neurolemma-injected Xenopus oocytes: an ex vivo approach to study ion channels in their native state. ACS Symposium Series. 1264, 53-73 (2017).
  41. Palma, E., et al. Microtransplantation of membranes from cultured cells to Xenopus oocytes: A method to study neurotransmitter receptors embedded in native lipids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2896-2900 (2003).

Tags

Neurovetenskap utgåva 185
Mikrotransplantation av synaptiska membran för att återaktivera humana synaptiska receptorer för funktionella studier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miller, B., Powell, A., Gutierrez,… More

Miller, B., Powell, A., Gutierrez, B. A., Limon, A. Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies. J. Vis. Exp. (185), e64024, doi:10.3791/64024 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter