Summary
Protokol, sinaptik membranların Xenopus laevis oositlerine mikrotransplantasyonunu gerçekleştirerek, α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit ve γ-aminobütirik asit reseptörlerinin tutarlı ve güvenilir yanıtlarını kaydetmenin mümkün olduğunu göstermektedir.
Abstract
Uyarıcı ve inhibitör iyonotropik reseptörler, fizyolojik nöronal iletişim sırasında sinapsların aktivitesini belirleyen iyon akılarının başlıca kapılarıdır. Bu nedenle, bollukları, işlevleri ve diğer sinaptik elementlerle olan ilişkilerindeki değişiklikler, nörodejeneratif hastalıklarda ve zihinsel bozukluklarda beyin fonksiyonlarındaki değişikliklerin ve bilişsel bozulmanın önemli bir korelasyonu olarak gözlenmiştir. Uyarıcı ve inhibitör sinaptik reseptörlerin fonksiyonlarının hastalık tarafından nasıl değiştirildiğini anlamak, etkili tedavilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Hastalıkla ilgili bilgi edinmek için, hastalıklı insan beyninde işlevsel kalan nörotransmitter reseptörlerinin elektriksel aktivitesini kaydetmek önemlidir. Şimdiye kadar bu, reseptörlerin fonksiyonundaki patolojik değişiklikleri değerlendirmek için en yakın yaklaşımdır. Bu çalışmada, insan reseptörleri içeren donmuş insan beyin dokusundan sinaptik membranların Xenopus laevis oositlerinin membranına enjeksiyonu ve posterior füzyonu ile yeniden aktive edilmesinden oluşan sinaptik membranların mikrotransplantasyonunu gerçekleştirmek için bir metodoloji sunulmuştur. Protokol ayrıca, α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit (AMPA) ve γ-aminobütirik asit (GABA) reseptörlerinin tutarlı ve güvenilir yanıtlarını elde etmek için metodolojik stratejinin yanı sıra normalizasyon ve titiz veri analizi için kullanılan yeni ayrıntılı yöntemler sunmaktadır.
Introduction
Nörodejeneratif bozukluklar nüfusun büyük bir yüzdesini etkiler. Yıkıcı sonuçları iyi bilinmesine rağmen, beyin fonksiyonu için kritik olan nörotransmitter reseptörlerinin fonksiyonel değişiklikleri ile semptomatolojileri arasındaki bağlantı hala tam olarak anlaşılamamıştır. Bireyler arası değişkenlik, hastalığın kronik doğası ve semptomların sinsi başlangıcı, kimyasal dengesizliklerin iyi belgelendiği birçok beyin bozukluğunun anlaşılmasını geciktiren nedenlerden sadece birkaçıdır 1,2. Hayvan modelleri, evrimsel korunmuş sistemlerde fizyoloji ve patofizyolojinin altında yatan mekanizmalar hakkında paha biçilmez bilgiler üretmiş ve bilgimizi genişletmiştir; Bununla birlikte, kemirgenler ve insanlar arasındaki çeşitli türler arası farklılıklar, hayvan modellerinden insan beynine reseptör fonksiyonunun doğrudan ekstrapolasyonunu engellemektedir3. Bu nedenle, yerli insan reseptörlerini incelemek için ilk çabalar, Ricardo Miledi'nin laboratuvarı tarafından cerrahi olarak çıkarılmış doku ve dondurulmuş örnekler kullanılarak geliştirilmiştir. Bu ilk deneylerde, nöronal sinaptik ve ekstra sinaptik reseptörlerin yanı sıra nöronal olmayan nörotransmitter reseptörlerini içeren tüm membranlar kullanılmıştır ve hastalıklı durumlar hakkında önemli bilgiler sağlamalarına rağmen, reseptörlerin karışımınınverilerin yorumlanmasını zorlaştırdığı endişesi vardır 4,5,6,7. Daha da önemlisi, sinapslar birçok nörodejeneratif bozuklukta ana hedeftir 8,9; Bu nedenle, etkilenen sinapsların fonksiyonel özelliklerini test etmek için yapılan testler, sinaptik iletişimi etkileyen hastalıkla ilgili değişiklikler hakkında bilgi edinmek için esastır. Burada, orijinal yöntemin bir modifikasyonu açıklanmaktadır: zenginleştirilmiş sinaptik protein preparatlarının fizyolojik karakterizasyonuna odaklanan ve sıçan ve insan sinaptozomlarını incelemek için başarıyla uygulanan sinaptik membranların mikrotransplantasyonu (MSM) 10,11,12,13,14,15 . Bu metodolojiyle, bir zamanlar insan beyninde çalışan, kendi doğal lipitlerine gömülü sinaptik reseptörleri ve kendi ilişkili protein kohortlarıyla nakletmek mümkündür. Ayrıca, MSM verileri nicel olduğundan, bu verileri büyük proteomik veya sıralama veri kümeleriyle tümleştirmek için kullanmak mümkündür10.
Sinaptik reseptörlerin birçok farmakolojik ve biyofiziksel analizinin rekombinant proteinler üzerinde yapıldığını belirtmek önemlidir16,17. Bu yaklaşım, reseptörlerin yapı-fonksiyon ilişkileri hakkında daha iyi bir fikir verirken, nöronlarda bulunan karmaşık multimerik reseptör kompleksleri ve bunların hastalıktaki değişiklikleri hakkında bilgi sağlayamaz. Bu nedenle, doğal ve rekombinant proteinlerin bir kombinasyonu, sinaptik reseptörlerin daha kapsamlı bir analizini sağlamalıdır.
Bir laboratuvarın gereksinimlerine göre ayarlanabilen10,11,12,13,14,15 sinaptozomlarını hazırlamak için birçok yöntem vardır. Protokol, sinaptozomal zenginleştirilmiş preparatların izole edildiği ve mikrotransplantasyon deneyleri için işlenmeye hazır olduğu varsayımıyla başlar. Laboratuvarda, üretici talimatlarını izleyerek Syn-Per yöntemi kullanılır. Bu, elektrofizyolojik deneylerde yüksek tekrarlanabilirlik nedeniyle yapılır10,11. Ayrıca, enjeksiyon20 için hazır olarak satın alınabilen Xenopus oositleri 18,19'un nasıl izole edileceğini açıklayan çok sayıda literatür vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm araştırmalar kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilir ve California Irvine Üniversitesi (IACUC-1998-1388) ve Teksas Üniversitesi Tıp Şubesi (IACUC-1803024) kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanır. Alzheimer hastalığı olmayan (AD) bir beyinden (kadın, 74 yaşında, ölüm sonrası aralık 2.8 saat) ve bir AD beyninden (kadın, 74 yaşında, ölüm sonrası aralık 4.5 saat) temporal korteks, California Üniversitesi Irvine Alzheimer hastalığı araştırma merkezi (UCI-ADRC) tarafından sağlanmıştır. Beyin bağışı için bilgilendirilmiş onam UCI-ADRC tarafından alındı.
NOT: Sabit olmayan insan beyin dokusu, kan yoluyla bulaşan patojenlerin (BBP) kaynağı olarak tedavi edilmelidir. Buna göre, deneylere başlamadan önce BBP eğitimine ihtiyaç vardır. Bu protokol, BSL2 gereklilikleri kapsamında bir biyogüvenlik seviye 2 (BSL2) laboratuvarında gerçekleştirilir. Laboratuvardaki kılavuz ilkeler ve önlemler şunları içerir: laboratuvarda yiyecek veya içeceklere izin verilmemesi, iyi laboratuvar uygulamalarına uyulması, kişisel koruma ekipmanı (eldiven, önlük, açık parmaklı ayakkabı) gerekmemesi ve kapının her zaman kapalı olması gerekir.
1. Xenopus oosit mikroenjeksiyon hazırlığı
- Enjeksiyon iğneleri yapmak için, bir mikropipet çektirme makinesi kullanarak 3,5 inç borosilikat tüpleri çekin. Mikroenjeksiyon iğneleri çekildikten sonra, mikroenjeksiyonun yapılabilmesi için iğnenin ucundan yeterince kesmek için bir mikroskop ve bir tıraş bıçağı kullanın.
NOT: İğnenin kesilecek ucunun uzunluğu değişebilir. - 800 mL damıtılmış suya 200 mL Barth's Stock Solution (5x) ekleyerek 1x Barth'ın çözeltisini hazırlayın. 24 delikli, düz tabanlı bir doku kültürü plakasını 18 °C 1x Barth çözeltisi ile doldurun.
- 5x Barth'ın stok çözümünü aşağıdaki gibi hazırlayın. 1 L damıtılmış suya 25.71 g NaCl (sodyum klorür), 0.372 g KCl (potasyum klorür), 0.301 g CaCl 2 (kalsiyum diklorür), 0.389 g Ca(NO 3)2 (4H2O) (kalsiyum nitrat tetrahidrat), 1.01 g MgSO4 (7H 2 O) (magnezyum sülfat heptahidrat), 1.008 g NaHCO3 (sodyum bikarbonat), ve 11.91 g HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit).
- Ksenopus oositlerini18,19'da açıklanan protokolleri kullanarak ve 2x büyütülmüş stereoskop kullanarak, sağlıklı görünümlü, evre V-VI oositleri seçerek izole edin. Kuyu başına yaklaşık 10 oosit yerleştirin ve kayıtları gerçekleştirirken kontrol hücresi olarak kullanılmak üzere enjekte edilmemiş yumurtaları barındırmak için kuyulardan birini kullanın.
- 1 cm boyunda ve 6 cm çapında küçük bir Petri kabı alın ve içine Naylon ağı, kabın tabanını kaplayacak şekilde yerleştirin. Daha sonra, oositlerin mikroenjeksiyonlarını gerçekleştirmek için kullanılmak üzere 15 mL 1x Barth çözeltisi dökün.
- Mikroskop platformunun orta hattı boyunca bir nanoenjektör yerleştirin. Mıknatısı Kapalı konuma getirin ve nanoenjektörü dikkatlice desteklerken yavaşça istenen konuma getirin. Nanoenjektör düzgün bir şekilde konumlandırıldığında, mıknatısı tamamen Açık konumuna geri getirin ve güvenli olduğundan emin olun.
- 50.6 nL'lik bir numune boyutu için, nanoenjektörün yanında aşağıdaki ayarları kullanın: 1 D (aşağı), 2 D, 3 U (yukarı), 4 D ve 5 U. Mikroskop standı üzerinde nanoenjektörün yörüngesiyle hizalayarak kendinden sızdırmaz bir termoplastik parçası veya mikrosantrifüj tüp kapağı yerleştirin.
NOT: 50 nL, sitoplazmanın dayanabileceği maksimum enjekte edilen materyal miktarınayakındır 21. - Bir insülin şırıngasını hacminin yaklaşık yarısını mineral yağ (yaklaşık 0.5 mL / cc) ile doldurun. Bu şırıngayı kullanarak, mikroenjeksiyon iğnesini mineral yağ ile doldurun. İğnenin ucunda görünür bir yağ boncuğu göründüğünden emin olun.
- Nanoenjektör pistonunu en az 1-2 cm'ye maruz bırakın. Bunu, piston istenen uzunlukta görünene kadar BOŞ düğmesini basılı tutarak yapın. Piston açığa çıktıktan sonra, mineral yağ dolu mikroenjeksiyon cam iğnesini nanoenjektör pistonuna yavaşça ve dikkatlice yerleştirin ve siyah direnç O-ringine iyi oturduğundan ve beyaz direnç halkasında durduğundan emin olun. İşlem sırasında nanoenjektör pistonunu bükmediğinizden emin olun.
- Mikroenjeksiyon cam iğnesi güvenli ve yerinde olduğunda, olası hava kabarcıklarını boşaltmak için BOŞ tuşuna basın. Nazikçe, bir kağıt mendille, fazla mineral yağı temizleyin.
2. Numunenin yüklenmesi
- 10,11,12,13,14,15'te açıklandığı gibi insan beyninin ilgilendiği bölgeden sinaptozomal zenginleştirilmiş preparatlar (örnekler) hazırlayın ve enjeksiyon anına kadar -80 ° C'de yaklaşık 5 μL'lik alikotlarda saklayın.
- Enjeksiyondan önce, aliquot'u ıslak buza aktarın ve sonikasyon ve geri alma dışında her zaman buz üzerinde tutun. Örneklerin sayısı ve türleri deneysel tasarım ile belirlenecektir.
- Numunenin ısınmasını önlemek için seçilen örnekleri yüzen ıslak buzlu bir banyoda 3x sonikleştirin. Her seferinde 5 s döngü kullanın, döngüler arasında ıslak buzda 1 dakika bekleyin.
- Termoplastik üzerine 1 μL numune yerleştirin. Numunenin hareketini önlemek için numune yerleştirmeden önce, gerekirse, yüzeyde bir girinti yapın.
- İğneyi konumlandırmak ve doldurulacak numuneye doğru hareket ettirmek için nanoenjektörü tutan manipülatörün düğmelerini kullanın. İğne ucu numuneye girdikten sonra, yeterli numune alınana kadar FILL düğmesini basılı tutun. 10 oosit için yaklaşık 0.5 μL gereklidir. Düğmeleri kullanarak, nanoenjektörün iğnesini en yüksek konuma geri getirin.
3. Yumurtaların enjekte edilmesi
NOT: Standartlaştırılmış sıçan korteksi sinaptozomal membranları, farklı oosit grupları arasındaki füzyon kapasitesindeki değişiklikleri ölçmek için tüm deneylerde bir dizi oosite enjekte edilir.
- Seçilen oositleri, takılı naylon ağa ve Barth çözeltisine (yaklaşık 10 oosit) sahip küçük Petri kabına yerleştirin. Yumurtaları birbirlerinin üstünde olmayacak şekilde düzenleyin; bu, enjeksiyon işlemi sırasında yardımcı olacaktır.
- Nanoenjektörü tutan manipülatördeki düğmeleri kullanarak, iğneyi oositlere doğru hareket ettirin. İğne Barth'ın çözeltisine batırıldıktan sonra, mikroenjeksiyon iğnesinin numuneyi serbest bıraktığından emin olmak için nanoenjektör için ayak pedalını kullanın. Örnek serbest bırakılıyorsa, mikroskop görünümünden görülebilecektir.
- Numunenin serbest bırakıldığı güvenle belirlendikten sonra, yumurtayı mikroenjekte etmeye geçin. Örnek serbest bırakılmıyorsa, iğneyi doldurma işlemini tekrarlayın.
- Yumurtayı yüzeyin hemen altındaki iğneyle nüfuz edin, daha derin değil ve numuneyi enjekte etmek için ayak pedalını kullanın. Ayak pedalı, örnek serbest bırakıldığında bir bip sesi çıkarır. Yaklaşık 2-3 s bekleyin. Enjeksiyon başarılı olursa, hücre genişleyecektir. Bu gerçekleştiğinde, hücreden çıkmak için manipülatördeki düğmeleri kullanın.
NOT: Oositteki membranların füzyonu polarize bir işlemdir; bu nedenle, oosit, zar füzyonunu en üst düzeye çıkarmak için hücrenin hayvan tarafına, tercihen ekvatorun üstüne, iğnenin hayvan tarafına doğru açısıyla enjekte edilmelidir. - Petri kabını, bir sonraki yumurta iğne ile aynı hizaya gelecek şekilde hareket ettirin ve çanaktaki tüm yumurtalar enjekte edilene kadar işlemi tekrarlayın. İstenilen sayıda yumurta enjekte edilene kadar bu işlemi tekrarlayın. Bir yumurta kuyucuğunun kontrol olarak kullanılmak üzere enjekte edilmeden bırakıldığından emin olun.
- Tüm yumurtalar enjekte edildikten sonra, nanoenjektörü orijinal konumuna geri çekin ve iğneyi çıkarın.
4. İki elektrot voltaj kelepçesi kullanarak iyon akımlarının kaydedilmesi
- İki elektrot voltaj kelepçesi (TEVC) elektrot iğnesi yapmak için, mikropipet çektirme makinesini kullanarak 15 cm uzunluğunda ateşle parlatılmış borosilikat cam tüpleri çekin. Çekme işlemi tamamlandıktan sonra, uzun kılcal iğneler kullanarak 3 M KCl ile doldurun veya alternatif olarak, iğneleri sürekli bir vakum altında 15 dakika boyunca 3 M KCl çözeltisinde batırın ve kaynatın. Yüksek sıcaklık, elektrotların doldurulmasına ve hava kabarcıklarının giderilmesine yardımcı olur.
- Kristal formda ve deiyonize suda KCl kullanarak ve elektrotların referans potansiyelinin değişmemesi için bu adımları dikkatlice izleyerek 3 M KCl elektrot dolum çözeltisi hazırlayın. KCl'yi 2-3 saat boyunca bir fırında dikkatlice kurulayın. Analitik terazi kullanarak 223,68 g KCl'yi dikkatlice tartın. Gümüş elektrot tellerini klorlamak için bu çözeltiyi kullanın.
NOT: Cam elektrotları çekmek için pipet yemek kitabı buradan indirilebilir: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf.
- Kristal formda ve deiyonize suda KCl kullanarak ve elektrotların referans potansiyelinin değişmemesi için bu adımları dikkatlice izleyerek 3 M KCl elektrot dolum çözeltisi hazırlayın. KCl'yi 2-3 saat boyunca bir fırında dikkatlice kurulayın. Analitik terazi kullanarak 223,68 g KCl'yi dikkatlice tartın. Gümüş elektrot tellerini klorlamak için bu çözeltiyi kullanın.
- İyon akımlarının kaydedilmesi için kullanılan tüm ekipmanları açın: ana sistemler, çözelti valfleri, mikroskop ışığı, valf sistemleri, yumurta kelepçesi ve vakum sistemi. Masaüstü bilgisayarı açın, WinEDR V3.9.1.'de oturum açın ve programın çalıştığından ve kurulum değerlerinin aşağıdaki gibi doğru olduğundan emin olun: diske kaydedin, kayıt süresini ayarlayın ve simülatör seçeneğini temizleyin.
- Amplifikatör için aşağıdaki başlangıç ayar değerlerini sağlayın: voltaj elektrodu (Vm) bölümü için negatif kapasite telafisi (-C) seçeneğini kapatın; banyo elektrotları (Im) bölümü için, kazanç seçici anahtarı (0,1 ila 10 aralığı) 10'a ve kazanç çarpanını (x0,1, x1,0 ve x10) seçen üç konumlu geçiş anahtarını x1,0'a ayarlayın. LED ışıkları kazanç çarpanı seçimini gösterecektir; kelepçe bölümü için kelepçe modu seçiciyi kapatın, DC kazanç kontrolünü GİRİŞ olarak ayarlayın ve kazanç kontrolü tam bant genişliği açık döngü (0 ila 2000 aralığı) yaklaşık 1200 arasında; komutlar için 40mV'ye ayarlayın ve tutma kontrollerini negatif ve ölçek çarpanını x2 olarak ayarlayın; akım elektrodu için, oositi etkilemeden önce sıfır referans oluşturmak için Ve ofsetini kullanın.
- Kaydetmek için WinEDR V3.9.1 yazılımını açın, üst menüye gidin ve Dosya > Yeni Dosya Aç'ı seçin. Kendi klasörünüzü oluşturun ve dosyayı kaydedin.
- Ardından, ana menüde Kaydet'i seçin > Diske Kaydet. İki elektrot ooktilin içindeyken, VC-8 valf denetleyicisindeki zil sesini açın ve OC-725C amplifikatöründe kelepçeyi Yavaş'a çevirin. Ardından, WinEDR yazılımına geri dönün ve ekranın sol üst köşesindeki Kaydet'i seçin.
- Sol alttaki işaret grafiğinde, ilk membran potansiyelinizi not edin ve Enter tuşuna basın. Deney devam ettikçe, kullanılan ilaçların adını yazabilirsiniz. Deneme bittikten sonra, ekranın sol üst köşesindeki Durdur'u seçin.
NOT: TEVC'yi gerçekleştirmek için WinEDR veya WinWCP yazılımı kullanıyoruz, çünkü bunlar ücretsizdir ve deneyler için çok uygundur, ancak mevcut olan diğer yazılımlar kullanılabilir.
- Deneyi gerçekleştirmek için gereken tüm ilaç çözeltilerini (örneğin, GABA, Kainate) oluşturun ve çözelti valflerini açıp kapatarak ve sıkıştırma valflerinin yer değiştirmesini gözlemleyerek düzgün çalıştığını onaylayın.
- Tüpleri, ilgili çözeltiyi tüpe bağlı şırınga kabına dökerek doldurun ve valf kontrolörünü çözelti tüpleriyle ilişkilendirilecek şekilde etiketleyin. Çözelti akışının sabit olduğundan, kabarcık olmadığından ve vakum sisteminin düzgün çalıştığından emin olun.
- Mikroskop ve kayıt odası alanını ayarlayın. Agar köprülerini (aşağıya bakınız) kayıt odasının arkasındaki ilgili dairesel deliklere (taşıma alanından distal) yerleştirin, zemin referansı olarak kullanılan elektrotlar ve kayıt odası için kuyuları birbirine bağlayın. Ringer'ın çalışma çözümünü (1x) kayıt odasına ve toprak referans elektrodu kuyularına ekleyin.
- Agar köprüleri, Ringer çözeltisinde% 3 agar ile doldurulmuş, 2-3 cm uzunluğunda U şeklinde borosilikat tüplerdir. 15 cm uzunluğundaki tüpleri keserek, açık alev üzerinde bükerek ve daha sonra bir insülin şırıngası kullanarak sıcak% 3 agar ile doldurarak U şeklinde tüpler yapın. Ringer'ın solüsyonunda dolu agar köprülerini kullanana kadar buzdolabında saklayın.
- 20x Ringer'ın stok çözeltisini aşağıdaki gibi yapın: 1 L damıtılmış suda, 134.4 g NaCl, 2.982 g KCl, 5.29 g CaCl 2 ve 23.83 g HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit) ekleyin. 1x Ringer'ın çalışma çözümü için, hacimsel bir şişede, 3.800 mL damıtılmış suya 200 mL Ringer'ın stok çözeltisini (20x) ekleyin.
- Her deneyden önce gümüş telleri 3 M KCl çözeltisine yerleştirerek ve gümüş elektrodu 9 V'luk bir pilin pozitif terminaline bağlayarak elektroliz yoluyla klorlu gümüş elektrotlar hazırlayın. Yaklaşık 3 dakika sonra elektrot içine katı kahverengi bir AgCl tabakası biriktirilir. Klorlu gümüş elektrot tellerini elektrot muhafazasına yerleştirin.
NOT: Toprak referansı ve kayıt klorlu elektrotlar gümüş/gümüş klorür (Ag/AgCl) elektrotlarıdır. - Borosilikat iğnelerini KCl çözeltisinden çıkarın. Elektrot iğnesinin açık ucundan az miktarda KCl çözeltisi çıkarmak için bir şırınga kullanın ve KCl çözeltisini mineral yağ ile değiştirin; bu, suyun buharlaşmasını ve iğne içindeki KCl konsantrasyonundaki değişiklikleri önleyecektir. Cam iğneyi klorlu gümüş elektrot telinin üzerine kaydırın ve yerine sıkın.
- Elektrotları tutan sağ ve sol manipülatörleri kullanarak, elektrot iğnelerini Ringer's Solution ile doldurulmuş kayıt odasına yönlendirin.
- Vm ve Ve ofset düğmelerini sıfırlayarak ve ardından Elektrot Test düğmelerine basarak her elektrotun direncini kontrol edin. Direnç 0,5-3 MΩ arasında olmalıdır (ekranda doğrudan 5-30 mV olarak okunur). Direnç aralığın dışındaysa, yeni mikroelektrotlar kullanarak değiştirin.
- Kayıt odasını taze Ringer solüsyonuyla doldurun. Bir cam pipet kullanarak, kayıt odasının ortasına enjekte edilmemiş veya mikrotransplante edilmiş bir oosit yerleştirin. Yumurtanın mikroskop altında, hayvan tarafı yukarıda olacak şekilde açıkça görülebildiğinden emin olun (bkz. adım 3.4'teki NOT).
- Elektrotu, oosit zarına dokunana kadar Ringer çözeltisine yönlendirin. Hayvan tarafındaki oosit zarını her iki elektrotla da nazikçe delin (bkz. adım 3.4'teki NOT) ve dinlenme zarı potansiyelini kaydedin. Ringer'ın çözüm akışını açın.
- Yumurta kelepçesi amplifikatörünü kullanarak, modu Voltaj Kelepçesi olarak değiştirin ve -80 mV tutma voltajını ayarlayın. Monitördeki akım negatif olmalı, genellikle 0 ila 0,4 mikroamper arasında olmalıdır.
- Kaydı Dosya > Yeni > olarak kaydetmek için yeni bir dosya oluşturun Kaydı yazılıma kaydedin. Kayda başlayın, Kaydet > Diske Kaydet'e basın. İşaret kutusu iletişim kutusunu kullanarak dosyaya ilgili bilgileri ekleyin (test adı, kullanılan ilaçlar vb.).
- Valfleri açarak ve bunları 15 sn boyunca kayıt odasına perfüze ederek kimyasal stimülasyon için agonistleri (örneğin, GABA, glutamat veya kainat) uygulayın. Genellikle, maksimum puan sayısını çizmek ve yanıtı yeniden oluşturmak için 10x'lik bir kazanç kullanın. Akımlar çok küçükse, değerlendirilmeleri ve görülebilmeleri için amplifikasyonu veya kazancı artırın. Bu değişiklikleri her zaman not edin.
NOT: Perfüzyonun süresi deneysel paradigmaya bağlıdır. Ana amaç maksimum genliği ölçmekse, GABA için zirveye veya kainat için platoya ulaşmak için 15 s yeterli olacaktır. - Çözüm düzeylerini her zaman izleyin. Ringer'ın çözeltisinin, tüm çözüm kullanımları arasında kullanıldığı için sık sık yeniden doldurulması gerekecektir. Kayıt tamamlandıktan sonra, voltaj kelepçesini KAPALI konuma getirin ve Zil Anahtarının çözüm valfini kapatın. Yumurtayı çıkarın. Kaydı durdurun ve dosyayı kaydedin. Enjekte edilen tüm oositler için bu adımları tekrarlayın.
5. TEVC kayıtlarının analizi
- Kayıtların bir kopyasını bir USB sürücüsüne kaydedin. Oradan, analiz edilecek istenen dosyayı açın. Açılan dosyada kayıt görüntülenebilir, işaretlenebilir ve ölçülebilir. En yaygın analiz, maksimum genliğin, aktivasyon süresinin, duyarsızlaştırmanın ve tekrarlayan uygulamaların tükenmesinin ölçülmesini içerir.
- AMPA maksimum yanıtını ve GABA tepe yanıtını ölçün. Bu ölçümleri elde etmek için, önce imleçle kırmızı çizgiyi bulup Ringer uygulaması veya taban çizgisi tarafından oluşturulan akıma sürükleyerek sıfır düzeyi veya taban çizgisi oluşturun.
- Sıfır düzeyi oluşturulduktan sonra, yeşil, dikey okuma imlecini grafik izleyicinin istenen bölümüne sürüklemek için fareyi kullanarak yanıt ölçümlerini belirleyin. İstenirse, analiz edilecek izleri tercih edilen başka bir yazılımda dışa aktarın
NOT: Sıfır düzeyi tanımlanamıyorsa veya izleyicide çok fazla gürültü belirtiliyorsa, WinEDR dosyasını çevrimdışı bir analitik yazılıma aktarın, bu da bir düzey temeli sağlamak için değişikliklere ve gürültüyü azaltmak için filtrelerin eklenmesine olanak tanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enjeksiyondan birkaç saat sonra, nörotransmitter reseptörlerini ve iyon kanallarını taşıyan sinaptik membranlar, oosit plazma zarı ile kaynaşmaya başlar. Şekil 1, Xenopus oositlerine mikrotransplante edilenAMPA ve GABA A reseptörlerinin kayıtlarını göstermektedir. Analizin çoğu için, numune başına iki veya üç oositten gelen yanıtlar, farklı kurbağalardan iki veya üç grup oosit kullanılarak, numune başına toplam altı ila dokuz oosit için ölçülmüştür. Bu, grup farklılıklarını gözlemlemek için büyük bir insan denek kohortu için yapılır. Analiz basittir ve yanıtların genliğini ölçer. Nakledilen membranların füzyonunun polarize bir işlem olduğuna dikkat etmek önemlidir, bu nedenle enjeksiyon bölgesinin seçimi çok önemlidir. Vejetal yarımküreye veya ekvatora enjeksiyon, enjekte edilen tüm oositlerin reseptörleri başarıyla yerleştirmesi ve unimodal dağılımı izleyen iyon akımları üretmesi ile tutarlı sonuçlar verir22. İlginçtir ki, membranlar başlangıçta hayvan kutbuna enjekte edildiğinde, oosit yanıtları bimodal bir dağılımı takip etti: bir grup oositin hiç veya çok düşük yanıtları vardı, diğer grup ise bitkisel kutba veya ekvatora enjekte edilen oositlerden bile daha büyük yanıtlara sahipti. İnsan zarları oositin çekirdeği içinde enjekte edildiği ve hapsedildiği için hayvan kutbuna enjekte edilen oositlerin bazılarının düşük tepkilere sahip olup olmadığını belirlemek için, Torpido'nun elektrik organından izole edilen membranların bir karışımı ve GABAρ1 alt birimi için kodlanan cDNA, hayvan tarafının kutbuna enjekte edildi. Torpido membranlarından gelen nikotinik reseptörler, asetilkolin 23'ün perfüzyonu sırasında hızlı bir aktivasyon ve hızlı duyarsızlaşma gösterirken, ρ1 alt birimi, GABA24,25,26,27'nin sürekli perfüzyonu sırasında duyarsızlaşmayan homomerik GABAρ1 reseptörleri oluşturur. Birlikte enjekte edilen numune yanlışlıkla sitoplazmaya değil çekirdeğe veriliyorsa, cDNA RNA'ya kopyalanır ve fonksiyonel GABAρ1 reseptörlerine çevrilir. Şekil 2, enjeksiyon çekirdeğe yönelik olduğunda, asetilkoline yüksek yanıt veren oositlerin GABAρ1 reseptörlerini eksprese etmediğini göstermektedir; tersine, asetilkoline sıfır veya düşük yanıt veren oositler GABA reseptörlerini eksprese etti. Bu deneyin sonuçları, ilk olarak, düşük yanıtlı oositlerde, membranların yanlışlıkla oositin çekirdeğine biriktiğini göstermektedir; İkincisi, torpido zarlarının çekirdeğe enjekte edilmesi, ρ1 cDNA'nın transkripsiyonuna büyük ölçüde müdahale etmez. Birlikte enjekte edilen birkaç oositin hem asetilkolin hem de GABA'ya büyük yanıtları vardı, bu da enjeksiyon sırasında çekirdeğin yırtıldığını düşündürüyordu. Nakledilen membranların oositin hayvan yarımküresine daha fazla sokulması, heterolojik olarak eksprese edilen nörotransmitter reseptörlerinin polarize lokalizasyonunu yansıtır 26,28. Bu nedenle, çekirdeği hedeflemeden hayvan yarımküresine enjekte ederek, daha büyük tepkiler elde etmek mümkündür. Bu, düşük reseptör yoğunluğuna sahip örnekleri, örneğin düşük sayıda reseptöre sahip Alzheimer hastalığı (AD) dokusundan incelemek için önemlidir (Şekil 3).
Şekil 1: Oositlerin temsili iyon akımları. İnsan sinaptik reseptörlerinden membranlarla enjekte edilen oositlerden iyon akımları kaydedildi. AMPA reseptörleri 100 mM Kainat ile aktive edildi ve GABAA reseptörleri 1 mM GABA ile aktive edildi. VH = -80 mV. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Torpido ve GABAρ1'in birlikte enjeksiyonu. Asetilkolin reseptörleri bakımından zengin Torpido'nun elektrik organından filtrelenmiş membranların (0.1 μm) birlikte enjeksiyonu ve GABAρ1 reseptörü için kodlanan cDNA'nın hayvan kutbuna göre esas olarak iki grup oosit üretti: bir grup oosit (A) asetilkoline (Ach; 1 mM) büyük yanıtlar verdi, ancak 1 μM GABA'ya (-80 mV'ye kelepçelenmiş voltaj) yanıt vermedi, ve (B) grubundaki oositlerin ACh'ye sıfır veya düşük yanıtları, ancak GABA'ya büyük yanıtları vardı. (C) Grafik, grup 1 (n = 5 oosit) ve grup 2'deki (n = 11 oosit) pik akımın ortalama ± standart ortalama (SEM) hatasını göstermektedir. Grup 2'deki bir oositte çekirdeğin rüptürünü düşündüren büyük GABA ve ACh yanıtları vardı; Sonuç olarak, yanıtların dağılımı, membran akımının dağılımının ortalama ve medyanı arasındaki farkla (22 nA'ya karşı 6 nA) belirtildiği gibi, düşük değerlere çarpıtılmıştır. Bu sonuç, düşük yanıtlı oositlerin nedenlerinden birinin, membranların enjekte edilmesi ve yumurtanın çekirdeğine hapsedilmesi olduğunu göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ksenopus oositlerinde hücre zarlarının polarize olarak yerleştirilmesi. Hayvan veya bitkisel kutuplara enjekte edilen oositlerin GABA ve kainat yanıtları, AD olmayan bir beyinden (dişi, 74 yaşında, ölüm sonrası aralık 2.8 saat) ve bir AD beyninden (kadın, 74 yaşında, ölüm sonrası aralık 4.5 saat) elde edilen filtrelenmemiş zarlarla. Çekirdeği hedeflemeden hayvan kutbunun yanına enjekte edilen oositler, bitkisel kutba enjekte edilen oositlerden daha büyük tepkiler verdi, böylece çok az sayıda reseptöre sahip doku örneklerinin incelenmesine izin verdi. Öğrencinin bitkisel ve hayvansal kutuplar arasındaki t-testi: ** p < 0.01, *** p < 0.001 , Barlar tepe akımının ortalama ± SEM'ini gösterir, n = her sütunda 5 oosit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beyin bozukluklarında homeostatik ve patolojik süreçleri anlamak ve hastalıkları önlemek veya tedavi etmek için terapötik stratejiler geliştirmek için insan beyninden doğal protein komplekslerinin analizi gereklidir. Bu nedenle, çıtçıtlı dondurulmuş örnekler içeren beyin bankaları, büyük ve çoğunlukla kullanılmayan fizyolojik bilgi zenginliğinin paha biçilmez bir kaynağıdır29,30. Postmortem dokuyu kullanmak için ilk endişe, verilerin yorumlanmasını karıştırabilecek mRNA veya protein yıkımının açık olasılığıdır. Örneğin, beynin pH'ı, mRNA'nın kantitatif gerçek zamanlı-PCR ile nicelleştirilmesi ile tutarlı bir şekilde pozitif bir korelasyon gösterir ve bu korelasyon patolojiden bağımsızdır31. Denekler arası pH farklılıkları, sonuçların yorumlanmasını engelleyebilecek büyük varyanslarla mRNA nicelleştirme farklılıklarına yol açabilir32. İlginç bir şekilde, pH asitleştikçe mRNA transkriptlerinin daha düşük nicelleştirilmesine rağmen, farklı transkriptler arasındaki kovaryanslar33 korunmakta ve patolojik durumların güvenilir transkriptom profillemesini elde etmek için bir çerçeve sağlamaktadır. Önemli olarak, mRNA yüksek oranda parçalanabilirken, postmortem dokudaki transmembran proteinleri bozulmaya karşı çok dirençlidir34. Laboratuvardaki önceki deneyler, insan beyninin GABA ve glutamat reseptörlerinin son derece büyük postmortem aralıklardan sonra işlevsel olduğunu göstermiştir35. Dahası, MSM yöntemi, ölüm anında pH, agonal durum ve mRNA ve protein bozunması gibi potansiyel karıştırıcı faktörlerin doğrudan reseptörlerin işlevi üzerindeki etkilerini doğrudan ölçmeye izin verir, böylece bu bilgiyi verilerin analizinde ve yorumlanmasında kullanmanın yollarını sağlar.
Tekniğin modifikasyonları ve sorun giderme
Daha önce de belirtildiği gibi, MSM, akademisyenlerde ve ilaç endüstrisindebirçok laboratuvar tarafından yaygın olarak doğrulanmış ve onaylanmış bir yöntem olan toplam membranların orijinal transplantasyonunun hafif bir modifikasyonudur 12,36,37,38,39,40. Örneğin, reseptörlerin mikrotransplantasyonu, beyin bölgesi seçiciliğini gösteren AMPA reseptörlerinin TARP gama-8 seçici bir antagonisti olan Eli Lilly'nin LY3130481'inin geliştirilmesinde önemliydi12. MSM, sinaptozomal zenginleştirilmiş preparatları kullanarak aynı mikrotransplantasyon prensibini izler; bu nedenle, iyi sinaptozom preparatlara sahip olmak önemlidir. Syn-Per yöntemini kullanıyoruz çünkü bu prosedürle elde edilen sonuçlar çok tutarlıdır ve iyon akımlarının genliği, proteomik deneylerdeki sinaptik proteinlerin seviyeleri ile çok iyi ilişkilidir10. Bununla birlikte, mikrotransplantasyon veya MSM, mükemmel sonuçlarla birçok kaynaktan (örneğin, böcek zarları38,39, nörolemma40) reseptörleri incelemek için uyarlanabilir. Sinapsların Alzheimer hastalığı gibi güçlü bir şekilde etkilendiği veya düşük miktarlarda mevcut olduğu bazı bozukluklar vardır; Bu durumda, membranların hayvan tarafına enjeksiyonu daha büyük akımların elde edilmesine yardımcı olur. Enjekte edilen protein miktarının arttırılması, membranların füzyonunu ve yanıtların boyutunu da arttırır. Enjekte edilen membranların konsantrasyonu ile oositlerin sağkalımı arasında negatif bir korelasyon olmasına rağmen, verilen deneysel analize izin veren uygun bir membran konsantrasyonu bulmak mümkündür.
MSM'nin Sınırlamaları
MSM, insan reseptörlerinin veya iyon kanallarının incelenmesi için geliştirilen nicel bir yöntemdir; bu nedenle, sınırlı kullanılabilirliğe sahip dokuları incelemek için çok uygundur. Xenopus oositlerinin endojen glutamat veya GABA reseptörleri olmadığından, mikrotransplante edilen oositlerde GABA veya glutamat için herhangi bir yanıt, oositlerin zarı ile kaynaşmış enjekte edilen reseptörlerden gelir. Bununla birlikte, MSM'nin önemli bir sınırlaması, iyon akımlarının mikrotransplante edilmiş ve endojen kanallardan / taşıyıcılardan ayrılması zor olduğundan, oositlerde endojen olarak da eksprese edilen iyon kanallarının veya taşıyıcıların incelenmesidir. Endojen genleri susturan gelecekteki çalışmalar bu sınırlamaya yardımcı olabilir.
Mevcut yöntemlerin önemi, MSM'nin doğal zarı karşılık gelen proteinleri ve reseptörleri ile birleştirmesi ve böylece analiz için daha fizyolojik bir ortam sağlamasıdır. Nörotransmitter reseptörleri AMPA tipi GluR1, α7-AcChoRs ve α4β2-AcChoR'larda kültürlenmiş hücrelerden gözlendiği gibi, oositlere transplantasyondan sonra reseptörlerin özelliklerinin korunduğu bulunmuştur41.
Tekniğin gelecekteki uygulamaları, sağlıklı ve hastalıklı insan beyninden kültürlenmiş ve kültürlenmemiş hücrelerin ve dokuların zarlarına ilgi duyan farklı proteinlerin ve reseptörlerin elektrofizyolojik özelliklerinin incelenmesini içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, AL'ye NIA/NIH hibeleri R01AG070255 ve R01AG073133 tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, bu makalede gösterilen insan dokusunu sağladığı için California Üniversitesi Irvine Alzheimer hastalığı araştırma merkezine (UCI-ADRC) teşekkür ederiz. UCI-ADRC, NIH / NIA hibesi P30 AG066519 tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Microinjection | |||
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| 24 well, flat bottom Tissue Culture Plate | Thermofisher | FB012929 | |
| Flaming/Brown type micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| Injection Dish | Thermofisher | 08-772B | |
| Microcentrifuge Tubes | Thermofisher | 02-682-002 | |
| Mineral Oil | Thermofisher | O121-1 | |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | |
| Nylon mesh | Industrial Netting | WN0800 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Syringe | Thermofisher | 14-841-31 | |
| Ultrasonic cleaning bath | Thermofisher | FS20D | |
| Xenopus laevis frogs | Xenopus 1 | 4217 | |
| For Two Electrode Voltage clamp | |||
| 15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries | Sutter | B200-116-15 | |
| Any PC computer or laptop | |||
| Low-pass Bessel Filter | Warner Instruments | LPF-8 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Two electrode voltage clamp workstation | Warner Instruments | TEV-700 | |
| ValveLink 8.2 Perfusion Controller | Automate Scientific | SKU:01-18 | |
| WInEDR Free software | University of Strathclyde Glasgow | https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | |
| X Series Multifunction DAQ | National Instruments | NI USB-6341 | |
| Reagents | |||
| Calcium dichloride | Thermofisher | C79 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Thermofisher | C109 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Thermofisher | BP310 | |
| Kainic acid | Tocris | 0222 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Thermofisher | M63 | |
| Potassium chloride | Thermofisher | P217 | |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher | S233 | |
| Sodium chloride | Thermofisher | S271-1 | |
| Ultrafree-0.1 µm MC filter, | Amicon |
References
- Furcila, D., Defelipe, J., Alonso-Nanclares, L. A study of amyloid-β and phosphotau in plaques and neurons in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Journal of Alzheimer's Disease. 64 (2), 417-435 (2018).
- Varol, E., Sotiras, A., Davatzikos, C. HYDRA: revealing Heterogeneity of imaging and genetic patterns through a multiple max-margin discriminative analysis framework. Neuroimaje. 145, 346-364 (2017).
- Hodge, R. vD., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Wu, J., et al. GABAA receptor-mediated excitation in dissociated neurons from human hypothalamic hamartomas. Experimental Neurology. 213 (2), 397-404 (2008).
- Miledi, R., Eusebi, F., Martínez-Torres, A., Palma, E., Trettel, F. Expression of functional neurotransmitter receptors in Xenopus oocytes after injection of human brain membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 13238-13242 (2002).
- Zwart, R., Mazzo, F., Sher, E. Microtransplantation of human brain receptors into oocytes to tackle key questions in drug discovery. Drug Discovery Today. 24 (2), 533-543 (2019).
- Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Miledi, R. Microtransplantation of neurotransmitter receptors from postmortem autistic brains to Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10973-10977 (2008).
- Bae, J. R., Kim, S. H.
- Taoufik, E., Kouroupi, G., Zygogianni, O., Matsas, R. Synaptic dysfunction in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases: An overview of induced pluripotent stem-cell-based disease models. Open Biology. 8 (9), 180138 (2018).
- Zeppillo, T., et al. Functional impairment of cortical AMPA receptors in schizophrenia. Schizophrenia Research. , (2020).
- Lauterborn, J. C., et al. Increased excitatory to inhibitory synaptic ratio in parietal cortex samples from individuals with Alzheimer's disease. Nature Communications. 12 (1), 2603 (2021).
- Mazzo, F., et al. Reconstitution of synaptic Ion channels from rodent and human brain in Xenopus oocytes: a biochemical and electrophysiological characterization. Journal of Neurochemistry. 138 (3), 384-396 (2016).
- Sanna, E., et al. Expression of native GABA(A) receptors in Xenopus oocytes injected with rat brain synaptosomes. Journal of Neurochemistry. 67 (5), 2212-2214 (1996).
- Sanna, E., et al. Functional changes in rat nigral GABA(A) receptors induced by degeneration of the striatonigral GABAergic pathway: An electrophysiological study of receptors incorporated into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 70 (6), 2539-2544 (1998).
- Sandoval, M., et al. Antagonistic effects of TrkB and p75NTR on NMDA receptor currents in post-synaptic densities transplanted into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 101 (6), 1672-1684 (2007).
- Perrais, D., Pinheiro, P. S., Jane, D. E., Mulle, C. Antagonism of recombinant and native GluK3-containing kainate receptors. Neuropharmacology. 56 (1), 131-140 (2009).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364 (6438), 355-362 (2019).
- Bröer, S.
- Newman, K., Aguero, T., King, M.
- Lin-Moshier, Y., Marchant, J. S. The Xenopus oocyte: A single-cell model for studying Ca2+ signaling. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (3), 185-191 (2013).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M.
- Eusebi, F., Palma, E., Amici, M., Miledi, R. Microtransplantation of ligand-gated receptor-channels from fresh or frozen nervous tissue into Xenopus oocytes: A potent tool for expanding functional information. Progress in Neurobiology. 88 (1), 32-40 (2009).
- Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 5224-5228 (1995).
- Cutting, G. R., et al. Cloning of the γ-aminobutyric acid (GABA) ρ1 cDNA: A GABA receptor subunit highly expressed in the retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (7), 2673-2677 (1991).
- Calvo, D. J., Vazquez, A. E., Miledi, R. Cationic modulation of ρ1-type γ-aminobutyrate receptors expressed in Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 12725-12729 (1994).
- Martínez-Torres, A., Miledi, R. Expression of γ-aminobutyric acid ρ1 and ρ1Δ450 as gene fusions with the green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 1947-1951 (2001).
- Ochoa-De La Paz, L. D., Estrada-Mondragón, A., Limón, A., Miledi, R., Martínez-Torres, A. Dopamine and serotonin modulate human GABAρ1 receptors expressed in Xenopus laevis oocytes. ACS Chemical Neuroscience. 3 (2), 96-104 (2012).
- Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Eusebi, F., Miledi, R. Properties of GluR3 receptors tagged with GFP at the amino or carboxyl terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (39), 15526-15530 (2007).
- C, S. N. A Rosetta stone for analysis of human membrane protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10641-10642 (2008).
- Eleonora, P., et al. GABAA-current rundown of temporal lobe epilepsy is associated with repetitive activation of GABAA "phasic" receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (52), 20944-20948 (2007).
- Bond, B. C., et al. The quantification of gene expression in an animal model of brain ischaemia using TaqManTM real-time RT-PCR. Molecular Brain Research. 106 (1-2), 101-116 (2002).
- Preece, P., Cairns, N. J. Quantifying mRNA in postmortem human brain: influence of gender, age at death, postmortem interval, brain pH, agonal state and inter-lobe mRNA variance. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 60-71 (2003).
- Preece, P., et al. An optimistic view for quantifying mRNA in post-mortem human brain. Molecular Brain Research. 116 (1-2), 7-16 (2003).
- Stan, A. D., et al. Human postmortem tissue: What quality markers matter. Brain Research. 1123 (1), 1-11 (2006).
- Scaduto, P., Sequeira, A., Vawter, M. P., Bunney, W., Limon, A. Preservation of global synaptic excitatory to inhibitory ratio during long postmortem intervals. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
- Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (11), 5224-5228 (1995).
- Le Mauff, A., et al. Nicotinic acetylcholine receptors in the synganglion of the tick Ixodes ricinus: Functional characterization using membrane microtransplantation. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 14, 144-151 (2020).
- Crespin, L., Legros, C., List, O., Tricoire-Leignel, H., Mattei, C. Injection of insect membrane in Xenopus oocyte: An original method for the pharmacological characterization of neonicotinoid insecticides. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 77, 10-16 (2016).
- Soualah, Z., et al. GABAA Receptor Subunit Composition Drives Its Sensitivity to the Insecticide Fipronil. Frontiers in Neuroscience. 15, 1-13 (2021).
- Symington, S. B., Murenzi, E., Toltin, A. C., Lansky, D., Clark, J. M. Realizing the potential: improving a microtransplantation assay based on neurolemma-injected Xenopus oocytes: an ex vivo approach to study ion channels in their native state. ACS Symposium Series. 1264, 53-73 (2017).
- Palma, E., et al. Microtransplantation of membranes from cultured cells to Xenopus oocytes: A method to study neurotransmitter receptors embedded in native lipids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2896-2900 (2003).
