Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Brug af enkeltormdata til at kvantificere heterogenitet i Caenorhabditis elegans-bakterielle interaktioner

Published: July 22, 2022 doi: 10.3791/64027
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Biology, Emory University, 2Department of Physics, Emory University

Summary

Denne protokol beskriver en 96-brønds forstyrrelse af individuelle bakterielt koloniserede Caenorhabditis elegans efter kold lammelse og overfladeblegning for at fjerne eksterne bakterier. Den resulterende suspension er belagt på agarplader for at muliggøre nøjagtig kvantificering af bakteriebelastningen i et stort antal individuelle orme.

Abstract

Nematoden Caenorhabditis elegans er et modelsystem for værtsmikrobe- og værtsmikrobiominteraktioner. Mange undersøgelser til dato bruger batchfordøjelser snarere end individuelle ormprøver til at kvantificere bakteriebelastning i denne organisme. Her hævdes det, at den store interindividuelle variabilitet, der ses i bakteriel kolonisering af C. elegans tarm, er informativ, og at batchfordøjelsesmetoder kasserer information, der er vigtig for nøjagtig sammenligning på tværs af betingelser. Da beskrivelsen af variationen i disse prøver kræver et stort antal individer, etableres en bekvem 96-brønds pladeprotokol til forstyrrelse og kolonibelægning af individuelle orme.

Introduction

Heterogenitet i værtsmikrobeforeninger observeres allestedsnærværende, og variation mellem individer anerkendes i stigende grad som en medvirkende faktor i processer på befolkningsniveau fra konkurrence og sameksistens1 til sygdomsoverførsel 2,3,4. I C. elegans er "skjult heterogenitet" inden for isogene populationer blevet observeret gentagne gange, hvor underpopulationer af individer viser forskellige fænotyper i varmechokrespons 5,6, aldring og levetid 7,8,9,10,11 og mange andre aspekter af fysiologi og udvikling12 . De fleste analyser, der forsøger at identificere subpopulationsstruktur, giver bevis for to underpopulationer i eksperimentelle populationer af isogene, synkroniserede orme 5,7,8, selvom andre data antyder muligheden for fordeling af træk inden for befolkningen snarere end forskellige grupper 7,12,13 . Af relevans her observeres betydelig heterogenitet i tarmpopulationer selv inden for isogene populationer af orme koloniseret fra en fælles kilde til mikrober 13,14,15,16, og denne heterogenitet kan skjules af batchfordøjelsesmålingerne, der er meget udbredt 17,18,19,20 til bakteriel kvantificering i ormen.

Dette arbejde præsenterer data, der tyder på et behov for større afhængighed af enkeltormmålinger i værtsmikrobeforening samt protokoller for at øge nøjagtigheden og gennemstrømningen i enkeltormforstyrrelse. Disse protokoller er designet til at lette mekanisk forstyrrelse af et stort antal individuelle C. elegans til kvantificering af levedygtig bakteriebelastning, samtidig med at de giver bedre repeterbarhed og lavere indsats pr. Prøve end pestlebaseret forstyrrelse af individuelle orme. Et anbefalet tarmrensningstrin, hvor orme får lov til at fodre med varmedræbt E. coli inden forberedelsen til afbrydelse, er inkluderet for at minimere bidrag fra nyligt indtagne og andre forbigående (ikke-klæbende) bakterier. Disse protokoller inkluderer en koldlammelsesmetode til rengøring af neglebåndet med en lavkoncentrationsoverfladeblegebehandling; overfladeblegning kan bruges som et forberedende trin i enkeltormforstyrrelse eller som en metode til fremstilling af levende, eksternt kimfrie orme. Denne overfladeblegningsmetode er tilstrækkelig til at fjerne en bred vifte af eksterne mikrober, og koldbehandling giver et alternativ til konventionel levamisolbaseret lammelse; mens levamisol vil blive foretrukket til koldfølsomme eksperimenter, minimerer koldlammelse bidrag til farlige affaldsstrømme og muliggør hurtig genoptagelse af normal aktivitet. Mens den fulde protokol beskriver et laboratorieforsøg, hvor orme koloniseres med kendte bakterier, kan procedurerne for rengøring af orme og enkeltormforstyrrelse let anvendes på orme isoleret fra vilde prøver eller koloniseret i mikrokosmoseksperimenter. De protokoller, der er beskrevet her, producerer levende bakterier ekstraheret fra ormtarmen, der er egnede til plettering og kvantificering af kolonidannende enheder (CFU'er) i individuelle orme; til sekventeringsbaseret analyse af tarmsamfundet bør efterfølgende cellelysis- og nukleinsyreekstraktionstrin tilføjes til disse protokoller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Orme, der blev brugt i disse eksperimenter, blev opnået fra Caenorhabditis Genetic Center, som finansieres af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Bristol N2 er vildtypen. DAF-2/IGF-mutanter daf-16(mu86) I (CGC CF1038) og daf-2(e1370) III (CGC CB1370) bruges til at illustrere forskelle i tarmbakteriebelastning.

HT115(DE3) E. coli , der bærer pos-1 RNAi-vektoren , er fra Ahringer-biblioteket21. MYb-samlingen af C. elegans indfødte tarmbakterier22 blev opnået fra Schulenburg-laboratoriet. Salmonella enterica LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR er fra dette laboratorium23. Pseudomonas mosselii blev isoleret i dette laboratorium. Staphylococcus aureus MSSA Newman pTRKH3-mGFP blev opnået fra LaRock-laboratoriet ved Emory University.

Alle ormebuffere og medier er fremstillet i henhold til tidligere offentliggjort litteratur24 med mindre ændringer (se supplerende fil 1).

1. Fremstilling af synkroniserede sterile C. elegans

BEMÆRK: I dette afsnit beskrives trinvise procedurer til generering af en synkroniseret population af reproduktivt sterile voksne orme. Fodring på pos-1 RNAi-plader bruges her for at forhindre produktion af afkom, fordi denne interferens er embryonal dødelig; L1 larver opdrættet til voksenalderen på pos-1 RNAi udvikler sig til æglæggende hermafroditter, men disse æg er misundelsesværdige25. RNAi-fodringsprotokollen er som i kapitlet "Omvendt genetik" i Wormbook26.

  1. Før du synkroniserer orme, skal du sørge for, at friske 10 cm NGM + pos-1 RNAi-plader er tilgængelige. Plader kan fremstilles friske fra koncentreret induceret væskekultur (+Amp +IPTG) eller podes som græsplæner på NGM + 100 μg/ml ampicillin + 1 mM IPTG og får lov til at vokse ved 25 °C i mørke i 1 dag27.
    BEMÆRK: Carbenicillin (25 μg / ml) bruges ofte i stedet for ampicillin på RNAi-plader. Ampicillin er billigere, men mindre stabil; hvis der anvendes ampicillin, skal pladerne straks tilsås, når de er tørre, og anvendes så hurtigt som muligt (kan opbevares i <1 uge ved 4 °C)27. Den høje antibiotikakoncentration, der anbefales her, hjælper med at sikre tilstrækkelig udvælgelse.
  2. Start med flere (typisk to til fire) NGM-plader med store populationer af gravide hermafroditter. Isoler æg ved hjælp af blegemiddel-NaOH-synkronisering24.
    1. Vask orme af agarplader med 2 ml steril ddH2O pr. Plade. Fordel væsken jævnt i 1,5 ml mikrocentrifugerør (et rør pr. Plade eller hermafroditter).
    2. Drej ned i ~ 5 s i en stationær minicentrifuge (2.000 x g) for at trække voksne til bunden af rørene. Pipetter supernatanten af og kassér.
    3. Vask med 1 ml steril ddH2O; spin ned som før og kassér supernatanten.
    4. Gentag det foregående trin for at reducere resterende bakterielt affald.
    5. Indholdet af hvert rør resuspenderes i 1 ml steril ddH2O. Der tilsættes til hvert rør 130 μL kommercielt blegemiddel (8,25% natriumhypochlorit) og 130 μL 5 N natriumhydroxid (NaOH, slutkoncentration 0,5 N).
    6. Vortex rør kraftigt i mindst 10-15 s hvert 2. minut, indtil voksne kroppe er brudt op. Lad ikke blegemiddel-NaOH-behandling gå længere end 5 minutter for at undgå at dræbe æg.
    7. Spin i en minicentrifuge i 30-60 s ved 2.000 x g for at pelletere æggene. Pipetter supernatanten af og kassér. Der kan eller måske ikke være en synlig pellet, dette er normalt.
    8. Tilsæt 1 ml M9 ormbuffer og spin i 30-60 s ved 2000 x g. Kassér supernatanten.
    9. Skylningstrinnet (1.2.8) gentages 5x for grundigt at fjerne blegemiddel-NaOH-blandingen, og fjern så meget af supernatanten som muligt uden at forstyrre ægpillen.
    10. Overfør æg til 10 ml M9 ormbuffer i et 50 ml konisk rør eller 30 ml kulturrør med hætte. Hvis du bruger koniske rør, skal du lade låget skrue let af og bruge lidt tape for at holde det sikkert. Der inkuberes med omrystning natten over (16 timer) ved 25 °C og 200 o/min, så larverne kan klække.
  3. Overfør synkroniserede L1 larver til RNAi-plader for at vokse til voksenalderen.
    1. Tilsæt 2 ml steril M9-buffer + 0,01% Triton X-100 (fremover M9TX-01) til hvert L1-rør, og overfør hele volumenet (12 ml) til et 15 ml skrue-top konisk rør.
    2. Placer 15 ml rør med L1 orme ved 4 ° C i 10 minutter for at bremse larvebevægelsen.
    3. 15 ml koniske rør spinnes ned i en stor bordcentrifuge (1.500 x g ved 4 °C i 3 minutter; acceleration og deceleration bør ikke være højere end 80 % af maksimum).
    4. Pipetter forsigtigt supernatanten af uden at forstyrre L1-pelleten. Kassér supernatanten.
    5. Tilsæt 12 ml kold M9TX-01 til hvert rør. Gentag centrifugeringen. Pipetter forsigtigt af og kassér supernatanten. Hvert rør skal have ~ 200 μL tilbage.
    6. Skyl en 200 μL pipettespids i M9TX-01 for at forhindre orme i at klæbe til plasten, og brug derefter denne spids til at genbruge ormepillen. Overfør resuspenderede orme til forberedte pos-1 plader ved pipettering af dråber væske på bakterieplænen.
    7. Pladerne inkuberes ved 25 °C indtil den første dag i voksenalderen.
      BEMÆRK: Hvis der vokser orme på pos-1 RNAi-plader, SKAL orme fodre ad libitum på RNAi-bakterierne, indtil de er fuldt overgået til voksenalderen for at sikre høj penetrans af den embryonale-dødelige fænotype. Kontroller pladerne ved 24 og 48 timer. Hvis pladerne ser ud til at være sultne eller næsten sultne, skal ormene flyttes til friske plader for at vokse til voksne i fuld størrelse. For at undgå udtømning af plader, før orme dyrkes, skal du sigte mod at tilføje 250-500 L1 larver til hver 10 cm RNAi-plade.
  4. Høst voksne og klar intestinal E. coli for at skabe kimfrie orme.
    1. Skyl voksne orme fra plader med 5 ml M9TX-01 pr. Plade. Overfør buffer + orme til et 15 ml konisk rør og lad voksne slå sig ned til bunden af røret.
    2. Skyl voksne i ændringer på 10 ml frisk M9TX-01 buffer, indtil der ikke er nogen synlig bakteriel turbiditet tilbage (typisk 1-2x). Rør kan centrifugeres ved 700 x g i 30 s til pelletorme, eller voksne kan få lov til at slå sig ned ved tyngdekraften.
    3. Udfør en ekstra vask med 10 ml M9TX-01 for at reducere eksterne bakterier.
    4. Overfør orme til 50 ml koniske rør eller 30 ml kulturrør indeholdende 5 ml S Medium + 2x varmedræbt E. coli OP50 (~ 5 x 109 dræbte celler / ml) + 200 μg / ml gentamycin + 50 μg / ml chloramphenicol. Hvis du bruger koniske rør, skal du lade låget skrue let af og bruge lidt tape for at holde det sikkert. Brug glaspipetter eller skyl plastpipetter i M9TX-01 for at forhindre ormene i at klæbe fast.
    5. Inkuber voksne ved 25 °C med omrystning ved 200 o / min i 24-48 timer for at producere kimfrie voksne.
      BEMÆRK: Hvis ormene skal forblive i antibiotika i >24 timer, skal der muligvis tilsættes mere varmedræbt OP50 for at sikre, at ormene har en tilstrækkelig fødekilde. Kontroller rør ved 24 timer og suppler med varmedræbt OP50, hvis turbiditeten er synligt reduceret.
  5. Saccharose vasker voksne i henhold til Wormbook-protokollerne24 for at opnå rene, reproduktivt sterile, synkroniserede lagre kun for voksne til bakteriel kolonisering.
    1. Sørg for, at kolde mængder af 60% saccharose, M9 ormbuffer og M9TX-01 er klar til brug. For nemheds skyld kan disse efterlades ved 4 °C natten før.
    2. For hver prøve, der skal vaskes, skal du oprette et mærket 15 ml konisk rør indeholdende 8 ml M9TX-01 og sætte det til side på is. Disse vil være nødvendige i trin 1.5.10.
    3. Der tilsættes 5 ml M9TX-01 til hvert 50 ml rør indeholdende L1 larver. Overfør hele volumenet (nu 10 ml) til et tomt 15 ml skrue-top konisk rør og lad voksne sætte sig til bunden af røret.
    4. Pipetter forsigtigt supernatanten af og kassér.
    5. Tilsæt 10 ml M9TX-01 til hvert rør og flyt rør til en isspand i 5-10 min.
      BEMÆRK: Fra dette tidspunkt skal orme og alle buffere opbevares på is.
    6. Brug indstillingen "fast temp" til at afkøle en stor bordcentrifuge til 4 °C.
    7. Tilsæt 10 ml kold M9TX-01 til hvert rør for at skylle eventuelt resterende snavs af. Lad orme slå sig ned på is; fjern supernatanten og kassér.
    8. Saccharose float: Tilsæt 5 ml kold M9 buffer og 5 ml kold 60% saccharoseopløsning til hvert rør, bland grundigt. Derefter flyder forsigtigt 1 ml kold M9-buffer oven på saccharose-bufferblandingen i hvert rør. Bland ikke, efter at flyderen er blevet tilsat.
      FORSIGTIG: Gå hurtigt i de næste par trin - orme kan tørre, hvis de udsættes for høje koncentrationer af saccharose for længe!
    9. Centrifuger ved 1500 x g i 3 minutter ved 4 °C. Levende voksne orme vil være ved grænsefladen mellem M9 og saccharose, ca. 1 ml fra toppen af røret.
    10. Brug en glas 5 ml serologisk pipette til at overføre ormlaget til fremstillede 15 ml koniske rør med kold M9TX-01 (fra trin 1.5.2). Vær meget forsigtig med at få laget af levende orme uden at pipettere for meget af saccharosen.
    11. Tilsæt om nødvendigt M9TX-01 for at få lige store mængder på 10-12 ml / rør. Centrifuger ved 1500 x g ved 4 °C i 1 minut, og pipetter derefter supernatanten af. Orme kan returneres til stuetemperatur på dette tidspunkt.
    12. Vasketrin 1.5.11 gentages to gange, og hastigheden reduceres til 700 x g ved 4 °C og tiden til 30 s.

2. Fodring af orme på levende bakterier i flydende kultur

BEMÆRK: Denne protokol bruges til at kolonisere orme med laboratoriedyrkede bakterier under velblandede forhold i flydende kultur (supplerende figur 1). Orme kan koloniseres med individuelle isolater fra ren kultur (f.eks. patogener såsom Enterococcus faecium28,29) eller blandinger af isolater (f.eks. minimale mikrobiomsamfund14).

  1. Start med saccharosevaskede synkroniserede voksne orme fra protokoltrin 1,5 i et 15 ml konisk rør. Vask ormene en gang i 12 ml S-buffer og kassér supernatanten.
  2. Resuspend de vaskede orme i det volumen af S-medium, der er nødvendigt for eksperimentet. Overvej mængden af eksperimentelle betingelser, antallet af betingelser, over hvilke orme vil blive splittet, og de endelige koncentrationer af orme og bakterier.
    BEMÆRK: Fodring i orme varierer med bakteriel tilgængelighed30 , og orme kan blive stresset ved trængsel31. Til kolonisering i flydende kultur anbefales <1000 orme / ml og >10 7 CFU / ml; 1011 CFU/ml betragtes som "ad libitum" fodertæthed på E. coli32.
  3. Spin ned bakteriekulturer. Hæld supernatanten af; aspiration eller pipettering kan bruges til at fjerne supernatanten for bakterier, der danner løse pellets.
    BEMÆRK: For kulturer >5 ml overføres til 15 ml rør og drejes ved ~ 2800 x g i en stor bordpladecentrifuge i 8-10 min. Kulturer <5 ml kan overføres til 1,5 ml rør og centrifugeres ved 9000 x g i 1-2 min i en lille bordpladecentrifuge. Meget bevægelige bakterier (f.eks. mange arter af Pseudomonas) skal muligvis køles ved 4 ° C i 10-15 minutter for at lette dannelsen af en stabil pellet, og det kan være bedre at centrifugere ved 4 ° C.
  4. Resuspend bakteriekulturer i et volumen S-buffer og centrifuger igen til pellet. Fjern og kassér supernatanten som før.
  5. Resuspend bakteriekulturer i S-medium ved den ønskede tæthed for eksperimentet plus eventuelle antibiotika til udvælgelse. De antibiotika, der eventuelt skal anvendes, afhænger af resistensprofilen for de bakterier, der anvendes til kolonisering.
  6. Brug en pipettespids belagt med M9TX-01 til forsigtigt at pipettere orme op og ned, indtil ormene er grundigt resuspenderet i S-medium, og overfør derefter til rør eller pladebrønde til bakteriel kolonisering.
  7. Tilsæt bakteriel suspension til hver ormkultur for at nå den ønskede bakteriekoncentration og endelige volumen.
  8. Hvis du bruger en multi-well plade til kolonisering, skal du dække pladen med en steril 96-brønd gasgennemtrængelig tætningsmembran.
  9. Inkuberes med omrystning ved 200 o / min for at forhindre bakterier i at sætte sig under inkubation.

3. Mekanisk forstyrrelse af individuelle orme i et 96-brøndformat

BEMÆRK: Dette afsnit beskriver en 96-brønds pladeformatprotokol til mekanisk forstyrrelse af individuelle bakterielt koloniserede C. elegans. De første trin i protokollen (3.1-3.8) beskriver en metode til rensning af ikke-klæbende bakterier fra ormtarmen og rengøring af ormenes ydre ved hjælp af kold lammelse og overfladeblegning. Disse trin vil producere rene, levende voksne orme, der kan forstyrres mekanisk til kvantificering af bakterieindhold (3,8-ende) eller bruges til yderligere forsøg (supplerende figur 1). Denne protokol kan tilpasses til at kvantificere bakterier i orme koloniseret i flydende kultur (afsnit 2), på agarplader eller fra naturlig eller mikrokosmos jord.

  1. Anbring en aliquot af M9TX-01 på is for at afkøle (4-5x antallet af prøver i ml).
  2. Der fremstilles en aliquot M9TX-01 + blegemiddel (6% natriumhypochlorit, 1:1000 eller 1:2000 v/v, 1 ml pr. prøve + 1 ml ekstra) og anbringes på is for at afkøle. Denne aliquot vil blive brugt i trin 3.8.
  3. Forbered 96-brønds plader til seriel fortynding af forstyrrede ormprøver.
    1. Få sterile 300 μL kapacitet 96-brønd plader med låg; denne protokol bruger en fortyndingsplade pr. 12 fordøjede orme.
    2. Brug en 96-brønd multikanal pipettor til at fylde rækker B-D af hver 96 brøndplade (300 μL kapacitet) med 180 μL 1x PBS buffer. Lad den øverste række være tom. Rækker B-D bliver 10x serielle fortyndinger af ormfordøjelserne [0,1x, 0,01x, 0,01x].
    3. Sæt plader til side. Fortyndingsplader anvendes i trin 3.13.
  4. Resuspend hver ormprøve i 1 ml M9TX-01 i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  5. Spinrør kortvarigt (2-3 s) i en minicentrifuge med lav hastighed (2.000 x g) ved 25 °C til voksne pellets. Pipetter supernatanten af og kassér, og sørg for ikke at forstyrre ormepillen.
  6. Brug centrifugeringsindstillingerne i trin 3.5 til at skylle orme to gange med 1 ml M9TX-01 og derefter en gang med 1 ml M9-ormbuffer for at reducere eksterne bakterier.
  7. Rens ikke-klæbende bakterier fra ormen tarm.
    1. Resuspend hver prøve af orme i 1 ml S-medium + 2x varmedræbt OP50 i et kulturrør.
    2. Inkuberes ved 25 °C i 20-30 minutter for at tillade passage af ikke-klæbende bakterier fra tarmen.
      BEMÆRK: Dette vil også rense ethvert ekstracellulært fluorescerende protein fra lumen og muliggøre klarere visualisering af mærkede bakterier, der er klæbet til tarmepitelet, især når syrefaste fluoroforer (f.eks. mCherry, dsRed) anvendes.
  8. Overflade blegemiddel orme til at rydde eksterne bakterier.
    1. Skyl rensede orme to gange med 1 ml kold M9TX-01 og kassér supernatanten.
    2. Lad rørene køle af i 10 minutter på is (foretrækkes) eller ved 4 °C. Dette vil lamme orme og forhindre indtagelse af blegemiddel.
      BEMÆRK: Andre protokoller bruger et kemisk lammelsesmiddel såsom levamisol; Dette er en etableret tilgang33 , som kræver tilføjelse af en strøm af farligt affald.
    3. Tilsæt 1 ml iskold M9-ormbuffer + uparfumeret blegemiddel (8,25% natriumhydroxid, 1:1000 eller 1:2000 v/v) til hvert rør. Lad rør sidde på is (foretrækkes) eller ved 4 ° C i mindst 10 minutter for at dræbe eksterne bakterier.
      BEMÆRK: Overskrid ikke 1:1000 koncentration af blegemiddel. Selv i lammede orme kan dødelighed resultere.
    4. Pipetter blegebufferen af og kasseres; returrør til is for at sikre, at orme ikke genoptager pumpning, før blegemiddel er ryddet.
    5. Tilsæt 1 ml kold M9TX-01 til hvert rør. Spin i ~ 5 s i en minicentrifuge (2.000 x g ved 25 ° C); returrør til is. Fjern supernatanten og kassér.
    6. Gentag dette skylletrin med yderligere 1 ml kold M9TX-01, og kassér så meget af supernatanten som muligt.
      BEMÆRK: Hvis du bruger orme til yderligere forsøg, skal du springe permeabiliseringstrinnet over (protokol 3.9) og i stedet overføre friskfælgede voksne til iskold buffer i en 6 cm petriskål og adskille orme til eksperimentelle forhold som i protokol 3.10. Hold orme kolde for at forhindre bevægelighed i at genoptage, men arbejd hurtigt - at holde orme i >30 minutter på is kan potentielt resultere i <100% genoptagelse af normal aktivitet34.
  9. Kemisk permeabilisering af ormekostik med natriumdodecylsulfat og dithiothrietol (0,25% SDS + 300 mM DTT) (baseret på35)
    FORSIGTIG: DTT er et reduktionsmiddel og irriterende. Brug PPE og arbejd i en røghætte, når du håndterer tørre lagre eller opløsninger. Der kræves en strøm af farligt affald.
    1. I røghætten fremstilles tilstrækkelig SDS/DTT-opløsning til at tillade 100 μL for hver prøve. For 1 ml tilsættes 5 μL 5 μL M9 dl M9-ormbuffer eller M9TX-01 i et 1,5 ml mikrocentrifugerør 5 μL 5% (w/v) SDS og 30 μL 1M DTT.
      BEMÆRK: 1 M DTT-opløsning (vandig) skal tilberedes frisk eller opbevares i alikvoter ved -20 °C for at sikre styrken. Aliquots bør dimensioneres til at blive brugt op i to til tre forsøg for at undgå overdreven fryse-optøning cykling.
    2. Flyt mikrocentrifugerør indeholdende overfladeblegede orme til et rørstativ ved stuetemperatur. Hvert rør skal indeholde orme i ~ 20 μL buffer.
    3. Der tilsættes 100 μL SDS/DTT-opløsning til hver ormprøve. Bortskaf eventuelle resterende SDS/DTT-opløsninger i den relevante strøm af farligt affald.
    4. Lad behandlingen fortsætte i op til 8 minutter på bænken for delvist at nedbryde den resistente neglebånd af de voksne orme. Orme vil dø og slå sig ned til bunden af røret i løbet af denne tid.
    5. Når permeabiliseringstiden er gået, pipetteres SDS/DTT-supernatanten forsigtigt af og bortskaffes i en passende SDS/DTT-strøm af farligt affald.
    6. Tilsæt 1 ml M9TX-01 til hvert rør. Drej kortvarigt i en bordcentrifuge for at pelletere ormene eller lade ormene sætte sig ved tyngdekraften til bunden af rørene, træk derefter supernatanten af og bortskaf i en SDS / DTT-strøm af farligt affald.
    7. Resuspend orme i 1 ml M9 ormbuffer + 0,1% Triton X-100, indtil de er klar til brug.
  10. Adskil orme i en dyb 96-brøndplade med siliciumcarbidkorn til mekanisk forstyrrelse. Forbered 96-brønds afbrydelsespladen som under.
    1. Få en steril 2 ml dybbrønd 96-brønd plade og et matchende silicium 96-brønd pladedæksel.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge plader, der er kompatible med 96-brøndadapterne til vævsforstyrrende. Små forskelle i eksterne dimensioner gør forskellen mellem en plade, der kan fjernes fra adapterne, og en, der ikke kan.
    2. Brug en steril scoop spatel til at tilsætte en lille mængde sterilt 36-gryn siliciumcarbid til hver brønd på pladen, der modtager en orm. Brug nok grus til næppe at dække bunden af brønden (ca. 0,2 g pr. Brønd). Overdreven materiale vil gøre det vanskeligt at få en pipettespids til bunden af brønden, når indholdet hentes.
    3. Tilsæt 180 μL M9 ormbuffer til hver brønd.
    4. Mærk kolonnerne eller rækkerne for at angive, hvor hver prøve vil gå, og dæk derefter pladen løst med silicium 96-brøndpladedækslet.
  11. Overfør individuelle orme til 96-brøndpladen for forstyrrelse.
    1. Flyt permeabiliserede orme omhyggeligt til en lille (35 eller 60 mm) petriskål indeholdende tilstrækkelig M9TX-01 til at fylde skålen til en dybde på ~ 1 cm.
      BEMÆRK: Hvis der er et stort antal orme til stede, er det muligvis ikke muligt at overføre hele prøven, da væsken bliver overfyldt, og det vil være vanskeligt at pipettere individuelle orme.
    2. Brug et dissekeringsmikroskop eller en anden lavforstørrelsesanordning til at pipettere individuelle orme i 20 μL volumener og overføre disse orme til individuelle brønde i pladen med 96 brønde.
      BEMÆRK: Det er bedst at høste kun frisk dræbte orme. Undgå orme med en stiv lineær form, da disse orme kan have været døde i nogen tid. Prøv at tage orme, der er buede eller S-formede, med normal grov fysiologi og en intakt tarm.
    3. Efter overførsel af hvert volumen skal du sørge for, at den valgte orm faktisk blev skubbet ud i brønden. For at gøre dette pipetteres 20 μL M9TX-01 fra et klart område af petriskålen og frigiver det fulde volumen tilbage i skålen; dette vil normalt skubbe ormen ud, hvis den sidder fast på pipetten. Hvis ormen sad fast, skal du fjerne 20 μL fra brønden og prøve overførslen igen.
    4. Når alle orme er overført, skal du dække pladen med 96 brønde med et ark kommercielt tilgængelig fleksibel papirbagt tætningsfilm (2 x 2 firkanter) og sørge for, at den papirbagte side af tætningsfilmen vender nedad på prøvebrøndene. Pas på ikke at strække tætningsfilmen for tynd, ellers vil det være meget vanskeligt at fjerne senere.
    5. Placer siliciumforseglingsmåtten let oven på den fleksible tætningsfilm; Tryk ikke dækslet ned i brøndene på dette tidspunkt.
    6. Flyt pladen til 4 °C for at køle af i 30-60 min. Dette forhindrer overophedning under afbrydelse, hvilket kan beskadige prøverne.
      BEMÆRK: Dette er et brudpunkt i protokollen. I de fleste tilfælde kan pladen efterlades ved 4 ° C i op til 4 timer før slibning. Forlad ikke ormene natten over, da dette vil ændre bakterietællingerne.
  12. Læg 96-brøndplader på en vævsforstyrrende for at bryde ormvæv op og frigive tarmbakterier.
    BEMÆRK: (Valgfrit) Hvis du bruger et ulige antal 96-brøndplader til fordøjelser, er det nødvendigt at forberede en modvægt, inden du fortsætter. Brug en tom dyb 96-brøndplade og fyld brønde med vand, indtil den vejer det samme som den første plade.
    1. Tryk siliciumforseglingsmåtten fast ned i brøndene for at skabe en tætning, og sørg for, at låget ligger fladt over hele overfladen af pladen.
      BEMÆRK: Hvis den fleksible tætningsfilm er for tyk efter strækning, vil det være vanskeligt at fastgøre siliciumlåget, så det ligger fladt i alle brønde. Dette vil resultere i en utilstrækkelig tætning og godt-til-godt forurening under omrystning.
    2. Fastgør plader i vævsforstyrrende ved hjælp af 96-brønd pladeadaptere. Ryst pladerne i 1 min ved 30 Hz, drej derefter pladerne 180° og ryst igen i 1 min. Dette vil hjælpe med at sikre jævn forstyrrelse i alle brønde på pladen.
    3. Bank pladerne fast på bænken to eller tre gange for at løsne alt grus fra den fleksible tætningsfilm.
    4. Brug en stor centrifuge med to 96-brønds pladeadaptere til at dreje pladerne ned ved 2400 x g i 2 minutter for at samle alt materiale til bunden af brøndene.
    5. Fjern siliciumlåget, og træk forsigtigt den fleksible tætningsfilm af.
      BEMÆRK: Hvis den fleksible tætningsfilm klæber i en af brøndene, skal du bruge en 200 μL pipettespids til at fjerne den. Dette er almindeligt, når den fleksible tætningsfilm blev strakt for tynd.
  13. Serielt fortyndet orm fordøje prøver i 300 μL i 96-brønd plader.
    1. Brug en multi-well pipettor indstillet til 200 μL, pipetter op og ned flere gange langsomt og omhyggeligt for at blande indholdet af brøndene igen og træk derefter så meget af væsken som muligt. Denne væske overføres til de øverste rækker af pladerne med 96 brønde, der er fremstillet i trin 3.3.
    2. Brug en 96-brønd pipettor indstillet til 20 μL, fjern dette volumen væske fra den øverste række og dispenser i række B. Pipetter op og ned 8-10x for at blande. Kassér tips.
    3. Trin 3.13.2 gentages startende fra 0,1x-prøverne i række B for at skabe 0,01x fortyndingsprøver i række C.
    4. Gentag trin 3.13.2 igen, og gå fra række C til række D.
    5. Plade på fast agar til bakteriel kvantificering. For monokoloniserede orme er det generelt tilstrækkeligt at plade 10-20 μL dråber af hver fortynding [1x-0,001x] på agarplader. Til kolonisering af flere arter skal hver fortynding mærkes separat ved pipettering af 100 μL på en 10 cm agarplade; spredes straks ved hjælp af glasplader.

4. Rengøring af siliciumcarbidkorn til genbrug

BEMÆRK: Denne procedure bruges til at rengøre og sterilisere slibematerialet, siliciumcarbidkorn, til genbrug efter forsøg. Denne protokol bør følges i sin helhed inden første brug, da siliciumcarbidkorn er et industriprodukt og ikke kommer præsteriliseret. Si-hårdmetalkorn (3,2 g/cc) er et tæt, rukantet materiale, der arbejder effektivt for at forstyrre hårde prøver. Partiklerne kan dog slides ned ved gentagen brug og bør udskiftes, når slid bliver tydeligt. Heldigvis er materialet billigt, og de størrelser, der typisk sælges (~ 1 lb), er tilstrækkelige til mange eksperimenter.

  1. Efter fjernelse af prøver til plettering tilsættes 10% blegemiddelopløsning til alle brønde i pladen med 96 brønde og lad sidde i mindst 10 minutter.
  2. Fjern størstedelen af gruset ved hurtigt at vende pladen med 96 brønde over en lille højsidet bakke eller en tom P1000 pipettespidsbeholder, der er stor nok til at fange alt indholdet. Gruset synker straks til bunden af bakken. Hæld blegemiddelopløsningen af i en vask.
  3. Fyld pladen med 96 brønde igen med postevand, og vend den i den samme bakke for at skylle det resterende grus ud. Hæld vandet ud i vasken.
  4. Gentag en til tre gange mere med ledningsvand, indtil pladen er helt fri for grus.
  5. Skyl grus 2x i ledningsvand, og fyld bakken hver gang.
    BEMÆRK: Den 96-brønd dybe brøndplade kan vaskes i en laboratorieopvaskemaskine, dækkes sikkert med folie og autoklaveres med anden genanvendelig plast. Grus behøver ikke vaskes med det samme og kan afsættes på dette tidspunkt. Brugt grus akkumuleres normalt fra flere eksperimenter før vask og autoklavering.
  6. Vask grus i en opløsning af laboratorievaskemiddel i 30 minutter, omrør lejlighedsvis ved at hvirvle eller blande med en metalspatula.
  7. Skyl alle spor af vaskemiddel væk i flere (8-10) skift af ledningsvand, skyll derefter 2x med destilleret vand.
  8. Spred grus i en åben bakke, såsom en lav polypropylen autoklavebakke, og tør ved 40-70 ° C i flere timer.
    BEMÆRK: Hvis gruset er klumpet, når det er tørt, blev det ikke rengjort eller skyllet tilstrækkeligt. Rengøringsprotokollen gentages fra trin 4.6, og der tilføjes yderligere skylninger i trin 4.7.
  9. Fordel rent, tørt grus i autoklaverbare glasflasker med skruetop til en maksimal dybde på 5-6 cm. Autoklave på forvakuumcyklus i 30 minutter for at sterilisere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Blegestilisering af levende orme
Overfladeblegede orme er effektivt fri for eksterne bakterier, indtil bevægeligheden vender tilbage, og udskillelsen genoptages. Under de betingelser, der anvendes her, observeres hurtig udryddelse af bakterier i buffer (figur 1A-C, supplerende figur 2, video 1) uden at forstyrre de tarmassocierede bakterier i koldlammede orme (figur 1D-F, video 2). Disse data indikerer, at overfladeblegning kan bruges effektivt til at desinficere orme eksternt uden at gå på kompromis med tarmindholdet (sammenligninger af overfladeblegede vs. no-bleach ormassocierede CFU-tal er ikke-signifikante, Wilcoxon rank-sum test p > 0,05).

Variationer af mekanisk forstyrrelse med flere prøver
96-brønds teknikken til mekanisk forstyrrelse af orme er robust over for de specifikke anvendte materialer, og praktiske overvejelser dikterer valget af slibemateriale. I lighed med en tidligere rapport33 resulterede manuel forstyrrelse (figur 2A) i mere heterogenitet end standardprotokollen med 96 brønde (siliciumcarbidkorn, figur 2B) (var (log10CFU) = 0,499) på tværs af alle bufferbetingelser sammenlignet med 0,229 for Si-hårdmetal, 0,243 for store glasperler (figur 2C) og 0,227 for små glasperler (figur 2D ). Ikke desto mindre var de fleste forskelle i CFU/ormfordelinger ikke signifikante (Kruskal-Wallace, p = 0,017 med df = 3; signifikante post-hoc Wilcoxon-tests for store perler vs. små perler, p = 0,021, og store perler vs. siliciumcarbidkorn, p = 0,02). Anvendelsen af Triton X-100 som overfladeaktivt stof var ikke forbundet med nogen signifikant forskel i udbytte, når det betragtes som en individuel faktor (Kruskal-Wallace, p = 0,94, df = 3), selv om der er en tilsyneladende stigning i udbyttet i prøver uden Triton vs. Triton, når der blev anvendt store perler (2,7 mm), hvilket muligvis kan tilskrives den overdrevne "skumdannelse", der blev observeret i disse brønde, da Triton var til stede. Disse resultater indikerer, at store glasperler, selvom de er ideelle til brug i homogeniseringsrør33, ikke er egnede til 96-brønds teknikken. Mens små glasperler gav rimelige resultater (figur 2D), tilstoppede de konsekvent 200 μL pipettespidser under blanding og plettering. Standardmaterialet i dette assay, siliciumcarbidkorn, er billigt, for stort til at tilstoppe standardspidser, og ligesom glasperler kan vaskes og genbruges efter autoklavering. Gruset frigiver en lille mængde "støv" i bufferen, som ikke forstyrrer plettering, men skal filtreres fra, hvis forstyrrelsesprodukterne skal bruges til flowcytometri.

Heterogenitet i bakteriel kolonisering hos voksne orme
Vellykket forstyrrelse af individuelle orme afslører heterogenitet i bakteriel kolonisering. Personer fra isogene synkroniserede populationer af orme, koloniseret på samme tid på samme bakteriepulje, viser konsekvent 100 gange eller større rækkevidde i tarmbakteriebelastning. Dette observeres for forskellige bakterielle kolonister (figur 3A) og under kolonisering på bakteriesamfund med flere arter (figur 3B). Denne heterogenitet er også tydelig i individuelle ormmålinger af fluorescens, når orme koloniseres med bakterier, der udtrykker et fluorescerende protein (GFP) (figur 3C-D). Værtens egenskaber spiller en rolle i udformningen af denne heterogenitet, som det kan ses ved at sammenligne kolonisering af vildtype Bristol N2 orme med kolonisering af de samme bakterier i DAF-2 / IGF-mutanter; denne daf-16 mutant understøtter større populationer af mange bakterier sammenlignet med N2, mens daf-2 er resistent over for kolonisering af en række bakterier36 (figur 3B, D). Denne heterogenitet er karakteristisk og viser variation på tværs af forskellige kombinationer af vært og kolonist (er), samtidig med at den bevarer en konsistent struktur over forskellige kørsler af det samme eksperiment (figur 3E-F).

Betydningen af individuel heterogenitet for nøjagtig sammenligning af grupper
Betydningen af individuel heterogenitet kan let ses ved at overveje, hvordan batchfordøjelser kan ændre fordelingen af data. Kolonisering af indfødte mikrobiombakterier MYb53 (Rhodococcus erythropolis) og MYb120 (Chryseobacteria spp.) (Figur 3A, 4A) hos N2 voksne bruges som eksempler. De enkelte ormdata er klart ens i fordeling (to-tailed t-test, p = 0,9, Wilcoxon rank sum, p = 0,59). Ved resampling af disse data for at simulere virkningerne af batchfordøjelser trækker den batch ekstrapolerede CFU/orm mod de øverste kvantiler af dataene på grund af den positive skævhed i disse fordelinger (gennemsnitlig > medianen). Da batching effektivt gennemsnit over individerne i en batch, vil batch-ekstrapoleret CFU / orm centrere sig omkring det aritmetiske gennemsnit af de enkelte data med faldende afstand til dette middel, da batcher bliver store i henhold til den centrale grænsesætning (figur 4B-D). Følgelig går signalet fra biologisk variation hurtigt tabt; batch-udledte CFU/ormmålinger konvergerer mod gennemsnittet, som ikke er en repræsentativ metrik for disse log-skala-distribuerede data. Forskelle i udledt kolonisering af MYb53 vs. MYb120 bliver hurtigt signifikante i simulerede batchfordøjelser (t-testbatch 5, p = 0,049; batch 10, p = 2,27e-4; batch 20, p = 1,19e-15; Wilcoxon rang sum test batch 5, p = 2,27e-4; batch 10, p = 2,70e-06; batch 20, p = 1,80e-09), da det oprindelige signal er skjult.

Virkninger af individuel heterogenitet på mikrobiel transmission
Da individuelle orme viser betydelig heterogenitet i bakteriel kolonisering, er det rimeligt at spørge, om denne heterogenitet har nedstrøms virkninger. For eksempel er det rimeligt at forvente, at transmission kan være en funktion af tarmbakteriebelastningen. Ved at overføre individuelle overfladeblegede orme til et rent miljø er det muligt at observere podning af miljøet med udskilte levende bakterier. I disse forsøg fik overfladeblegede prækoloniserede voksne, der generelt havde betydelige populationer (103-10 5 CFU/orm, figur 5) af kommensal Ochrobactrum MYb14-GFP eller patogen S. aureus-GFP, lov til at strejfe på varmedræbte OP50-græsplæner på NGM-agar i 1,5 time. Når disse orme genhøstes fra udskillelsesplader og forstyrres til bakteriel kvantificering, er der ingen signifikant sammenhæng mellem bakteriebelastning og udskillelseshastighed for levende bakterier (Pearson-korrelationer mellem logtransformerede kolonier / time og CFU / orm: MYb14 rho = 0,19, p = 0,45; S. aureus rho = 0,02, p = 0,9) (figur 5). Der er heller ikke en signifikant sammenhæng mellem tilstedeværelsen/fraværet af kolonier på en plade og tarmbakteriebelastningen (binomial logistisk regression med logtransformeret CFU/orm som faktor: p = 0,15 med df = 53). En betydelig del af pladerne forblev fri for ny vækst (9/18 plader for MYb14, 10/36 plader for S. aureus), hvilket indikerer lave samlede udskillelseshastigheder.

Når orme får lov til at udskille på agarplader, er det faktiske antal levende udskillede bakterier pr. orm forvirret af "landbrug", hvor orme passerer gennem kolonier og skaber spor af ny vækst (figur 6)37. En plade med n kolonier repræsenterer mindst en og højst n begivenheder, hvor levende kolonidannende bakterier blev udskilt. Fra denne observation er det ikke muligt at vide, hvor mange udskillelseshændelser i (1,n) der faktisk forekom, og det er heller ikke muligt at vide, hvor mange bakterier der blev udskilt i hver begivenhed. Det er derfor ikke muligt præcist at estimere udskillelseshastigheden af levende bakterier fra tarmen ved hjælp af disse data. Det er dog muligt at udlede nogle grænser. Selv om antallet af kolonier pr. plade ikke er særlig informativt, kan data om tilstedeværelse/fravær anvendes til grov slutning af udskillelseshastigheder. For nemheds skyld, hvis det antages, at udskillelseshastigheden af levende bakterier ikke er en funktion af bakteriebelastningen, og at udskillelse er en Poisson-proces, er der en ~ 50% chance for at observere mindst ni hændelser i 18 forsøg, når λ ≈ 0,33 orm-1 time-1 i MYb14. For S. aureus opnås lignende plausible hastigheder på λ ≈ 0,2 orm-1 time-1 . Mens disse grove beregninger tyder på lave udskillelseshastigheder af levende bakterier, vil mere præcis kvantificering af denne proces over et større antal individuelle orme være nødvendig for at opnå pålidelige estimater.

Data tilgængelighed:
Data vist her er tilgængelige på Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.7wm37pvw2).

Figure 1
Figur 1. Overfladeblegningsbehandling med lav koncentration dræber hurtigt bakterier i buffer, men forstyrrer ikke tarmsamfund i koldlammede orme. (A-C) Bakteriel CFU/ml i M9-ormebuffer under overfladeblegning i tre forskellige koncentrationer (1:1000, 1:2000, 1:5000 v/v; ubleget kontrol til sammenligning), målretning (A) S. aureus Newman, (B) S. enterica LT2 eller (C) E. coli OP50. Prøver blev taget på angivne tidspunkter op til 20 minutter efter eksponering og vasket to gange med steril buffer for at forhindre blegemiddel i at dræbe kolonier på plader. Data for 1:1000-betingelsen er forskudt en smule, så disse data er synlige på plottet. (D-F) Tarmbakterier i individuelle N2-orme (n = 24 orme pr. Forsøg, to eller tre uafhængige kørsler på separate dage). Alle sammenligninger af overfladeblegede og no-bleach ormassocierede CFU-tællinger er ikke signifikante (Wilcoxon rank-sum test p > 0,05). Grå vandrette linjer repræsenterer detektionstærsklen, defineret som densiteten (40 CFU/orm), hvor sandsynligheden for at observere mindst en koloni er ~ 60%, når der pletteres 10 μL alikvoter fra 200 μL volumener. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2. Disruptionprotokollen med 96 brønde giver ensartede resultater og er robust over for materialevalg. N2 voksne orme koloniseret med en enkelt bakterieart i 48 timer (P. mosselii) blev overfladebleget og permeabiliseret i henhold til standardprotokoller, derefter blev individuelle orme (n = 24 pr. tilstand) mekanisk forstyrret til CFU-plettering ved hjælp af (A) manuel forstyrrelse i individuelle 0,5 ml rør ved hjælp af en motoriseret pistil eller (B-D ) ændringer af afbrydelsesprotokollen med 96 brønde, der er beskrevet i detaljer i protokollen. Afbrydelse blev udført i M9 ormebuffer indeholdende varierende koncentrationer af Triton X-100 (x-akse, 0-0,1%, v/ v) og en af (B) 36-gryn siliciumcarbid, (C) små (425-600 μm) glasperler eller (D) store (2,7 mm) glasperler. For alle plots er de viste data log10 (CFU/orm), og hvert punkt er en individuel orm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3. Heterogen bakteriel kolonisering af C. elegans tarm. (A) Kolonisering af N2 voksne hermafroditter fremstillet som i metoder. Bakterier er fire arter fra MYb native ormmikrobiomsamlingen (Dirksen et al. 2016) (n = 24 orme, et eksperiment hver) og to patogener, Staphylococcus aureus MSSA Newman (SA) og Salmonella enterica LT2 (SE) (n = 96-144 orme over to/tre uafhængige eksperimenter). Kolonisering af indfødte mikrobiomarter blev vurderet efter en 48 timers inkubation ved 25 ° C i flydende S-medium + 108 CFU / ml bakterier; kolonisering af patogener blev vurderet efter inkubation på græsplæner på NGM-ormagar i 24 (SA) eller 48 (SE) h ved 25 ° C. (Ved 48 timer er orme på S. aureus for det meste døde.) (B) Samlet CFU/orm hos N2, daf-16(mu86) og daf-2(e1370) voksne koloniseret i 4 dage i flydende medier på et otte-arters minimalt naturligt mikrobiom (data fra Taylor og Vega, 2021)14. (C-D) Grøn fluorescens i individuelle orme koloniseret med GFP-ekspressive bakterier, observeret ved stor objektstrømcytometri. I (C) blev synkroniserede populationer af N2 voksne koloniseret med OP50 (ikke-fluorescerende, n = 1908 individuelle voksne orme), S. aureus (GFP, n = 968) eller S. enterica (GFP, n = 1153) som beskrevet i (A); OP50-kontrollen angiver typiske niveauer af grønkanals autofluorescens i dag-3 voksne N2-orme. I (D) blev synkroniserede populationer af N2 (n = 1165), daf-16 (mu86) (n = 1180) og daf-2 (e1370) (n = 2267) voksne koloniseret med kommensal Ochrobactrum MYb14-GFP i 2 dage på plader som beskrevet i (A). (ØF) Dag-til-dag variation i kolonisering af S. aureus (E) og S. enterica (F) (samme data som i panel A og figur 1, n = 48 orme pr. Eksperiment). X-aksen angiver prøveudtagningsdagen. Grå vandrette linjer repræsenterer detektionstærskel, defineret som den tæthed, hvor sandsynligheden for at observere mindst en koloni er ~ 60% (40 CFU / orm for kolonisering af en enkelt art og fire CFU / orm for kolonisering af flere arter på grund af forskellige pletteringsvolumener på henholdsvis 10 μL og 100 μL ud af 200 μL). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4. Batching sletter biologisk variation i skæve logskaladata. CFU/ormdata fra figur 3 blev gensamplet med erstatning for at skabe n = 25 replikatsæt af simulerede data for hver batchstørrelse, hvor størrelsen er antallet af individuelle orme pr. Batch. CFU/orm er den samlede CFU i hver simuleret batch fordelt på antallet af orme pr. batch. I rådata (panel A) er den gennemsnitlige CFU/orm for MYb53 4450,8 (103,6) og for MYb120 1398,3 (103,1); de batch-udledte tal konvergerer til disse værdier, efterhånden som batchstørrelsen øges (B, fem orme/batch; C, 10 orme/batch; D, 20 orme/batch), i overensstemmelse med forventningerne fra den centrale grænsesætning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5. Udskillelse af levende bakterier er dårligt korreleret med CFU-belastning i tarmen hos individuelle orme. Her blev N2 voksne koloniseret ved fodring i henholdsvis 1 eller 2 dage på græsplæner af S. aureus-GFP eller MYb14-GFP. Orme med påviselig GFP-fluorescens (samlet GFP-> 1,8 træstammer på stort objektflowcytometer) blev sorteret fra bulkpopulationen, overfladebleget som beskrevet i Metoder og overført individuelt til NGM + varmedræbte OP50-plader. Pearson-korrelationer mellem logtransformerede kolonier/h og CFU/orm er ikke-signifikante (MYb14 rho = 0,19, p = 0,45; S. aureus rho = 0,02, p = 0,9). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6. Bakterielt "landbrug" skjuler antallet af udskillelseshændelser på agarplader. Her er to plader med MYb14-GFP-kolonier fra ormeudskillelse. Den første plade (A) har klare tegn på "landbrug" langs ormestier og ser ud til at repræsentere mindst to separate udskillelseshændelser baseret på forskelle i GFP-ekspression (synlig som gullig pigmentering) på tværs af kolonier. Mens den anden plade (B) er mere tvetydig, kan landbrug ikke udelukkes baseret på koloniernes positioner. I disse eksperimenter blev N2 voksne orme prækoloniseret i 48 timer ved fodring på agarplader indeholdende græsplæner af MYb14-GFP. Efter kolonisering blev orme fremstillet og overfladebleget i henhold til metoder og derefter overført i 5 μL aliquoter af M9 ormbuffer + 0,1% Triton X-100 til 6 cm NGM + varmedræbte OP50-plader (fremstillet ved at lade 50 μL pletter med 5x koncentreret varmedræbende OP50 tørre på overfladen). Orme fik lov til at strejfe i 1,5 time ved 25 ° C, derefter plukket fra plader og forstyrret til CFU / ormbelægning (manuel forstyrrelse i 20 μL buffer i individuelle 0,5 ml rør ved hjælp af en motoriseret pistil). Pladerne blev inkuberet ved 25 °C i 2 dage, før de blev talt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Video 1. Visualisering af N2 orme koloniseret med GFP fluorescerende S. aureus uden overfladeblegning. Et lille antal fluorescerende celler på neglebåndet bevæger sig ind og ud af fokus, når billedet passerer gennem ormens krop, og rumligt heterogen kolonisering af tarmen bliver synlig, når synsfeltet bevæger sig fra kropsoverfladen ind i tarmen. Z-stack billede blev taget ved 20x forstørrelse på et omvendt fluorescerende mikroskop. Bright-field og GFP filtrerede fluorescerende billeder blev overlejret, og billeder på tværs af Z-stakken syet sammen ved hjælp af leverandørsoftwaren. Billedet er fra samme slide som i supplerende figur 2A. Klik her for at downloade denne video.

Video 2. Visualisering af en N2-orm koloniseret med GFP fluorescerende S. aureus med overfladeblegning (1:1000 v/v i 20 min). Rumligt heterogen kolonisering af fluorescerende bakterier er synlig i tarmen hos denne person, og bakterier har infiltreret kroppens væv, hvilket indikerer avanceret infektion. Ingen bakterier er synlige på neglebåndet. Z-stack billede blev taget ved 20x forstørrelse på et omvendt fluorescerende mikroskop. Bright-field og GFP filtrerede fluorescerende billeder blev overlejret, og billeder på tværs af Z-stakken syet sammen ved hjælp af leverandørsoftwaren. Billedet er fra samme slide som i supplerende figur 2B. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende figur 1. Oversigt over protokollen. Her er synkroniserede voksne orme monokoloniseret med røde bakterier, overfladebleget og permeabiliseret før mekanisk forstyrrelse af individuelle orme i et 96-brøndformat. Bakterier frigivet fra tarmen fortyndes i 10x serier til CFU / ormkvantificering; de viste plader er typiske for observeret heterogenitet. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2. Visualisering af N2 orme koloniseret med GFP fluorescerende S. aureus med og uden overfladeblegning (1:1000 v/v i 20 min). (A) I den ublegede prøve er eksterne bakterier synlige ved lav forstørrelse som områder med grøn fluorescens, der ikke er forbundet med orme eller ormkropsfragmenter. (B) I den overfladeblegede prøve er GFP-fluorescens begrænset til det indre af ormlegemer (et ormkropsfragment er synligt midt i billedet). Alle billeder blev taget med 4x forstørrelse på et omvendt fluorescerende mikroskop. Bright-field og GFP filtrerede fluorescerende billeder blev overlejret, og billeder fra tilstødende synsfelter syet sammen ved hjælp af leverandørsoftwaren. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1: Buffer- og opløsningsopskrifter. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her præsenteres data om fordelene ved enkeltormkvantificering af bakteriebelastning i C. elegans sammen med en 96-brønds afbrydelsesprotokol for at muliggøre hurtig og konsekvent erhvervelse af store datasæt af denne type. Sammenlignet med eksisterende metoder33 tillader disse protokoller måling af tarmmikrobielle samfund med højere kapacitet i ormen.

Denne tilgang har plettering som et hastighedsbegrænsende trin og er ikke virkelig "high-throughput". Cytometri med stor genstandsstrøm (figur 3C, D) er en nyttig metode med høj kapacitet til kvantificering af fluorescerende mærkede bakterier i individuelle orme16, selvom antallet af samtidige fluorophorer er en begrænsning i samfund med flere arter. At forbinde multi-well pladeforstyrrelse med samfundssekventering er en anden måde at øge gennemstrømningen på; imidlertid blev 96-brøndforstyrrelsesproceduren beskrevet her optimeret specifikt til at efterlade bakterieceller intakte. Sekventeringsbaseret analyse, hvor grundig lysis af celler er ønskelig, vil kræve tilsætning af et nukleinsyreekstraktionstrin eller modifikation af slagprotokollen (protokol 3.10-3.11) for at ekstrahere celleindhold i stedet for levende bakterier. Protokoller for enkeltormsforstyrrelse og ekstraktion af nukleinsyrer er blevet offentliggjort andetsteds38,39.

Bakteriel total overflod i ormtarmen er heterogen, og de data, der er vist her, tyder på, at batchbaseret måling kan give fejlagtige resultater i sammenligninger mellem grupper. Imidlertid kan andre målinger af bakteriesamfund i ormen være mindre følsomme over for virkningerne af batching. Bemærk, at relative forekomster i ormassocierede samfund synes at variere meget lidt, hvis overhovedet med den samlede tarmpopulationsstørrelse, uanset om interaktioner mellem mikrober er neutrale40 eller ej14. Det er sandsynligt, at sammenlignet med tælledata vil målinger af relativ forekomst være mindre modtagelige for det beskrevne problem med falsk positivprocent. Sekventeringsbaseret fællesskabsanalyse, som genererer data om relativ overflod for samfundssammensætning, kræver derfor muligvis ikke måling af enkeltorme. Der er behov for yderligere undersøgelser på dette punkt.

Her bruger vi koldbehandling til at lamme orme til overfladeblegning. Andet arbejde har vist, at orme genoptager normal aktivitet hurtigt (<15 min), hvis tiden på is holdes under 30 minutter, hvilket muliggør øjeblikkelig brug i yderligere assays, i modsætning til kemiske lammelsesmidler, som kan kræve længere perioder før fuld genopretning34. Hvis orme skal forstyrres med det samme til bakteriel kvantificering, kan denne funktion undværes, og den største fordel ved nedkøling vs. kemisk lammelse er at undgå behovet for en kontrolleret affaldsstrøm. Udvidet kuldebehandling bør anvendes med forsigtighed, når man undersøger stressresponser, især hvis der er en kendt forbindelse til temperaturen. De her beskrevne protokoller for kuldelammelse medfører kortere akut kuldeeksponering end anvendt i forsøg med kuldestress (20-30 min vs 2+ t ved 2-4°C)41,42,43, og et 1 timers kuldechok giver ingen tilsyneladende fænotype i vildtypeorme43. Kortvarig (90 min) inkubation ved 4 °C inducerer ændringer i koldspændingsgenekspression (målt ved ekspression af en TMEM-135::GFP reporter), men ekspressionen vender tilbage til ubelastede niveauer inden for få minutter, når ormene er vendt tilbage til stuetemperatur34. Virkningerne på stressfølsomme ormgenotyper kan dog være mere alvorlige end i vildtype. Denne procedure bør valideres under de forsøgsbetingelser, der skal anvendes.

Overfladeblegningsprotokollen beskrevet her kan bruges som en måde at begrænse eller eliminere passaging af eksterne mikrober i eksperimenter. Denne metode er desuden blevet brugt til at fjerne svampeforurenende stoffer ved overfladeblegning og kun overføre L1/L2 larver til friske plader (overførsel af overfladeblegede voksne resulterede i manglende rydning af forureningen, formodentlig på grund af transport i tarmene hos de større dyr). Det er kritisk vigtigt at sikre, at blegemiddelkoncentrationen ikke overstiger 1:1000 v/v, da der vil opstå skader på ormene og dødeligheden. Denne procedure kan være nyttig i eksperimentel værtsmikrobeudvikling og værtspatogeninteraktioner. For eksempel kan den lave udskillelseshastighed af levende bakterier, der observeres her, bidrage til at forklare de meget variable hastigheder, der observeres for bakteriel transmission fra hermafroditter til afkom15. Manglen på sammenhæng mellem intestinal bakteriel belastning og udskillelseshastighed observeret her er interessant, men kræver yderligere undersøgelse; et større antal datapunkter på tværs af en række betingelser vil være nødvendige for at bestemme, hvor (eller om) denne observation vil holde.

Det er måske ikke altid nødvendigt at rengøre orme i det omfang, det sikres ved overfladeblegning. Flere vaske i steril buffer er sandsynligvis tilstrækkelige, når orme koloniseres internt med en enkelt mikrobe, hvis den minimale forventede CFU / orm er meget højere (10-100 gange) end koncentrationen af bakterier i buffer supernatant, da denne overførsel vil minimalt påvirke tællinger (se figur 1). Derudover, hvis mikroben (e) af interesse primært koloniserer (e) neglebåndet, bør overfladeblegning klart undgås. Grundig rengøring er vigtigere for at sikre nøjagtighed, når man beskæftiger sig med blandede mikrobielle samfund (for at sikre, at alle kolonier / aflæsninger i en prøve er fra ormassocierede bakterier og ikke fra miljøet), når bakterier, der klæber til neglebåndet, forstyrrer læsningen af den internaliserede population, når forventet minimum CFU / orm er lav osv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende H. Schulenberg og C. LaRock for deres generøse deling af bakteriestammer, der anvendes i disse eksperimenter. Dette arbejde blev støttet af finansiering fra Emory University og NSF (PHY2014173).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL Evergreen Labware 290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) Axygen AM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wells Axygen P-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lids Evergreen Labware 290-8020-03L
Agar Fisher Scientific 443570050
Bead mill adapter set for 96-well plates QIAGEN 119900 Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) QIAGEN 85300 Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorter Union Biometrica By quotation Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite Clorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane Diversified Biotech BEM-1 Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific AC423525000
Cholesterol VWR AAA11470-30
Citric acid monohydrate Fisher Scientific AC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrate Fisher Scientific AC197722500
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge Corning  COR-6765
Disodium EDTA Fisher Scientific 409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics Fisher Scientific 327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural Eppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifuge Eppendorf 5406000640 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 Eppendorf 22627040 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 Eppendorf 22638930
Ethanol 100% Fisher Scientific BP2818500
Glass beads, 2.7 mm Life Science Products LS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm Sigma G877-500G
Glass plating beads VWR 76005-124
Hydrochloric acid VWR BDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrate Fisher Scientific 423731000
Kimble Kontes pellet pestle motor DWK Life Sciences 749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL DWK Life Sciences 749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage Leica 11889113
Leica LAS X Premium software Leica 11640687
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrate VWR 470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing film Amcor PM996
Peptone Fisher Scientific BP1420-500
Petri dishes, round, 10 cm VWR 25384-094
Petri dishes, round, 6 cm VWR 25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cm VWR 10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS) Gold Bio P-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallow Fisher Scientific 13-361-10
Potassium hydroxide Fisher Scientific AC134062500
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific BP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 R Foundation n/a
Scoop-type laboratory spatula, metal VWR 470149-438
Silicon carbide 36 grit MJR Tumblers n/a Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific BP166-100
Sodium hydroxide VWR BDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodum chloride Fisher Scientific BP358-1
Sucrose Fisher Scientific AC419760010
Tri-potassium citrate monohydrate Fisher Scientific AC611755000
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Zinc sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC205982500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
  2. Stephenson, J., et al. Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).
  3. VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology. Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).
  4. Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model. The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).
  5. Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans. Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).
  6. Yashin, A. I., et al. Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).
  7. Zhao, Y., et al. Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  8. Eckley, D. M., et al. Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans. AGE. 35 (3), 689-703 (2012).
  9. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  10. Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans. eLife. , (2021).
  11. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  12. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  13. Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53 (2009).
  14. Taylor, M., Vega, N. M. Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model. mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).
  15. Diaz, S. A., Restif, O. Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).
  16. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090 (2014).
  17. Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
  18. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
  19. Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut. Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).
  20. Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).
  21. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  22. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
  23. Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).
  24. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  25. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99 (2), 123-132 (1999).
  26. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
  27. Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  28. Revtovich, A. V., et al. Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans - Enterococcus faecium infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327 (2021).
  29. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
  30. Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).
  31. Wu, T., et al. Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides. Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).
  32. Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701 (2011).
  33. Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).
  34. Manjarrez, J. R., Mailler, R. Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods. Heliyon. 6 (7), 04263 (2020).
  35. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS ONE. 6 (4), 0019505 (2011).
  36. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921 (2003).
  37. Thutupalli, S., et al. Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).
  38. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
  39. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  40. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLOS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
  41. Gulyas, L., Powell, J. R. Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans. Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).
  42. Jiang, W., et al. A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans. eLife. 7, 35037 (2018).
  43. Robinson, J. D., Powell, J. R. Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans. BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).

Tags

Biologi udgave 185 Caenorhabditis elegans mikrobiom heterogenitet værtsmikrobe bakterier transmission
Brug af enkeltormdata til at kvantificere heterogenitet i <em>Caenorhabditis elegans-bakterielle</em> interaktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taylor, M. N., Spandana Boddu, S.,… More

Taylor, M. N., Spandana Boddu, S., Vega, N. M. Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (185), e64027, doi:10.3791/64027 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter