Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Использование данных об одном черве для количественной оценки гетерогенности в caenorhabditis elegans-бактериальных взаимодействиях

Published: July 22, 2022 doi: 10.3791/64027
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Biology, Emory University, 2Department of Physics, Emory University

Summary

Этот протокол описывает 96-луночное нарушение отдельных бактериально колонизированных Caenorhabditis elegans после холодного паралича и поверхностного обесцвечивания для удаления внешних бактерий. Полученная суспензия наносится на агаровые пластины, чтобы обеспечить точную, среднепроизводительную количественную количественную оценку бактериальной нагрузки у большого количества отдельных червей.

Abstract

Нематода Caenorhabditis elegans является модельной системой для взаимодействия хозяин-микроб и хозяин-микробиом. Многие исследования на сегодняшний день используют периодические дайджесты, а не отдельные образцы червей для количественной оценки бактериальной нагрузки в этом организме. Здесь утверждается, что большая межиндивидуальная изменчивость, наблюдаемая при бактериальной колонизации кишечника C. elegans , является информативной, и что методы периодического переваривания отбрасывают информацию, которая важна для точного сравнения между условиями. Поскольку описание вариаций, присущих этим образцам, требует большого количества особей, установлен удобный протокол плиты из 96 скважин для разрушения и покрытия колоний отдельных червей.

Introduction

Гетерогенность в ассоциациях хозяин-микроб наблюдается повсеместно, и различия между индивидуумами все чаще признаются в качестве фактора, способствующего процессам на уровне популяции от конкуренции и сосуществования1 до передачи болезни 2,3,4. У C. elegans «скрытая гетерогенность» в изогенных популяциях наблюдалась неоднократно, причем субпопуляции особей демонстрировали различные фенотипы в реакции теплового шока 5,6, старении и продолжительности жизни 7,8,9,10,11 и многих других аспектах физиологии и развития12. . Большинство анализов, которые пытаются идентифицировать субпопуляционную структуру, дают доказательства для двух субпопуляций в экспериментальных популяциях изогенных, синхронизированных червей 5,7,8, хотя другие данные предполагают возможность внутрипопуляционного распределения признаков, а не отдельных групп 7,12,13 . Здесь уместно отметить, что существенная гетерогенность в кишечных популяциях наблюдается даже в пределах изогенных популяций червей, колонизированных из общего источника микробов 13,14,15,16, и эта неоднородность может быть скрыта измерениями периодического переваривания, которые широко используются 17,18,19,20 для количественной оценки бактерий у червя.

В этой работе представлены данные, свидетельствующие о необходимости большей зависимости от измерений одного червя в ассоциации между хозяином и микробом, а также протоколов для повышения точности и пропускной способности при нарушении работы одного червя. Эти протоколы предназначены для облегчения механического разрушения большого количества отдельных C. elegans для количественной оценки жизнеспособной бактериальной нагрузки, обеспечивая при этом лучшую повторяемость и более низкое усилие на образец, чем разрушение отдельных червей на основе пестика. Рекомендуемый этап очистки кишечника, на котором червям разрешается питаться убитой теплом кишечной палочкой до подготовки к нарушению, включен для минимизации вклада недавно проглоченных и других переходных (неприлипших) бактерий. Эти протоколы включают метод холодного паралича для очистки кутикулы с низкоконцентрированной поверхностной отбеливающей обработкой; Поверхностное отбеливание может быть использовано в качестве подготовительного этапа при разрушении одиночных червей или в качестве метода подготовки живых, внешне свободных от микробов червей. Этот метод поверхностного отбеливания достаточен для удаления широкого спектра внешних микробов, а холодная обработка обеспечивает альтернативу обычному параличу на основе левамизола; в то время как левамизол будет предпочтительным для экспериментов, чувствительных к холоду, холодный паралич сводит к минимуму вклад в потоки опасных отходов и позволяет быстро возобновить нормальную деятельность. В то время как полный протокол описывает лабораторный эксперимент, в котором черви колонизируются известными бактериями, процедуры очистки червей и разрушения одного червя могут быть легко применены к червям, выделенным из диких образцов или колонизированным в экспериментах с микромиром. Протоколы, описанные здесь, производят живые бактерии, извлеченные из кишечника червя, пригодные для покрытия и количественной оценки колониеобразующих единиц (КОЕ) у отдельных червей; для анализа кишечного сообщества на основе секвенирования к этим протоколам следует добавить последующие этапы лизиса клеток и экстракции нуклеиновых кислот.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Черви, используемые в этих экспериментах, были получены из Генетического центра Caenorhabditis , который финансируется Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). Бристоль N2 относится к дикому типу. Мутанты DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) и daf-2(e1370) III (CGC CB1370) используются для иллюстрации различий в кишечной бактериальной нагрузке.

HT115(DE3) E. coli, несущая вектор pos-1 RNAi, взята из библиотекиАрингера 21. Коллекция MYb нативных кишечных бактерий C. elegans 22 была получена из лаборатории Шуленбурга. Сальмонелла энтерическая LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR из этой лаборатории23. Pseudomonas mosselii был выделен в этой лаборатории. Золотистый стафилококк MSSA Newman pTRKH3-mGFP был получен из лаборатории LaRock в Университете Эмори.

Все червячные буферы и среды готовятся в соответствии с ранее опубликованной литературой24 с незначительными изменениями (см. Дополнительный файл 1).

1. Подготовка синхронизированных стерильных C. elegans

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описаны пошаговые процедуры для создания синхронизированной популяции репродуктивно стерильных взрослых червей. Питание на пластинах pos-1 RNAi используется здесь для предотвращения производства потомства, потому что эта интерференция является эмбриональной летальной; Личинки L1, выросшие до зрелого возраста на pos-1 RNAi, развиваются в яйцекладущие гермафродиты, но этих яиц нежизнеспособно25. Протокол кормления РНКи похож на главу «Обратная генетика» Wormbook26.

  1. Перед синхронизацией червей убедитесь, что доступны свежие пластины 10 см NGM + pos-1 RNAi. Пластины могут быть приготовлены свежими из концентрированной индуцированной жидкой культуры (+Amp +IPTG) или инокулированы в виде газонов на NGM + 100 мкг/мл ампициллина + 1 мМ IPTG и дать расти при 25 °C в темноте в течение 1 дня27.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Карбенициллин (25 мкг/мл) часто используется вместо ампициллина на пластинах РНКи. Ампициллин дешевле, но менее стабилен; при использовании ампициллина пластины следует сразу же засеять после высыхания и использовать как можно скорее (можно хранить в течение <1 недели при 4 °C)27. Рекомендуемая здесь высокая концентрация антибиотиков поможет обеспечить адекватный отбор.
  2. Начните с нескольких (обычно от двух до четырех) плит NGM с большими популяциями гравидных гермафродитов. Изолируют яйца с помощью синхронизации отбеливатель-NaOH24.
    1. Смойте червей с агаровых пластин, используя 2 мл стерильного ddH2O на тарелку. Равномерно распределите жидкость по микроцентрифужным пробиркам объемом 1,5 мл (по одной трубке на пластину или гермафродиты).
    2. Вращайтесь вниз в течение ~ 5 с в настольной мини-центрифуге (2000 х г), чтобы вытащить взрослых на дно трубок. Пипетка снимает супернатант и выбрасывает.
    3. Промыть 1 мл стерильного ddH2O; вращаться вниз, как и раньше, и отбрасывать супернатант.
    4. Повторите предыдущий шаг, чтобы уменьшить оставшийся бактериальный мусор.
    5. Повторно суспендируют содержимое каждой пробирки в 1 мл стерильного ddH2O. Добавляют в каждую пробирку 130 мкл коммерческого отбеливателя (8,25% гипохлорита натрия) и 130 мкл 5 N гидроксида натрия (NaOH, конечная концентрация 0,5 Н).
    6. Вихревые трубки энергично в течение не менее 10-15 с каждые 2 минуты, пока взрослые тела не распадутся. Не позволяйте лечению отбеливателем NaOH длиться дольше 5 минут, чтобы избежать убийства яиц.
    7. Вращайте в миницентрифуге в течение 30-60 с при 2000 х г , чтобы гранулировать яйца. Пипетка снимает супернатант и выбрасывает. Может быть, а может и не быть видимой гранулы, это нормально.
    8. Добавьте 1 мл червячного буфера M9 и открутите в течение 30-60 с при 2000 х г. Выбросьте супернатант.
    9. Повторите стадию промывки (1.2.8) 5x, чтобы тщательно удалить смесь отбеливателя и NaOH, удалив как можно больше супернатанта, не нарушая гранулу яйца.
    10. Перенесите яйца в 10 мл буфера червя M9 в конической трубке 50 мл или 30 мл культуральной трубки с колпачком. Если вы используете конические трубки, оставьте крышку слегка открученной и используйте немного ленты, чтобы сохранить ее в безопасности. Насиживайте с встряхиванием в течение ночи (16 ч) при 25 °C и 200 об/мин, чтобы позволить личинкам вылупиться.
  3. Перенос синхронизированных личинок L1 на пластины РНКи для взросления.
    1. Добавьте 2 мл стерильного буфера M9 + 0,01% Triton X-100 (далее M9TX-01) к каждой трубке L1 и передайте весь объем (12 мл) в коническую трубку с винтовым верхом 15 мл.
    2. Поместите 15 мл пробирок с червями L1 при 4 °C в течение 10 минут, чтобы замедлить движение личинок.
    3. Открутите 15 мл конических трубок в большой настольной центрифуге (1 500 х г при 4 °C в течение 3 мин; ускорение и замедление должны быть не выше 80% от максимального).
    4. Осторожно отбросьте супернатант, не нарушая гранулу L1. Выбросьте супернатант.
    5. Добавьте 12 мл холодного M9TX-01 в каждую трубку. Центрифугирование повторить. Осторожно снимите пипетку и выбросьте супернатант. В каждой трубке должно остаться ~200 мкл.
    6. Промойте наконечник пипетки объемом 200 мкл в M9TX-01, чтобы черви не прилипли к пластику, затем используйте этот наконечник для повторного суспендирования гранул червя. Перенесите повторно суспендированных червей на подготовленные пластины pos-1 путем пипетирования капель жидкости на бактериальный газон.
    7. Инкубируйте пластины при 25 °C до первого дня взрослой жизни.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если черви растут на пластинах pos-1 RNAi, черви ДОЛЖНЫ питаться ad libitum бактериями RNAi до тех пор, пока они полностью не перейдут во взрослую жизнь, чтобы обеспечить высокую пенетрантность эмбрионально-летального фенотипа. Проверяйте пластины в 24 и 48 ч. Если тарелки кажутся голодными или почти голодными, червей нужно будет переместить в свежие тарелки, чтобы закончить расти в полноразмерных взрослых особей. Чтобы избежать истощения пластин до выращивания червей, старайтесь добавлять 250-500 личинок L1 к каждой 10-сантиметровой пластине РНКи.
  4. Собирайте взрослых особей и очищайте кишечную кишечную палочку , чтобы создать червей без микробов.
    1. Смойте взрослых червей с тарелок, используя 5 мл M9TX-01 на тарелку. Перенесите буфер + червей в коническую трубку объемом 15 мл и дайте взрослым осесть на дно трубки.
    2. Смойте взрослых при изменениях 10 мл свежего буфера M9TX-01 до тех пор, пока не останется видимого бактериального мутного помутнения (обычно в 1-2 раза). Трубки могут быть центрифугированы при 700 х г в течение 30 с гранулированным червям, или взрослым может быть позволено осесть под действием силы тяжести.
    3. Выполните одну дополнительную промывку 10 мл M9TX-01, чтобы уменьшить количество внешних бактерий.
    4. Перенесите червей в конические трубки объемом 50 мл или 30 мл культуральных трубок, содержащие 5 мл S Medium + 2x термоубитая E. coli OP50 (~5 x 109 убитых клеток/мл) + 200 мкг/мл гентамицина + 50 мкг/мл хлорамфеникола. Если вы используете конические трубки, оставьте крышку слегка открученной и используйте немного ленты, чтобы сохранить ее в безопасности. Используйте стеклянные пипетки или промойте пластиковые пипетки в M9TX-01, чтобы черви не прилипали.
    5. Инкубировать взрослых при 25 °C с встряхиванием при 200 об/мин в течение 24-48 ч для получения взрослых без микробов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если черви должны оставаться в антибиотиках в течение >24 ч, возможно, придется добавить больше убивающего тепло OP50, чтобы гарантировать, что черви имеют достаточный источник пищи. Проверьте трубки через 24 часа и дополните их теплоупорным OP50, если мутность заметно уменьшилась.
  5. Сахароза промывает взрослых в соответствии с протоколамиWormbook 24 для получения чистых, репродуктивно стерильных, синхронизированных запасов только для взрослых для бактериальной колонизации.
    1. Убедитесь, что холодные объемы 60% сахарозы, буфер червя M9 и M9TX-01 готовы к использованию. Для простоты их можно оставить при 4 °C накануне вечером.
    2. Для каждого образца, подлежащего промывке, создайте меченую коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 8 мл M9TX-01, и отложите на льду. Они понадобятся на этапе 1.5.10.
    3. Добавьте 5 мл M9TX-01 к каждой 50 мл трубки, содержащей личинки L1. Перенесите весь объем (теперь 10 мл) в пустую коническую трубку объемом 15 мл и дайте взрослым осесть на дно трубки.
    4. Аккуратно снимите пипетку с супернатанта и выбросьте.
    5. Добавьте 10 мл M9TX-01 в каждую трубку и переместите трубки в ведро со льдом в течение 5-10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого момента, черви и все буферы должны храниться на льду.
    6. Используйте настройку «быстрая температура» для охлаждения большой настольной центрифуги до 4 °C.
    7. Добавьте 10 мл холодного M9TX-01 в каждую трубку, чтобы смыть оставшийся мусор. Дайте червям осесть на льду; удалить супернатант и выбросить.
    8. Поплавок сахарозы: Добавьте 5 мл холодного буфера M9 и 5 мл холодного 60% раствора сахарозы в каждый тюбик, тщательно перемешивая. Затем осторожно поместите 1 мл холодного буфера M9 поверх сахарозно-буферной смеси в каждой пробирке. Не перемешивайте после добавления поплавка.
      ВНИМАНИЕ: Двигайтесь быстро в течение следующих нескольких шагов - черви могут высохнуть, если подвергаться воздействию высоких концентраций сахарозы слишком долго!
    9. Центрифуга при 1500 х г в течение 3 мин при 4 °C. Живые взрослые черви будут находиться на границе раздела M9 и сахарозы, примерно в 1 мл от верхней части трубки.
    10. Используют стеклянную серологическую пипетку 5 мл для переноса глистного слоя на подготовленные конические трубки объемом 15 мл с холодным M9TX-01 (из шага 1.5.2). Будьте очень осторожны, чтобы получить слой живых червей, не пипетируя слишком много сахарозы.
    11. При необходимости добавляют M9TX-01, чтобы получить равные объемы 10-12 мл/трубку. Центрифуга при 1500 х г при 4 °C в течение 1 мин, затем пипетка от супернатанта. Черви могут быть возвращены к комнатной температуре в этот момент.
    12. Повторите этап промывки 1.5.11 дважды, уменьшив скорость до 700 х g при 4 °C и время до 30 с.

2. Кормление червей живыми бактериями в жидкой культуре

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол используется для колонизации червей лабораторно выращенными бактериями в хорошо смешанных условиях в жидкой культуре (дополнительный рисунок 1). Черви могут быть колонизированы отдельными изолятами из чистой культуры (например, патогенами, такими как Enterococcus faecium28,29) или смесями изолятов (например, минимальными сообществами микробиома14).

  1. Начните с сахарозы, промытых синхронизированными взрослыми червями с этапа протокола 1,5 в конической трубке объемом 15 мл. Промыть червей один раз в 12 мл S-буфера и выбросить надосадочный.
  2. Повторно суспендировать промытых червей в объеме S-среды, необходимом для эксперимента. Рассмотрим объем экспериментальных условий, количество условий, над которыми будут разделены черви, и конечные концентрации червей и бактерий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кормление червями варьируется в зависимости от бактериальной доступности30 , и черви могут подвергаться стрессу из-за скученности31. Для колонизации в жидких культурах рекомендуется <1000 червей/мл и >107 КОЕ/мл; 1011 КОЕ/мл считается «ad libitum» плотностью питания на E. coli32.
  3. Отращивание бактериальных культур. Вылить супернатант; аспирация или пипетка могут быть использованы для удаления супернатанта для бактерий, которые образуют рыхлые гранулы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для культур >5 мл переведите в трубки по 15 мл и вращайте при ~2800 х г в большой настольной центрифуге в течение 8-10 мин. Культуры <5 мл могут быть перенесены в пробирки объемом 1,5 мл и центрифугированы при 9000 х г в течение 1-2 мин в небольшой настольной центрифуге. Высокоподвижные бактерии (например, многие виды Pseudomonas), возможно, потребуется охладить при 4 °C в течение 10-15 минут, чтобы облегчить образование стабильной гранулы, и может быть лучше центрифугировать при 4 °C.
  4. Повторное суспендирование бактериальных культур в одном объеме S-буфера и центрифуга снова в гранулу. Удалите и выбросьте супернатант, как и раньше.
  5. Повторное суспендирование бактериальных культур в S-среде при желаемой для эксперимента плотности плюс любые антибиотики для селекции. Антибиотики, которые будут использоваться, если таковые имеются, будут зависеть от профиля резистентности бактерий, используемых для колонизации.
  6. Используя наконечник пипетки, покрытый M9TX-01, пипетки осторожно поднимаются и опускаются до тех пор, пока черви не будут полностью повторно суспендированы в среде S, а затем переносятся в трубки или пластинчатые колодцы для бактериальной колонизации.
  7. Добавьте бактериальную суспензию к каждой культуре червей, чтобы достичь желаемой бактериальной концентрации и конечного объема.
  8. При использовании многоскважинной пластины для колонизации накройте плиту стерильной газопроницаемой уплотнительной мембраной из 96 скважин.
  9. Инкубировать с встряхиванием при 200 оборотах в минуту, чтобы предотвратить оседание бактерий во время инкубации.

3. Механическое разрушение отдельных червей в 96-луночном формате

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается протокол формата пластины с 96 лунками для механического разрушения отдельных бактериально колонизированных C. elegans. Первые шаги в протоколе (3.1-3.8) описывают способ очистки неприлипших бактерий из кишечника червя и очистки внешней части червей с использованием холодного паралича и поверхностного отбеливания. На этих этапах будут получены чистые, живые взрослые черви, которые могут быть механически разрушены для количественной оценки бактериального содержимого (3,8-конец) или использованы для дальнейших экспериментов (дополнительный рисунок 1). Этот протокол может быть адаптирован для количественной оценки бактерий у червей, колонизированных в жидкой культуре (раздел 2), на агаровых пластинах или из естественной или микромировой почвы.

  1. Поместите аликвоту M9TX-01 на лед для охлаждения (в 4-5 раз больше проб в мл).
  2. Приготовьте аликвоту M9TX-01 + отбеливателя (6% гипохлорита натрия, 1:1000 или 1:2000 v/v, 1 мл на образец + 1 мл дополнительно) и поместите на лед для охлаждения. Эта аликвота будет использоваться на шаге 3.8.
  3. Подготовьте 96-луночные плиты для серийного разбавления разрушенных образцов червей.
    1. Получение стерильных 300 мкл емкостью 96-луночных пластин с крышками; этот протокол использует одну разбавляющую пластину на 12 переваренных червей.
    2. Используйте 96-луночный многоканальный пипеттор для заполнения рядов B-D каждой 96 скважинной пластины (емкость 300 мкл) 180 мкл буфера 1x PBS. Оставьте верхнюю строку пустой. Ряды B-D станут 10-кратными последовательными разведениями червячных дайджестов [0.1x, 0.01x, 0.01x].
    3. Отложите тарелки в сторону. На этапе 3.13 будут использоваться разрежающие пластины.
  4. Повторно суспендируйте каждый образец червя в 1 мл M9TX-01 в пробирке микроцентрифуги объемом 1,5 мл.
  5. Отжимают трубки кратковременно (2-3 с) в низкоскоростной миницентрифуге (2000 х г) при 25 °C для гранул для взрослых. Пипетку снимают с супернатанта и выбрасывают, следя за тем, чтобы не потревожить червячную гранулу.
  6. Используя настройки центрифугирования на этапе 3.5, промывайте червей дважды 1 мл M9TX-01, затем один раз 1 мл червячного буфера M9, чтобы уменьшить внешние бактерии.
  7. Очистите кишечник червя от неприлипших бактерий.
    1. Повторно суспендируйте каждый образец червей в 1 мл S-среды + 2x термоубитого OP50 в культуральной пробирке.
    2. Инкубировать при 25 °C в течение 20-30 мин, чтобы обеспечить прохождение любых неприлипших бактерий из кишечника.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это также очистит любой внеклеточный флуоресцентный белок из просвета и позволит более четко визуализировать меченые бактерии, прилипшие к кишечному эпителию, особенно при использовании кислотно-быстрых флуорофоров (например, mCherry, dsRed).
  8. Поверхностный отбеливатель червей для очистки от внешних бактерий.
    1. Дважды промойте очищенных червей 1 мл холодного M9TX-01 и выбросьте надосадочный материал.
    2. Дайте трубкам остыть в течение 10 мин на льду (предпочтительно) или при 4 °C. Это парализует червей и предотвратит попадание в организм отбеливателя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В других протоколах используется химический агент паралича, такой как левамизол; это устоявшийся подход33 , который требует добавления потока опасных отходов.
    3. Добавьте 1 мл ледяного червячного буфера M9 + отбеливатель без запаха (8,25% гидроксида натрия, 1:1000 или 1:2000 v/v) в каждую трубку. Дайте трубкам посидеть на льду (предпочтительно) или при 4 °C в течение не менее 10 минут, чтобы убить внешние бактерии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте концентрацию отбеливателя 1:1000. Даже у парализованных червей может возникнуть смертность.
    4. Пипетка снимает отбеливающий буфер и выбрасывает; вернуть трубки ко льду, чтобы черви не возобновляли откачку до тех пор, пока отбеливатель не будет очищен.
    5. Добавьте 1 мл холодного M9TX-01 в каждую трубку. Отжим в течение ~5 с в миницентрифуге (2 000 х г при 25 °C); возврат трубок ко льду. Удалите супернатант и выбросьте.
    6. Повторите этот этап промывки еще 1 мл холодного M9TX-01, выбросив как можно больше супернатанта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы используете червей для дальнейших экспериментов, пропустите стадию пермеабилизации (Протокол 3.9) и вместо этого перенесите свежеиспеченных поверхностно отбеленных взрослых особей в ледяной буфер в чашке Петри 6 см и разделите червей в экспериментальные условия, как в Протоколе 3.10. Держите червей холодными, чтобы предотвратить возобновление моторики, но работайте быстро - содержание червей в течение >30 минут на льду может потенциально привести к <100% возобновлению нормальной активности34.
  9. Химическая пермеабилизация кутикулы червя додецилсульфатом натрия и дитиотриетолом (0,25% SDS + 300 мМ DTT) (из расчета35)
    ВНИМАНИЕ: DTT является восстановителем и раздражителем. Носите СИЗ и работайте в вытяжном шкафу при работе с сухими запасами или растворами. Требуется поток опасных отходов.
    1. В вытяжном шкафу приготовьте достаточное количество раствора SDS/DTT, чтобы на каждый образец приходилось 100 мкл. Для 1 мл, до 965 мкл червячного буфера M9 или M9TX-01 в микроцентрифужной трубке 1,5 мл, добавьте 5 мкл 5% (мас./об.) SDS и 30 мкл 1M DTT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1 М раствор DTT (водный) следует готовить в свежем виде или хранить в аликвотах при -20 °C для обеспечения эффективности. Аликвоты должны быть рассчитаны на использование в двух-трех экспериментах, чтобы избежать чрезмерного цикла замораживания-оттаивания.
    2. Переместите микроцентрифужные трубки, содержащие поверхностно-обесцвеченных червей, в стойку для труб комнатной температуры. Каждая трубка должна содержать червей в ~20 мкл буфера.
    3. Добавьте 100 мкл раствора SDS/DTT к каждому образцу червя. Утилизируйте все оставшиеся решения SDS/DTT в соответствующем потоке опасных отходов.
    4. Дайте процедуре продолжаться до 8 мин на скамейке, чтобы частично разрушить резистентную кутикулу взрослых червей. Черви погибнут и осядут на дно трубки в течение этого времени.
    5. По истечении времени пермеабилизации осторожно выключите супернатант SDS/DTT и утилизируйте его в соответствующий поток опасных отходов SDS/DTT.
    6. Добавьте 1 мл M9TX-01 в каждую трубку. Кратковременно вращайте в настольной центрифуге, чтобы гранулировать червей или позволяйте червям оседать под действием силы тяжести на дно трубок, затем оттягивайте супернатант и утилизируйте в поток опасных отходов SDS / DTT.
    7. Повторное суспендирование червей в буфере червей M9 1 мл + 0,1% Triton X-100 до готовности к использованию.
  10. Разделите червей в глубокую 96-луночную пластину с твердым листом карбида кремния для механического разрушения. Подготовьте плиту разрушения из 96 скважин как под ней.
    1. Получите стерильную пластину глубиной 2 мл с 96 лунками и соответствующую силиконовую 96-луночную пластинчатую крышку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать пластины, совместимые с 96-луночными адаптерами для разрушителя тканей. Крошечные различия во внешних размерах делают разницу между пластиной, которую можно снять с адаптеров, и той, которая не может.
    2. Используя стерильный совковый шпатель, добавьте небольшое количество стерильного 36-зернистого карбида кремния в каждую лунку пластины, которая получит червя. Используйте достаточно песка, чтобы едва покрыть дно колодца (около 0,2 г на лунку). Чрезмерный материал затруднит получение наконечника пипетки на дно колодца при извлечении содержимого.
    3. Добавьте 180 мкл червячного буфера M9 в каждую лунку.
    4. Обозначьте столбцы или ряды, чтобы указать, куда пойдет каждый образец, затем накройте пластину свободно силиконовой крышкой из 96 лунок.
  11. Перенесите отдельных червей на 96-луночную пластину для разрушения.
    1. Осторожно переместите пермеабилизированных червей в небольшую (35 или 60 мм) чашку Петри, содержащую достаточное количество M9TX-01, чтобы наполнить блюдо на глубину ~1 см.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если присутствует большое количество червей, может быть невозможно перенести весь образец, так как жидкость станет переполненной, и будет трудно пипетку отдельных червей.
    2. Используя рассекающий микроскоп или другое устройство с низким увеличением, пипетку отключите отдельных червей в объемах 20 мкл и перенесите этих червей в отдельные колодцы из 96-луночной пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего собирать только свежеубитых червей. Избегайте червей с жесткой линейной формой, так как эти черви, возможно, были мертвы в течение некоторого времени. Попробуйте взять червей, которые изогнуты или S-образны, с нормальной грубой физиологией и неповрежденным кишечником.
    3. После переноса каждого объема убедитесь, что выбранный червь действительно был выброшен в скважину. Для этого пипетку поднимают 20 мкл M9TX-01 из прозрачной области чашки Петри и выпускают весь объем обратно в тарелку; это обычно выталкивает червя, если он прилип к пипетке. Если червь застрял, извлеките из лунки 20 мкл и повторите попытку переноса.
    4. После того, как все черви будут перенесены, накройте пластину из 96 скважин листом коммерчески доступной гибкой бумажной уплотнительной пленки (2 x 2 квадрата), убедившись, что бумажная сторона уплотнительной пленки обращена вниз к колодцам для образцов. Будьте осторожны, чтобы не растянуть уплотнительную пленку слишком тонко, иначе ее будет очень трудно удалить позже.
    5. Поместите силиконовый уплотнительный коврик слегка поверх гибкой уплотнительной пленки; Не прижимайте крышку к скважинам в это время.
    6. Переместите пластину до 4 °C до охлаждения в течение 30-60 мин. Это предотвратит перегрев во время разрушения, которое может повредить образцы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это точка останова в протоколе. В большинстве случаев пластину можно оставить при 4°C на срок до 4 ч перед измельчением. Не оставляйте червей на ночь, так как это изменит количество бактерий.
  12. Загрузите 96-луночные пластины на разрушитель тканей, чтобы разрушить ткани червя и выпустить кишечные бактерии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (Необязательно) При использовании нечетного числа 96-луночных пластин для переваривания необходимо подготовить противовес, прежде чем продолжить. Используйте пустую глубокую 96-луночную пластину и заполняйте колодцы водой, пока она не весит столько же, сколько и первая пластина.
    1. Плотно прижмите силиконовый уплотнительный мат к колодцам, чтобы создать уплотнение, убедившись, что крышка лежит ровно по всей поверхности пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если гибкая уплотнительная пленка слишком толстая после растяжения, будет трудно закрепить силиконовую крышку так, чтобы она лежала ровно во всех колодцах. Это приведет к недостаточному уплотнению и загрязнению скважины во время встряхивания.
    2. Закрепите пластины в тканевом разрушителе с помощью 96-луночных пластинчатых адаптеров. Встряхните пластины в течение 1 мин при 30 Гц, затем поверните пластины на 180° и снова встряхните в течение 1 мин. Это поможет обеспечить равномерное разрушение во всех скважинах плиты.
    3. Плотно нажмите пластины на скамейку два или три раза, чтобы выбить любую песчинку из гибкой уплотнительной пленки.
    4. Используя большую центрифугу с двумя 96-луночными пластинчатыми адаптерами, раскрутите пластины вниз при 2400 x g в течение 2 минут, чтобы собрать весь материал на дно скважин.
    5. Снимите силиконовую крышку и осторожно снимите гибкую уплотнительную пленку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если гибкая уплотнительная пленка застряла в любой из скважин, используйте наконечник пипетки объемом 200 мкл, чтобы удалить ее. Это распространено, когда гибкая уплотнительная пленка была растянута слишком тонко.
  13. Последовательно разбавляйте червячные образцы в 300 мкл в 96-луночных пластинах.
    1. Используя многоскважинный пипетатор, установленный на 200 мкл, пипетку вверх и вниз несколько раз медленно и осторожно, чтобы повторно перемешать содержимое скважин, а затем оттянуть как можно больше жидкости. Перенесите эту жидкость в верхние ряды плит из 96 скважин, подготовленных на этапе 3.3.
    2. Используя 96-луночный пипеттер, установленный на 20 мкл, удалите этот объем жидкости из верхнего ряда и распределите в ряд B. Пипетку вверх и вниз 8-10x для смешивания. Отбросьте наконечники.
    3. Повторите шаг 3.13.2, начиная с образцов 0,1x в строке B, чтобы создать образцы разрежения 0,01x в строке C.
    4. Повторите шаг 3.13.2 еще раз, перейдя от строки C к строке D.
    5. Пластина на твердый агар для количественной оценки бактерий. Для моноколонизированных червей, как правило, достаточно наносить 10-20 мкл капель каждого разведения [1x-0,001x] на агаровые пластины. Для многовидовой колонизации нанесите каждое разбавление отдельно путем пипетки 100 мкл на 10-сантиметровую агаровую пластину; наносите сразу же с помощью стеклянных шариков.

4. Очистка песка из карбида кремния для повторного использования

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура используется для очистки и стерилизации шлифовального материала, твердой крупы карбида кремния, для повторного использования после экспериментов. Этот протокол должен соблюдаться в полном объеме перед первым использованием, так как твердость карбида кремния является промышленным продуктом и не поставляется предварительно стерилизованным. Si-carbide grit (3,2 г/куб.см) представляет собой плотный, шероховатый материал, который эффективно работает для разрушения жестких образцов. Тем не менее, частицы могут изнашиваться при повторном использовании и должны быть заменены, когда износ становится очевидным. К счастью, материал недорогой, и обычно продаваемых размеров (~ 1 фунт) достаточно для многих экспериментов.

  1. После удаления образцов для нанесения покрытия добавьте 10% раствор отбеливателя во все колодцы 96-луночной плиты и оставьте не менее 10 минут.
  2. Удалите основную часть песка, быстро перевернув 96-луночную пластину над небольшим высоким лотком или пустым контейнером с наконечником пипетки P1000, достаточно большим, чтобы уловить все содержимое. Песок сразу же опустится на дно лотка. Вылейте раствор отбеливателя в раковину.
  3. Повторно заполните 96-луночную плиту водопроводной водой и переверните в тот же лоток, чтобы промыть оставшуюся песок. Вылейте воду в раковину.
  4. Повторите еще один-три раза с водопроводной водой, пока тарелка полностью не очистится от песка.
  5. Промойте песок 2x в водопроводной воде, каждый раз заполняя лоток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 96-луночная глубокая плита может быть вымыта в лабораторной посудомоечной машине, надежно покрыта фольгой и автоклавирована другими многоразовыми пластмассами. Песок не нужно стирать сразу и его можно отложить в этот момент. Использованная песчинка обычно накапливается в результате нескольких экспериментов перед стиркой и автоклавированием.
  6. Вымойте песок в растворе лабораторного моющего средства в течение 30 мин, периодически перемешивая путем закручивания или смешивания металлическим шпателем.
  7. Смойте все следы моющего средства в нескольких (8-10) сменах водопроводной воды, затем смойте 2 раза дистиллированной водой.
  8. Выкладываем песок в открытый лоток, например, в неглубокий полипропиленовый автоклавный лоток, и сушим при 40-70 °C в течение нескольких часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если песчинка комковатая при высыхании, она не была очищена или промыта в достаточной степени. Повторите протокол очистки, начиная с шага 4.6, добавив дополнительные полоскания на шаге 4.7.
  9. Распределите чистую сухую песок в автоклавируемые стеклянные бутылки с завинчивающейся крышкой на максимальную глубину 5-6 см. Автоклав на предвакуумном цикле в течение 30 мин для стерилизации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Отбеливающая стерилизация живых червей
Поверхностно обесцвеченные черви эффективно свободны от внешних бактерий до тех пор, пока подвижность не вернется и выделение не возобновится. В условиях, используемых здесь, наблюдается быстрое вымирание бактерий в буфере (рисунок 1A-C, дополнительный рисунок 2, видео 1), не беспокоя кишечно-ассоциированные бактерии у холодно парализованных червей (рисунок 1D-F, видео 2). Эти данные указывают на то, что поверхностное отбеливание может быть эффективно использовано для санитарной обработки червей снаружи без ущерба для кишечного содержимого (сравнения количества коЕ, связанных с поверхностным отбеливанием и без отбеливания, связанных с червями, являются незначительными, тест Wilcoxon rank-sum p > 0,05).

Вариации механических разрушений с несколькими образцами
96-луночная техника механического разрушения червей устойчива к конкретным используемым материалам, а практические соображения диктуют выбор шлифовального материала. Как и в предыдущем отчете33, ручное разрушение (рисунок 2A) привело к большей гетерогенности, чем стандартный протокол из 96 скважин (твердость карбида кремния, рисунок 2B) (var (log10CFU) = 0,499) во всех буферных условиях по сравнению с 0,229 для Si-карбида, 0,243 для крупных стеклянных шариков (рисунок 2C) и 0,227 для небольших стеклянных шариков (рисунок 2D) ). Тем не менее, большинство различий в распределении КОЕ/червей не были значительными (Kruskal-Wallace, p = 0,017 с df = 3; значительные пост-специальные тесты Wilcoxon для больших бусин против мелких бусин, p = 0,021, и большие бусины против твердости карбида кремния, p = 0,02). Использование Triton X-100 в качестве поверхностно-активного вещества не было связано с какой-либо существенной разницей в выходе, если рассматривать его в качестве индивидуального фактора (Kruskal-Wallace, p = 0,94, df = 3), хотя при использовании больших бусин (2,7 мм) наблюдается явное увеличение выхода в образцах, не содержащих тритона, по сравнению с тритонсодержащими образцами (2,7 мм), что, возможно, связано с чрезмерным «вспениванием», наблюдаемым в этих скважинах при наличии Тритона. Эти результаты показывают, что большие стеклянные шарики, хотя и идеально подходят для использования в гомогенизационных трубках33, не подходят для 96-луночной техники. В то время как небольшие стеклянные шарики давали разумные результаты (рисунок 2D), они постоянно забивали наконечники пипеток объемом 200 мкл во время смешивания и покрытия. Стандартный материал в этом анализе, твердосплавная крупа кремния, является недорогим, слишком большим, чтобы засорять стандартные наконечники, и, как стеклянные бусины, можно мыть и повторно использовать после автоклавирования. Песок действительно выделяет небольшое количество «пыли» в буфер, который не мешает покрытию, но должен быть отфильтрован, если продукты разрушения должны использоваться для проточной цитометрии.

Гетерогенность в бактериальной колонизации у взрослых червей
Успешное разрушение отдельных червей выявляет неоднородность в бактериальной колонизации. Особи из изогенных синхронизированных популяций червей, колонизированных в одно и то же время на одном пуле бактерий, последовательно демонстрируют 100-кратный или больший диапазон кишечной бактериальной нагрузки. Это наблюдается для различных бактериальных колонистов (рисунок 3A) и во время колонизации многовидовых бактериальных сообществ (рисунок 3B). Эта неоднородность также проявляется в измерениях флуоресценции отдельных червей, когда черви колонизируются бактериями, экспрессирующими флуоресцентный белок (GFP) (рисунок 3C-D). Свойства хозяина играют определенную роль в формировании этой неоднородности, что можно увидеть, сравнивая колонизацию диких червей Bristol N2 с колонизацией теми же бактериями у мутантов DAF-2 /IGF; этот мутант daf-16 поддерживает большие популяции многих бактерий по сравнению с N2, в то время как daf-2 устойчив к колонизации целым рядом бактерий36 (рисунок 3B, D). Эта неоднородность характерна, показывая вариации в разных комбинациях хозяина и колониста (колонистов), сохраняя при этом последовательную структуру в разных прогонах одного и того же эксперимента (рисунок 3E-F).

Важность индивидуальной гетерогенности для точного сравнения групп
Важность индивидуальной гетерогенности можно легко увидеть, рассмотрев, как пакетные дайджесты могут изменить распределение данных. Колонизация нативными бактериями микробиома MYb53 (Rhodococcus erythropolis) и MYb120 (Chryseobacteria spp.) (Рисунок 3A, 4A) у взрослых N2 используются в качестве примеров. Отдельные данные червя явно схожи по распределению (двуххвостый t-тест, p = 0,9, сумма ранга Уилкоксона, p = 0,59). При ресамплинге этих данных для моделирования эффектов пакетных дайджестов пакетная экстраполированная КОЕ/червь тянет к верхним квантилям данных из-за положительного перекоса в этих распределениях (среднее > медиане). Поскольку пакетирование эффективно усредняется по отдельным лицам в пакете, пакетно-экстраполированная КОЕ/червь будет сосредоточена вокруг среднего арифметического отдельных данных, с уменьшением расстояния до этого среднего значения по мере того, как пакеты становятся большими в соответствии с центральной предельной теоремой (рисунок 4B-D). Соответственно, сигнал от биологической изменчивости быстро теряется; измерения КОЕ/червя с пакетными выводами сходятся к среднему значению, которое не является репрезентативной метрикой этих распределенных данных в масштабе журнала. Различия в предполагаемой колонизации MYb53 и MYb120 быстро становятся значительными в моделируемых периодических дайджестах (t-тестовая партия 5, p = 0,049; партия 10, p = 2,27e-4; партия 20, p = 1,19e-15; Уилкоксон ранг сумма тестовая партия 5, p = 2,27e-4; партия 10, р = 2,70е-06; batch 20, p = 1.80e-09), так как исходный сигнал затемнен.

Влияние индивидуальной гетерогенности на микробную передачу
Поскольку отдельные черви демонстрируют значительную гетерогенность в бактериальной колонизации, разумно спросить, имеет ли эта гетерогенность последующие эффекты. Например, разумно ожидать, что передача может быть функцией кишечной бактериальной нагрузки. Перенося отдельных поверхностно-обесцвеченных червей в чистую среду, можно наблюдать инокуляцию окружающей среды выведенными живыми бактериями. В этих экспериментах отбеленным поверхностно предварительно колонизированным взрослым особям, несущим в целом значительные популяции (103-10 5 КОЕ/червя, рисунок 5) комменсального Ochrobactrum MYb14-GFP или патогенного S. aureus-GFP, разрешалось бродить по убойным жарой газонам OP50 на агаре NGM в течение 1,5 ч. Когда эти черви повторно собирают из пластин экскреции и нарушают для количественной оценки бактерий, нет существенной связи между бактериальной нагрузкой и скоростью выведения живых бактерий (корреляции Пирсона между логарифмически трансформированными колониями / ч и КОЕ / червем: MYb14 rho = 0,19, p = 0,45; S. aureus rho = 0,02, p = 0,9) (рисунок 5). Также не существует значимой связи между наличием/отсутствием колоний на пластине и кишечной бактериальной нагрузкой (биномиальная логистическая регрессия с логарифмически преобразованной КОЕ/червем в качестве фактора: p = 0,15 при df = 53). Значительная часть пластин оставалась свободной от нового роста (9/18 пластин для MYb14, 10/36 пластин для S. aureus), что указывает на низкие общие показатели экскреции.

Когда червям разрешается выделяться на агаровые пластины, фактическое количество живых экскретированных бактерий на червя путается с «сельским хозяйством», где черви проходят через колонии и создают следы нового роста (рисунок 6)37. Пластина с n колониями представляет, по меньшей мере, одно и самое большее n событий, где были выведены живые колониеобразующие бактерии. Из этого наблюдения невозможно узнать, сколько событий экскреции в (1,n) фактически произошло, и невозможно узнать, сколько бактерий было выведено в каждом событии. Поэтому невозможно точно оценить скорость выведения живых бактерий из кишечника, используя эти данные. Тем не менее, можно вывести некоторые границы. Хотя количество колоний на пластину не очень информативно, данные о наличии/отсутствии могут быть использованы для грубого вывода о скорости экскреции. Для простоты, если предположить, что скорость выведения живых бактерий не является функцией бактериальной нагрузки и что экскреция является процессом Пуассона, существует ~ 50% вероятность наблюдения по крайней мере девяти событий в 18 испытаниях, когда λ ≈ 0,33 червя-1 hr-1 в MYb14. Для S. aureus получены аналогичные правдоподобные показатели λ ≈ 0,2 червя-1 ч-1 . Хотя эти грубые расчеты предполагают низкие темпы экскреции живых бактерий, для получения надежных оценок потребуется более точная количественная оценка этого процесса по большему количеству отдельных червей.

Доступность данных:
Данные, показанные здесь, доступны на Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.7wm37pvw2).

Figure 1
Рисунок 1. Обработка поверхности с низкой концентрацией быстро убивает бактерии в буфере, но не нарушает кишечные сообщества у парализованных холодом червей. (А-С) Бактериальная КОЕ/мл в буфере червей M9 во время поверхностного обесцвечивания при трех различных концентрациях (1:1000, 1:2000, 1:5000 v/v; неотбеленный контроль для сравнения), нацеливание (A) S. aureus Newman, (B) S. enterica LT2 или (C) E. coli OP50. Образцы были взяты в указанные моменты времени до 20 мин после воздействия и дважды промыты стерильным буфером, чтобы предотвратить уничтожение отбеливателем колоний на пластинах. Данные для условия 1:1000 слегка смещены, так что эти данные видны на графике. (Д-Ф) Кишечные бактерии у отдельных N2 червей (n = 24 червя за эксперимент, два или три независимых пробега в отдельные дни). Все сравнения количества КОЕ, связанных с поверхностным отбеливанием и без отбеливающими червями, являются незначительными (тест Уилкоксона с суммой рангов p > 0,05). Серые горизонтальные линии представляют порог обнаружения, определяемый как плотность (40 КОЕ/червь), при которой вероятность наблюдения по меньшей мере одной колонии составляет ~60% при покрытии 10 мкл аликвот из объемов 200 мкл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2. Протокол разрушения 96 скважин дает стабильные результаты и устойчив к выбору материалов. Взрослые черви N2, колонизированные одним видом бактерий в течение 48 ч (P. mosselii), были поверхностно обесцвечены и пронизаны в соответствии со стандартными протоколами, затем отдельные черви (n = 24 на состояние) были механически нарушены для покрытия КОЕ с использованием (A) ручного разрушения в отдельных трубках 0,5 мл, с использованием моторизованного пестика или (B-D). ) вариации протокола разрушения 96 скважин, подробно описанные в Протоколе. Разрушение проводили в червячном буфере М9, содержащем различные концентрации Тритона Х-100 (ось х, 0-0,1%, v/v) и одного из (В) 36-зернистого карбида кремния, (С) малых (425-600 мкм) стеклянных шариков или (D) больших (2,7 мм) стеклянных шариков. Для всех графиков показаны данные log10 (КОЕ/червь), и каждая точка представляет собой одного отдельного червя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3. Гетерогенная бактериальная колонизация кишечника C. elegans. (A) Одновидовая колонизация N2 взрослых гермафродитов, полученных в соответствии с Методами. Бактерии представляют собой четыре вида из коллекции микробиома нативных червей MYb (Dirksen et al. 2016) (n = 24 червя, по одному эксперименту каждый) и два патогена, Staphylococcus aureus MSSA Newman (SA) и Salmonella enterica LT2 (SE) (n = 96-144 червей в двух/трех независимых экспериментах). Колонизацию местными видами микробиома оценивали после 48-часовой инкубации при 25°C в жидкой среде S + 108 КОЕ/мл бактерий; колонизацию патогенами оценивали после инкубации на газонах на червячном агаре NGM в течение 24 (SA) или 48 (SE) ч при 25°C. (Через 48 ч черви на S. aureus в основном погибли.) (B) Общее количество КОЕ/червей у взрослых особей N2, daf-16(mu86) и daf-2(e1370), колонизированных в течение 4 дней в жидких средах на восьмивидовом минимальном местном микробиоме (данные Taylor and Vega, 2021)14. (С-Д) Зеленая флуоресценция у отдельных червей, колонизированных GFP-экспрессирующими бактериями, наблюдается с помощью цитометрии потока крупных объектов. В (C) синхронизированные популяции взрослых N2 были колонизированы OP50 (нефлуоресцентные, n = 1908 отдельных взрослых червей), S. aureus (GFP, n = 968) или S. enterica (GFP, n = 1153), как описано в (A); контроль OP50 показывает типичные уровни автофлуоресценции зеленого канала у взрослых N2-3-го дня. В (D) синхронизированные популяции N2 (n = 1165), daf-16(mu86) (n = 1180) и daf-2(e1370) (n = 2267) взрослые были колонизированы комменсальным Ochrobactrum MYb14-GFP в течение 2 дней на пластинах, как описано в (A). (Е-Ф) Ежедневные изменения в колонизации S. aureus (E) и S. enterica (F) (те же данные, что и на панели A и рисунке 1, n = 48 червей за эксперимент). Ось X указывает день отбора проб. Серые горизонтальные линии представляют порог обнаружения, определяемый как плотность, при которой вероятность наблюдения по меньшей мере одной колонии составляет ~60% (40 КОЕ/червь для одновидовой колонизации и четыре КОЕ/червя для многовидовой колонизации, из-за различных объемов покрытия 10 мкл и 100 мкл соответственно из 200 мкл). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4. Пакетирование стирает биологические вариации в искаженных данных логарифмического масштаба. Данные КОЕ/червя из рисунка 3 были ресамплитированы с заменой для создания n = 25 реплицированных наборов смоделированных данных для каждого размера пакета, где размер - это количество отдельных червей в пакете. КОЕ/червь — это общая КОЕ в каждой моделируемой партии, деленная на количество червей в партии. В необработанных данных (панель A) среднее значение КОЕ/червя для MYb53 составляет 4450,8 (103,6), а для MYb120 — 1398,3 (103,1); числа, выведенные из пакетов, сходятся к этим значениям по мере увеличения размера партии (B, пять червей на партию; C, 10 червей на партию; D, 20 червей/пакет), согласуется с ожиданиями от центральной предельной теоремы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5. Выведение живых бактерий плохо коррелирует с нагрузкой КОЕ в кишечнике отдельных глистов. Здесь взрослых особей N2 колонизировали путем кормления в течение 1 или 2 дней соответственно на лужайках S. aureus-GFP или MYb14-GFP. Черви с обнаруживаемой флуоресценцией GFP (общее количество GFP > 1,8 бревна на цитометре потока крупных объектов) были отсортированы из объемной популяции, поверхность обесцвечена, как описано в Методах, и перенесены индивидуально на NGM + термоубитые пластины OP50. Корреляции Пирсона между логарифмическими колониями/ч и КОЕ/червем незначительны (MYb14 rho = 0,19, p = 0,45; S. aureus rho = 0,02, p = 0,9). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6. Бактериальное «земледелие» скрывает количество событий экскреции на агаровых пластинах. Вот две пластины с колониями MYb14-GFP из экскрементов червей. Первая пластина (А) имеет четкие доказательства «земледелия» вдоль червячных путей и, по-видимому, представляет собой, по крайней мере, два отдельных события экскреции, основанных на различиях в экспрессии GFP (видимых как желтоватая пигментация) между колониями. В то время как вторая плита (B) более неоднозначна, сельское хозяйство не может быть исключено на основе позиций колоний. В этих экспериментах взрослых червей N2 предварительно колонизировали в течение 48 ч, питаясь агаровыми пластинами, содержащими газоны MYb14-GFP. После колонизации червей готовили и отбеливали поверхность в соответствии со Способами, затем переносили в 5 мкл аликвот червячного буфера M9 + 0,1% Triton X-100 до 6 см NGM + термоубитые пластины OP50 (приготовленные путем предоставления 50 мкл пятен 5x концентрированного теплоубийства OP50 высохнуть на поверхности). Червям разрешалось бродить в течение 1,5 ч при 25°C, затем их собирали с пластин и разрушали для КОЕ/червячного покрытия (ручное нарушение буфера 20 мкл в отдельных трубках 0,5 мл с использованием моторизованного пестика). Пластины инкубировали при 25°C в течение 2 дней перед подсчетом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 1. Визуализация червей N2, колонизированных флуоресцентной S. aureus GFP без поверхностного отбеливания. Небольшое количество флуоресцентных клеток на кутикуле перемещается в фокус и выходит из него, когда изображение проходит через тело червя, и пространственно гетерогенная колонизация кишечника становится видимой, когда поле зрения перемещается с поверхности тела в кишечник. Z-образное изображение было получено с 20-кратным увеличением на перевернутом флуоресцентном микроскопе. Флуоресцентные изображения с ярким полем и GFP-фильтром были наложены, а изображения по всему Z-стеку сшиты вместе с использованием программного обеспечения поставщика. Изображение взято с того же слайда, что и на дополнительном рисунке 2A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 2. Визуализация червя N2, колонизированного флуоресцентным S. aureus GFP с поверхностным отбеливанием (1:1000 v/v в течение 20 мин). Пространственно-гетерогенная колонизация флуоресцентными бактериями видна в кишечнике этого индивидуума, а бактерии проникли в ткани организма, что указывает на прогрессирующую инфекцию. На кутикуле не видно бактерий. Z-образное изображение было получено с 20-кратным увеличением на перевернутом флуоресцентном микроскопе. Флуоресцентные изображения с ярким полем и GFP-фильтром были наложены, а изображения по всему Z-стеку сшиты вместе с использованием программного обеспечения поставщика. Изображение взято с того же слайда, что и на дополнительном рисунке 2B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Дополнительный рисунок 1. Обзор Протокола. Здесь синхронизированные взрослые черви моноколонизируются красными бактериями, обесцвечиваются поверхностью и пермеабилизируются до механического разрушения отдельных червей в формате 96 лунок. Бактерии, высвобождаемые из кишечника, разбавляются в серии 10x для количественной оценки КОЕ/червя; показанные пластины характерны для наблюдаемой неоднородности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2. Визуализация червей N2, колонизированных флуоресцентной S. aureus GFP с поверхностным отбеливанием и без него (1:1000 v/v в течение 20 мин). (A) В неотбеленном образце внешние бактерии видны при низком увеличении в виде участков зеленой флуоресценции, не связанных с червями или фрагментами тела червей. (B) В отбеленном поверхности образце флуоресценция GFP ограничена внутренней частью тел червей (один фрагмент тела червя виден в середине изображения). Все снимки были сделаны с 4-кратным увеличением на перевернутом флуоресцентном микроскопе. Флуоресцентные изображения с ярким полем и GFP-фильтром были наложены, а изображения из смежных полей зрения сшиты вместе с использованием программного обеспечения поставщика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1: Рецепты буфера и раствора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь представлены данные о преимуществах количественной оценки бактериальной нагрузки у C. elegans одним червем, а также протокола разрушения 96 скважин, позволяющего быстро и последовательно получать большие наборы данных этого типа. По сравнению с существующими методами33, эти протоколы позволяют более высокопроизводительно измерять кишечные микробные сообщества у червя.

Этот подход имеет покрытие в качестве шага, ограничивающего скорость, и не является по-настоящему «высокопроизводительным». Цитометрия потока крупных объектов (рисунок 3C, D) является полезным высокопроизводительным методом количественной оценки флуоресцентно меченых бактерий у отдельных червей16, хотя количество одновременных флуорофоров является ограничением в многовидовых сообществах. Еще одним способом увеличения пропускной способности является увязка разрушения плит с несколькими скважинами с секвенированием сообщества; однако описанная здесь процедура разрушения 96 лунок была оптимизирована специально для того, чтобы оставить бактериальные клетки нетронутыми. Анализ на основе секвенирования, где желателен тщательный лизис клеток, потребует добавления стадии экстракции нуклеиновых кислот или модификации протокола биения (Протокол 3.10-3.11) для извлечения содержимого клеток вместо живых бактерий. Протоколы разрушения одного червя и экстракции нуклеиновых кислот были опубликованы в других местах38,39.

Общее количество бактерий в кишечнике червя неоднородно, и данные, показанные здесь, свидетельствуют о том, что периодическое измерение может дать ошибочные результаты при сравнении между группами. Однако другие меры бактериальных сообществ у червя могут быть менее чувствительными к последствиям дозирования. Следует отметить, что относительное изобилие в сообществах, связанных с червями, по-видимому, варьируется очень мало, если вообще варьируется с общим размером кишечной популяции, независимо от того, являются ли взаимодействия между микробами нейтральными40 или нет14. Вполне вероятно, что по сравнению с данными подсчета показатели относительного изобилия будут менее восприимчивы к описанной проблеме ложноположительной частоты. Поэтому анализ сообществ на основе секвенирования, который генерирует данные об относительном изобилии для состава сообщества, может не требовать измерения отдельных червей. По этому вопросу необходимо провести дальнейшее расследование.

Здесь мы используем холодную обработку, чтобы парализовать червей для поверхностного отбеливания. Другая работа показала, что черви быстро возобновляют нормальную активность (<15 мин), если время на льду держится менее 30 минут, что позволяет немедленно использовать в дальнейших анализах, в отличие от агентов химического паралича, которые могут потребовать длительных периодов до полного выздоровления34. Если черви должны быть немедленно разрушены для количественной оценки бактерий, эта функция является необязательной, и основным преимуществом охлаждения по сравнению с химическим параличом является избежание необходимости в контролируемом потоке отходов. Длительное лечение холодом следует использовать с осторожностью при исследовании реакций на стресс, особенно если есть известная связь с температурой. Протоколы холодного паралича, описанные здесь, влекут за собой более короткое острое воздействие холода, чем использовалось в экспериментах для холодного стресса (20-30 мин против 2+ ч при 2-4 ° C) 41,42,43, а холодный шок в течение 1 ч не производит видимого фенотипа у червей дикого типа 43. Кратковременная (90 мин) инкубация при 4 °C вызывает изменения в экспрессии гена холодного стресса (измеренную экспрессией репортера TMEM-135::GFP), но экспрессия возвращается к ненапряженным уровням в течение нескольких минут, как только черви возвращаются к комнатной температуре34. Однако воздействие на генотипы чувствительных к стрессу червей может быть более серьезным, чем у диких. Эта процедура должна быть проверена в экспериментальных условиях, которые будут использоваться.

Описанный здесь протокол отбеливания поверхности может быть использован как способ ограничения или устранения прохождения внешних микробов в экспериментах. Этот метод дополнительно использовался для очистки грибковых загрязнений путем поверхностного отбеливания и переноса только личинок L1 / L2 в свежие пластины (перенос поверхностно отбеленных взрослых особей привел к неспособности очистить загрязняющее вещество, предположительно из-за носительства в кишечнике более крупных животных). Критически важно следить за тем, чтобы концентрация отбеливателя не превышала 1:1000 v/v, так как это приведет к повреждению червей и смертности. Эта процедура может быть полезна в экспериментальной эволюции микроба-хозяина и взаимодействиях хозяин-патоген. Например, низкая скорость экскреции живых бактерий, наблюдаемая здесь, может помочь объяснить очень изменчивые скорости, наблюдаемые для передачи бактерий от гермафродитов к потомству15. Отсутствие корреляции между кишечной бактериальной нагрузкой и скоростью выведения, наблюдаемое здесь, интересно, но требует дальнейшего изучения; потребуется большее число точек данных по целому ряду условий, чтобы определить, где (или будет ли) проводиться это наблюдение.

Не всегда может быть необходимо очищать червей в той мере, в какой это обеспечивается поверхностным отбеливанием. Многократные промывки в стерильном буфере, вероятно, достаточны, когда черви внутренне колонизированы одним микробом, если минимальный ожидаемый КОЕ / червь намного выше (в 10-100 раз), чем концентрация бактерий в буферном супернатанте, поскольку этот перенос минимально повлияет на количество (см. Рисунок 1). Кроме того, если интересующий микроб (ы) в первую очередь колонизирует (ы) кутикулу, следует явно избегать поверхностного обесцвечивания. Тщательная очистка более важна для обеспечения точности при работе со смешанными микробными сообществами (чтобы гарантировать, что все колонии / считывания в образце взяты из червеобразных бактерий, а не из окружающей среды), когда бактерии, прилипшие к кутикуле, мешают чтению интернализованной популяции, когда ожидаемый минимальный УРОВЕНЬ КОЕ / червя низок и т. Д.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Х. Шуленберга и К. ЛаРока за их щедрое совместное использование бактериальных штаммов, используемых в этих экспериментах. Эта работа была поддержана финансированием Университета Эмори и NSF (PHY2014173).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL Evergreen Labware 290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) Axygen AM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wells Axygen P-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lids Evergreen Labware 290-8020-03L
Agar Fisher Scientific 443570050
Bead mill adapter set for 96-well plates QIAGEN 119900 Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) QIAGEN 85300 Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorter Union Biometrica By quotation Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite Clorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane Diversified Biotech BEM-1 Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific AC423525000
Cholesterol VWR AAA11470-30
Citric acid monohydrate Fisher Scientific AC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrate Fisher Scientific AC197722500
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge Corning  COR-6765
Disodium EDTA Fisher Scientific 409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics Fisher Scientific 327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural Eppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifuge Eppendorf 5406000640 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 Eppendorf 22627040 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 Eppendorf 22638930
Ethanol 100% Fisher Scientific BP2818500
Glass beads, 2.7 mm Life Science Products LS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm Sigma G877-500G
Glass plating beads VWR 76005-124
Hydrochloric acid VWR BDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrate Fisher Scientific 423731000
Kimble Kontes pellet pestle motor DWK Life Sciences 749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL DWK Life Sciences 749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage Leica 11889113
Leica LAS X Premium software Leica 11640687
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrate VWR 470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing film Amcor PM996
Peptone Fisher Scientific BP1420-500
Petri dishes, round, 10 cm VWR 25384-094
Petri dishes, round, 6 cm VWR 25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cm VWR 10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS) Gold Bio P-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallow Fisher Scientific 13-361-10
Potassium hydroxide Fisher Scientific AC134062500
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific BP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 R Foundation n/a
Scoop-type laboratory spatula, metal VWR 470149-438
Silicon carbide 36 grit MJR Tumblers n/a Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific BP166-100
Sodium hydroxide VWR BDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodum chloride Fisher Scientific BP358-1
Sucrose Fisher Scientific AC419760010
Tri-potassium citrate monohydrate Fisher Scientific AC611755000
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Zinc sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC205982500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
  2. Stephenson, J., et al. Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).
  3. VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology. Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).
  4. Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model. The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).
  5. Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans. Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).
  6. Yashin, A. I., et al. Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).
  7. Zhao, Y., et al. Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  8. Eckley, D. M., et al. Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans. AGE. 35 (3), 689-703 (2012).
  9. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  10. Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans. eLife. , (2021).
  11. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  12. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  13. Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53 (2009).
  14. Taylor, M., Vega, N. M. Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model. mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).
  15. Diaz, S. A., Restif, O. Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).
  16. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090 (2014).
  17. Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
  18. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
  19. Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut. Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).
  20. Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).
  21. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  22. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
  23. Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).
  24. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  25. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99 (2), 123-132 (1999).
  26. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
  27. Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  28. Revtovich, A. V., et al. Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans - Enterococcus faecium infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327 (2021).
  29. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
  30. Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).
  31. Wu, T., et al. Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides. Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).
  32. Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701 (2011).
  33. Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).
  34. Manjarrez, J. R., Mailler, R. Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods. Heliyon. 6 (7), 04263 (2020).
  35. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS ONE. 6 (4), 0019505 (2011).
  36. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921 (2003).
  37. Thutupalli, S., et al. Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).
  38. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
  39. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  40. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLOS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
  41. Gulyas, L., Powell, J. R. Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans. Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).
  42. Jiang, W., et al. A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans. eLife. 7, 35037 (2018).
  43. Robinson, J. D., Powell, J. R. Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans. BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).

Tags

Биология Выпуск 185 Caenorhabditis elegans микробиом гетерогенность микроб-хозяин бактерии передача
Использование данных об одном черве для количественной оценки гетерогенности в <em>caenorhabditis elegans-бактериальных</em> взаимодействиях
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taylor, M. N., Spandana Boddu, S.,… More

Taylor, M. N., Spandana Boddu, S., Vega, N. M. Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (185), e64027, doi:10.3791/64027 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter