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Neuroscience

Génération d’un modèle reproductible d’activation immunitaire maternelle en milieu de gestation à l’aide de Poly(I:C) pour étudier la susceptibilité et la résilience de la progéniture

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64095
Automatic Translation
1, 1
1Center for Neuroscience, UC Davis

Summary

L’infection maternelle est un facteur de risque de troubles neurodéveloppementaux. Les modèles murins d’activation immunitaire maternelle (AMI) peuvent élucider l’impact de l’infection sur le développement et le fonctionnement du cerveau. Ici, des lignes directrices générales et une procédure sont fournies pour produire une progéniture résistante et sensible exposée à l’AMI.

Abstract

L’activation immunitaire maternelle (MIA) pendant la grossesse est systématiquement liée à un risque accru de troubles neurodéveloppementaux et neuropsychiatriques chez la progéniture. Les modèles animaux d’AIM sont utilisés pour tester la causalité, étudier les mécanismes et développer des diagnostics et des traitements pour ces troubles. Malgré leur utilisation répandue, de nombreux modèles MIA souffrent d’un manque de reproductibilité et presque tous ignorent deux aspects importants de ce facteur de risque: (i) de nombreux descendants sont résilients à l’AIM, et (ii) les descendants sensibles peuvent présenter des combinaisons distinctes de phénotypes. Pour augmenter la reproductibilité et modéliser à la fois la susceptibilité et la résilience à l’AIM, l’immunoréactivité de base (BIR) des souris femelles avant la grossesse est utilisée pour prédire quelles grossesses entraîneront une progéniture résiliente ou une progéniture présentant des anomalies comportementales et moléculaires définies après une exposition à l’AIM. Ici, une méthode détaillée d’induction de l’AIM par injection intrapéritonéale (i.p.) du poly(I:C) mimique viral double brin (ARNds) à 12,5 jours de gestation est fournie. Cette méthode induit une réponse inflammatoire aiguë chez la mère, ce qui entraîne des perturbations du développement cérébral chez la souris qui correspondent à des domaines similaires touchés dans les troubles psychiatriques et neurodéveloppementaux humains (NDD).

Introduction

Les données épidémiologiques établissent un lien entre l’infection maternelle et un risque accru de troubles psychiatriques et de troubles du spectre autistique (TSA)1,2,3,4,5,6,7. Le modèle murin MIA a été développé pour tester la causalité et le rôle mécaniste de l’IMA dans l’étiologie de ces troubles, ainsi que pour identifier des biomarqueurs moléculaires et développer des outils diagnostiques et thérapeutiques 4,6. Malgré l’utilité de ce modèle et sa popularité croissante, il existe une variabilité considérable dans les protocoles d’induction de l’AIM dans le domaine, ce qui rend difficile la comparaison des résultats entre les études et la répétition des résultats 8,9. En outre, la plupart des itérations du modèle n’étudient pas deux aspects translationnels importants de l’AIM : (i) de nombreux descendants sont résilients à l’AIM, et (ii) les descendants sensibles peuvent présenter des combinaisons distinctes de phénotypes8.

Pour générer un modèle d’AIM reproductible, les chercheurs doivent rapporter au moins une mesure quantitative de l’ampleur de l’AIM induite chez les mères. Pour induire l’AMI pendant la gestation, notre laboratoire effectue des injections intrapéritonéales (i.p.) du polyinositique viral double brin d’ARN mimétique : l’acide polycytidilique [poly(I:C)]. Le poly(I:C) induit une cascade immunitaire semblable aux virus de la grippe lorsqu’il est reconnu par le récepteur de type Toll 3 (TLR3)10. En conséquence, poly(I:C) active la réponse de phase aiguë qui entraîne une élévation rapide des cytokines pro-inflammatoires 8,11,12. Des études antérieures ont démontré que l’élévation des cytokines pro-inflammatoires, y compris l’interleukine-6 (IL-6), est nécessaire pour produire des anomalies comportementales et une neuropathologie chez la progéniture à la suite de MIA11,12,13. Ainsi, le taux d’IL-6 dans le sérum maternel recueilli pendant son pic à 2,5 heures après l’injection de poly(I:C) est une mesure quantitative convaincante de l’AIM qui peut être utilisée pour comparer les résultats entre les laboratoires dans le domaine.

Afin de générer un modèle MIA qui aborde les éléments translationnellement essentiels de la résilience et de la susceptibilité avec un seul protocole d’induction 8,14, les chercheurs peuvent combiner des approches d’induction typiques avec la caractérisation de l’immunoréactivité de base (BIR) de la mère avant la grossesse8. Récemment, on a découvert que les souris C57BL/6 femelles vierges présentent un large éventail de réponses IL-6 à une faible dose d’exposition au poly(I:C) avant la grossesse8. Ce n’est qu’un sous-ensemble de ces femelles qui produisent une progéniture sensible, et seulement à certaines amplitudes d’activation immunitaire dictées par la combinaison du BIR et dela dose 8 de poly(I:C). MIA induit des phénotypes dans un motif en U inversé; La progéniture présente les plus grandes aberrations comportementales et moléculaires lorsque les mères sont modérément immunoréactives et que l’ampleur de l’inflammation maternelle atteint, mais ne dépasse pas, une plage critique8. Ici, une méthode détaillée sur la façon de créer de manière fiable une progéniture résiliente et sensible avec des phénotypes comportementaux divergents à la suite d’une injection de poly(I: C) en milieu de gestation est fournie.

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Protocol

Tous les protocoles sont effectués sous l’approbation du comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Californie-Davis.

1. Préparation des animaux

  1. Lors de l’acquisition d’animaux, gardez les paramètres suivants cohérents pour assurer une reproductibilité maximale.
    1. Fournisseur et emplacement du fournisseur : comme indiqué précédemment, les souris sauvages de type C57BL/6J présentent des réponses différentes à la même dose de poly(I:C) selon le fournisseur8. Choisissez un fournisseur et une souche de souris qui montrent une réponse cohérente. Pour les expériences ici, les souris C57BL / 6 obtenues de Charles River ont montré des changements constants de comportement après exposition à l’AMI en milieu de gestation, tandis que celles achetées à Taconic montrent une réponse de plus grande ampleur, avec quelques différences entre les groupes de traitement par rapport aux souris Charles River8.
    2. Souche : Les souris C57BL/6J sont les plus couramment utilisées, mais les souris BTBR et d’autres souches présentent des réponses différentielles au MIA9 en milieu de gestation. Notez ces réponses différentielles, car elles améliorent la reproductibilité de la méthode et peuvent être une variable potentielle contribuant aux résultats différentiels chez la progéniture.
    3. Pour assurer une variabilité minimale, n’utiliser que des femelles vierges pour les études MIA8 et noter clairement les détails dans les méthodes.
    4. Âge à l’expédition et période d’acclimatation: les souris expédiées avant 7 semaines présentent un système endocrinien dérégulé15. Laisser les animaux s’acclimater pendant un minimum de 48 h16,17. Commandez des souris à expédier à 7 semaines (± 2 jours) et injectez pour le BIR à 8 semaines (± 2 jours).
    5. Âge au moment de l’accouplement : le système immunitaire des animaux est dynamique tout au long de leur vie. Prenez soin de minimiser la variabilité en gardant l’âge à l’accouplement/injection aussi constant que possible18,19,20. Accoupler les souris femelles à 9 semaines (± 2 jours). N’utilisez pas de mâles de plus de 6 mois pour l’accouplement.

2. Essais et préparation des lots Poly(I:C)

  1. Préparer le poly(I:C) de haut poids moléculaire comme décrit ci-dessous.
    1. Autoclave 1,5 mL tubes microcentrifugeuses pour le stockage. Le poly(I:C) remis en suspension peut être conservé à -20 °C, mais les dégels répétés peuvent avoir une incidence sur la puissance. Chauffer le bain-marie à 70 °C.
    2. En utilisant une technique stérile, ajouter 10 mL de solution saline physiologique stérile (NaCl 0,9%) au poly(I:C) lyophilisé à l’aide d’une seringue. Chauffer au bain-marie à 70 °C pendant 15 min pour permettre un recuit complet. Retirer et laisser refroidir à température ambiante.
    3. Dans une hotte stérile, ajouter 40 ml supplémentaires de solution saline physiologique au flacon et retourner plusieurs fois pour mélanger. Retirez le dessus du flacon en poly(I:C) ou utilisez une seringue pour l’aliquoter dans des tubes microcentrifugeuses de 1,5 mL. Conserver à -20 °C.
  2. Préparer le poly(I:C) de poids moléculaire mixte comme décrit ci-dessous.
    1. Autoclave 1,5 mL tubes microcentrifugeuses pour le stockage. Le poly(I:C) remis en suspension peut être conservé à -20 °C, mais des gels répétés peuvent avoir une incidence sur la puissance. Réglez le bain-marie à 50 °C.
    2. En utilisant une technique stérile, ajouter 10 mL de NaCl stérile à 0,9% au poly(I:C) lyophilisé et fixer le couvercle. Chauffer au bain-marie à 50 °C pendant 25 min pour permettre un recuit complet. Retirer et laisser refroidir à température ambiante.
    3. À l’aide d’une technique stérile, extraire la partie aliquote dans des tubes microcentrifugés de 1,5 mL et conserver à -20 °C.
  3. Administrer poly(I:C) par injections intrapéritonéales (i.p.) comme décrit ci-dessous.
    1. Pesez la souris pour déterminer le dosage précis. À l’aide d’une aiguille à insuline de 0,5 cc, dessinez du poly(I:C) remis en suspension. Frottez la souris et retournez pour que l’abdomen soit exposé.
    2. À l’aide de l’autre main, insérez l’aiguille à une profondeur d’environ 0,5 cm entre les deux mamelons antérieurs à un angle d’environ 45°.
    3. Tirez pour déterminer qu’aucun sang ou urine ne pénètre dans la seringue avant l’injection. Si l’un ou l’autre se produit, repositionnez l’aiguille et réessayez. Injectez lentement. Si le poly(I:C) bouillonne, l’injection était probablement sous-cutanée. Un placement d’injection réussi n’entraînera rien à dessiner une fois l’aiguille insérée, et aucune fuite une fois qu’elle est retirée.
  4. Testez la puissance du lot poly(I:C) MMW comme décrit ci-dessous8.
    1. Obtenir la forme désirée de poly(I:C). Certains fabricants permettront aux chercheurs de mettre en attente un lot complet ou partiel pendant que la puissance est testée afin que plusieurs bouteilles puissent être obtenues plus tard simultanément. En règle générale, ceux-ci peuvent être conservés lyophilisés à -20 ° C pendant plusieurs années si le gel-dégel est évité.
    2. Obtenir ou élever 30 mères gravides pour les tests. À E12.5, effectuer des injections i.p. de 20, 30 et 40 mg / kg dans un minimum de 10 souris par dose.
    3. 2,5 h après l’injection, prélever du sang par saignement de queue. Notez que le sang périphérique et le sang du tronc peuvent différer dans les niveaux de cytokines, alors gardez la méthode de collecte cohérente dans une étude.
    4. Laissez le sang coaguler pendant la nuit à température ambiante. Après 12-24 h, faire tourner les échantillons de sang à 3 768 x g à 4 °C pendant 8 min. Prélever le sérum et conserver à -80 °C jusqu’à analyse.
    5. Isoler le sérum et mesurer les taux d’IL-6 via ELISA ou Luminex. Gardez les outils de mesure cohérents car il existe une variabilité significative de la concentration totale mesurée selon les modalités et les fabricants. Déterminer l’ampleur de la réponse IL-6 nécessaire pour induire des phénotypes à l’aide d’une cohorte pilote.

3. Test d’immunoréactivité de base (BIR)

Remarque : La figure 1 montre le schéma des étapes. Utiliser un poly(I:C) de poids moléculaire différent pour les tests BIR par rapport à la gestation afin de réduire la probabilité de réponses immunitaires adaptatives au composé.

  1. Commandez des souris femelles vierges à expédier à l’âge de 7 semaines. À l’arrivée, groupez et hébergez quatre à cinq souris dans une cage et gardez le groupe logé jusqu’à ce qu’elles s’accouplent. Utilisez une encoche auriculaire ou tout autre système d’identification.
  2. Injecter aux femelles par voie intrapéritonéale 5 mg/kg de poly(I:C) 1 semaine après l’arrivée. À 2,5 heures après l’injection, lorsque l’IL-6 circulante est la plus élevée6, prélever du sang total sur les animaux injectés par coupure de queue.
  3. Laissez le sang coaguler pendant la nuit à température ambiante. Après 12-24 h, faire tourner les échantillons de sang à 3 768 x g à 4 °C pendant 8 min.
  4. Prélever un minimum de 32 μL de sérum dans chaque échantillon. Congeler à -80 °C jusqu’à ce que vous soyez prêt à tester les cytokines. Pour mesurer les niveaux d’IL-6 de manière plus cohérente, utilisez un test multiplex tel que Luminex. Gardez les outils de mesure cohérents car il existe une variabilité significative de la concentration totale mesurée selon les modalités et les fabricants.
    1. Pour le protocole d’essai de Luminex, voir Bruce et coll.21.
  5. À l’aide des niveaux relatifs d’IL-6, diviser les animaux en groupes BIR faible (quartile inférieur), moyen (deux quartiles du milieu) et élevé (quartile supérieur).

4. Méthode de purge de la queue pour la collecte de sang

REMARQUE: Pour éviter l’utilisation de sédatifs potentiellement immunomodulateurs, utilisez la méthode de prélèvement sanguin de saignement de queue.

  1. Pour l’installer, placez un support de soudure et une tasse de retenue sur une surface du côté de la main non dominante. Dans une boîte de Pétri de 35 mm, ajouter 1 à 2 ml d’huile comestible de qualité alimentaire. Retirez le capuchon du bouchon sanguin rapide et placez-le près de l’installation.
  2. Placez quelques couches de papier essuie-tout sur le support de soudure et le premier tube capillaire dans un clip, en le positionnant près de l’endroit où le bout de la queue de la souris sera tenu et maintenu parallèle à la surface de la table. Ayez une lame de rasoir à portée de main.
  3. Pour prélever le sang, procédez comme suit.
    1. Au moment requis, retirez la souris de la cage et placez-la sous la tasse avec sa queue sortant de l’encoche à la base. À l’aide d’une lame de rasoir fraîche, coupez l’extrémité (1-2 mm) de la queue et recueillez la première goutte de sang dans le tube capillaire attaché au support de soudure.
    2. Trempez les doigts de la main dominante dans l’huile comestible et utilisez-les pour presser de la base de la queue à la pointe, guidant l’extrémité de la queue vers le tube capillaire pour recueillir les gouttes de sang résultantes. Continuez jusqu’à ce que ~200 μL de sang aient été recueillis.
    3. Placez un petit capuchon d’extrémité sur l’extrémité effilée du tube capillaire avant le capuchon supérieur. Si le capuchon supérieur est mis en premier, l’échantillon sera expulsé de l’extrémité conique du tube. Placez le tube dans la coque extérieure de protection.
    4. Laisser coaguler pendant la nuit à température ambiante. Refroidir une microcentrifugeuse à 4 °C et faire tourner le sang vers le bas comme indiqué à l’étape 3.3.

Figure 1
Graphique 1. Le calendrier pour tester l’immunoréactivité de base et l’accouplement des femelles vierges. Commandez aux souris d’arriver à l’âge de 7 semaines et laissez-les s’acclimater à l’installation pendant 1 semaine. Injecter aux animaux 5 mg/kg de poly(I:C) et prélever du sang 2,5 heures plus tard. Laisser coaguler le sang pendant la nuit, puis centrifuger à 3 768 x g, 4 °C pendant 8 min. Recueillir le sérum et évaluer les taux relatifs d’IL-6 via ELISA ou Multiplex. À l’âge de 9 semaines, mettez en place des couples d’accouplement. Créé à l’aide de BioRender.com Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Méthode basée sur le poids pour l’accouplement et l’injection gestationnelle de E12.5

Remarque : La figure 2 montre le schéma des étapes. Deux méthodes peuvent être utilisées pour configurer les couples d’accouplement et déterminer le point temporel E12.5. Le premier, l’accouplement chronométré, est décrit ailleurs22. Les calculs basés sur le poids peuvent également être utilisés pour évaluer une grossesse E12.523. L’avantage de cette approche est qu’elle permet de verrouiller l’âge de la mère au moment de l’accouplement, ce qui diminue la variabilité de la réponse immunitaire. Cette procédure est utilisée ici.

  1. Placez les mâles dans des cages propres et laissez-les s’acclimater pendant au moins 2 h. Cela diminue la probabilité d’agression féminine car les mâles formeront déjà une odeur dominante dans la cage.
  2. Mettez en place des couples reproducteurs mâles célibataires, femelles simples en ajoutant la femelle à la cage du mâle. Avant de la placer dans la cage, pesez-la et notez le poids. Ajoutez une petite poignée de graines de tournesol à chaque cage pour augmenter l’efficacité de l’accouplement.
  3. Pour déterminer l’étendue du gain de poids, procédez comme suit.
    1. Obtenez un groupe test de femelles et mettez en place des couples d’accouplement, en enregistrant le poids au moment de l’accouplement.
    2. Lorsque les femelles commencent à paraître visiblement enceintes, pesez-les et divisez-les en sous-ensembles de 8,5 g, 9,5 g, 10,5 g et 11,5 g de gain de poids. Les fœtus à E12.5 viennent de commencer à développer des doigts distincts dans leurs pattes. Utilisez la morphologie fœtale pour déterminer le gain de poids moyen pour atteindre E12.5.
  4. À 12 jours après l’accouplement, pesez les femelles et déterminez le gain de poids. Dans une installation d’essai, les femelles gagnent constamment de 9,5 à 10,5 g entre le moment de l’accouplement et E12,5. Injecter par voie intraveineuse la dose de poly(I:C) solubilisée déterminée à l’étape 2.3.2 lorsque la prise de poids de la femelle se situe dans la plage prédéterminée.
  5. Observez la réponse à l’AMI dans les barrages à l’aide des paramètres suivants.
    1. Comportement de maladie: Recueillir des scores subjectifs sur une échelle de 1 à 3 pour déterminer comment les barrages deviennent actifs en réponse à la manipulation, où 1 est peu ou pas de mouvement en réponse à la manipulation et 3 est une réponse normale à la capture et à la retenue. Les animaux ayant une plus grande réponse immunitaire montreront moins de résistance à la manipulation8.
    2. Réponse fébrile : À l’aide d’un thermomètre IR, recueillir les températures pré-injection et 2,5 h après l’injection. Les animaux présentant des réponses immunitaires de plus grande ampleur présentent souvent une hypothermie en réponse à une activité immunitaire plus importante8.
    3. Changement de poids : Peser les animaux 24 h après l’injection. Les animaux ayant des réponses immunitaires de plus grande ampleur perdent généralement plus de poids8.
    4. Mesurer les niveaux d’IL-6 gestationnelle comme suit8.
      1. À 2,5 heures après l’injection, prélever du sang avec la méthode préférée. Laissez le sang coaguler pendant la nuit à température ambiante. Après 12-24 h, faire tourner les échantillons de sang à 3 768 x g à 4 °C pendant 8 min.
      2. Prélever le sérum et conserver à -80 °C jusqu’à analyse. Isoler le sérum et mesurer les taux d’IL-6 via ELISA ou Luminex. Gardez les outils de mesure cohérents car il existe une variabilité significative de la concentration totale mesurée selon les modalités et les fabricants.
      3. Abriter individuellement le barrage après l’injection avec un enrichissement approprié comme des nids et des dispositifs d’enrichissement. Gardez tout enrichissement cohérent car les modifications de l’enrichissement peuvent avoir des impacts significatifs sur le comportement des rongeurs 24,25,26,27,28,29.
  6. Le temps de gestation pour les souris C57 varie de 18,5 à 20,5 jours. Effectuer des vérifications de la portée pour déterminer si les animaux sont nés dans cette plage afin de s’assurer que l’injection a été effectuée au bon moment. Lorsque vous vérifiez la présence de portées, dérangez le moins possible la cage. Le stress immédiatement après la naissance de la portée peut augmenter le risque de cannibalisation.

Figure 2
Graphique 2. Induction MIA. L’induction de l’AMI nécessite une évaluation de la grossesse, une injection intraveineuse de poly(I:C) et des contrôles de la portée pour assurer le bon moment de l’inflammation maternelle. Après avoir évalué le jour gestationnel par accouplement chronométré ou par la méthode de gain de poids, administrer une injection intraveineuse de poly(I:C) à E12.5. Prélever un échantillon de sang 2,5 heures après l’injection pour confirmer l’activation immunitaire et déterminer le niveau d’activation de l’IL-6. Les portées naîtront à environ E18.5-E20.5. Créé à l’aide de BioRender.com Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Enquête sur les altérations du comportement chez l’adulte MIA et la progéniture témoin (facultatif)

  1. À partir de P60 et avant d’effectuer des tests comportementaux, acclimater les animaux au contact humain avec une manipulation douce pendant 1 min par jour pendant 3 jours consécutifs. Assurez-vous que les jours de changement de cage ne se produisent pas le même jour que les tests comportementaux.
  2. Laissez toujours les souris s’acclimater à la salle de test pendant 30 à 60 minutes avant de commencer les tests comportementaux. Utilisez des pièces faiblement éclairées (15-20 lux) pour minimiser l’anxiété.
  3. Pour le toilettage répétitif, placez les souris seules dans des cages propres et sans litière avec des couvercles. À l’aide d’une caméra, enregistrez les souris dans ces cages pendant 20 minutes. Les 10 premières minutes fonctionnent comme une période d’acclimatation, les 10 dernières minutes sont la période d’essai.
  4. À l’aide de vidéos enregistrées et d’un chronomètre, notez le temps de toilettage cumulé pour chaque souris pendant la période de test de 10 minutes. D’autres comportements qui peuvent être notés à partir de ces vidéos incluent l’élevage (debout sur les pattes arrière), le gel et le saut8.
  5. Utilisez d’autres tests courants pour le modèle MIA tels que l’inhibition prépulsée (PPI) 14,30,31,32, champ ouvert12,33,34, approche sociale à 3 chambres 13,35,36, reconnaissance d’objets nouveaux 37, labyrinthe y 30, labyrinthe élevé plus labyrinthe33 et conditionnement de la peurcontextuelle / cued 38.
  6. Immunoblot postnatal8 (facultatif)
    1. À P0, décapiter rapidement et disséquer le tissu cérébral fœtal dans le HBSS, congeler dans de l’azote liquide et stocker à −80 °C.
    2. Perturber les échantillons à l’aide d’un sonde d’amplitude de 20% pendant 5 s dans 2x tampon Laemmli, puis dénaturer à 85 °C pendant 5 min. Centrifuger le lysat à 16 000 x g pendant 10 min à température ambiante. Collecter le surnageant et conserver à -80 °C.
    3. Mesurer la teneur totale en protéines à l’aide d’une trousse commerciale d’analyse des protéines BCA, en suivant les instructions du fabricant, et utiliser l’albumine sérique bovine comme étalon.
    4. Ajouter le dithiothréitol comme agent réducteur aux échantillons à une concentration finale de 100 mM. Chauffer à 85 °C pendant 2 min avant de charger sur un gel.
    5. Exécutez 5 μg/voie de protéines dans des conditions réductrices sur des gels TGS à 7,5 % et transférez-les électrophorètiquement sur des membranes PVDF. Bloquer les membranes avec un tampon de blocage et incuber avec les anticorps choisis.
    6. Laver trois fois avec TBS + 0,05% Tween 20 et incuber les membranes pendant 45 min avec des anticorps secondaires marqués par fluorescence.
    7. Lavez quatre fois de plus dans TBS/Tween 20 et les résultats de l’image. Normaliser les résultats à l’aide de β-tubuline, détectée à l’aide d’anti-β-tubuline.

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Representative Results

Tous les animaux exposés à 30 mg/kg de poly(I:C) à E12.5 ne produisent pas de progéniture avec des anomalies comportementales constantes 8,31. Bien que 30 mg/kg et 40 mg/kg de poly(I:C) produisent de manière fiable des comportements de maladie chez les mères, y compris une diminution des niveaux d’activité, des réponses hypothermiques et une perte de poids, et provoquent également des élévations significatives de l’IL-6, seul un sous-ensemble de portées exposées à l’AMI développera des anomalies comportementales dans des domaines similaires à ceux observés en psychiatrie humaine et en NDD (Figure 3A-C)8 . Une dose plus faible de 20 mg/kg de poly(I:C) induit également un comportement pathologique et une perte de poids, mais contrairement à des doses plus élevées, elle ne produit pas systématiquement des réponses IL-6 suffisamment importantes pour induire des aberrations comportementales chez la progéniture, même si les réponses IL-6 sont élevées bien au-dessus de celles des mères injectées avec une solution saline (Figure 3D)8.

Figure 3
Graphique 3. Différentes doses de poly(I:C) entraînent des effets différentiels chez les mères. (A) Les mères exposées à 20 mg/kg, 30 mg/kg ou 40 mg/kg de poly(I:C) ont connu une diminution de l’activité sur une échelle subjective (ANOVA unidirectionnelle; P < 0,0001). (B) Les barrages exposés seulement à 30 mg/kg de poly(I:C) ont montré une température significativement modifiée sous la forme d’une réponse hypothermique (ANOVA unidirectionnelle; F3,35 = 4,289, P < 0,05). (C) 30 mg/kg de poly(I:C) et 40 mg/kg de poly(I:C) ont induit une perte de poids significative (ANOVA unidirectionnelle; F7 187 = 26,93, P < 0,0001) et (D) ont montré des taux élevés d’IL-6 au-dessus du seuil requis pour induire des altérations comportementales (ANOVA unidirectionnelle; F3,35 = 25,54, P < 0,0001). (E) L’immunoréactivité de base chez les femelles isogéniques C57BL/6J est très variable, et la catégorisation des femelles BIR en groupes faible, moyen et élevé permet aux chercheurs de prédire quels descendants sont les plus susceptibles d’être sensibles à l’impact de l’AMI. Les barres représentent la moyenne ± SEM. Cette figure a été modifiée à partir d’Estes et al.8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

De façon inattendue, les souris vierges femelles C57BL/6 présentent une immunoréactivité de base (BIR) très variable à une faible dose de poly(I:C) (5 mg/kg de poly(I:C)) avant la gestation, même si elles sont isogéniques, et cette variabilité n’est pas associée au poids (Figure 3E, Figure supplémentaire 1)8. Les mères auxquelles on a injecté 5 mg/kg de poly(I:C) avant la gestation et dont les réponses IL-6 se situent à 50 % (mères BIR moyennes) produisent une progéniture mâle adulte avec des altérations des taux de protéines STAT3, MEF2 et tyrosine hydroxylase dans le tissu striatal P0 (Figure 4C-E)8. La progéniture mâle des mères BIR moyennes exposées à 30 mg/kg de poly(I:C) présente également une densité synaptique réduite et un complexe majeur d’histocompatibilité I (CMH) élevé dans la culture neuronale dissociée (Figure 4A,B)8. Les mères injectées 5 mg/kg de poly(I:C) avant la gestation dont les réponses IL-6 se situent au milieu de 50 % (mères BIR moyennes) produisent de manière fiable une progéniture mâle adulte présentant des comportements répétitifs élevés et un comportement exploratoire diminué lorsqu’elles sont exposées à 30 mg/kg de poly(I:C) à E12,5 (Figure 5A-F)8.

Inversement, les souris du groupe BIR élevé (avec des niveaux d’IL-6 dans les 25% supérieurs lorsqu’elles sont exposées à 5 mg / kg de poly(I: C) avant la grossesse) produisent de manière fiable une progéniture sans changements de comportement répétitifs après MIA. Cependant, la progéniture mâle de ces barrages BIR élevés présente un comportement exploratoire élevé après MIA (Figure 5D)8. Ensemble, ces résultats indiquent que l’AIM peut entraîner des résultats différentiels chez la progéniture, en fonction du BIR8 de la mère.

Figure 4
Graphique 4. Une dose intermédiaire de poly(I:C) et de BIR conduit aux meilleurs résultats dans les modèles MIA. (A) Les neurones corticaux de la progéniture exposée à l’activation immunitaire maternelle en milieu de gestation ont montré une augmentation significative de la présentation de l’ICM uniquement lorsque les mères ont reçu 30 mg/kg de poly(I:C) (ANOVA unidirectionnelle; F3,19 = 5,156, P < 0,01). (B) En revanche, toutes les doses (20 mg/kg, 30 mg/kg et 40 mg/kg) ont entraîné une diminution significative de la densité synaptique dans la culture neuronale dissociée (ANOVA unidirectionnelle; F3,43 = 11,01, P < 0,0001). (C-E) P0 striatal Western blots présente des STAT3, MEF2A et TH élevés, uniquement chez les animaux dont les mères avaient des BIR moyens et ont été exposées à 30 mg/kg de poly(I:C) (ANOVA unidirectionnelle; MEF2A: F3,24 = 3,968, P < 0,05; STAT3: F3,24 = 6,401, P < 0,01; TH: F3,24 = 3,668, P < 0,05). Les barres représentent la moyenne ± SEM. Cette figure a été modifiée à partir d’Estes et al.8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les animaux sensibles des groupes BIR moyen 30 mg/kg et BIR élevé 30 mg/kg peuvent être comparés non seulement à des témoins, mais aussi à des animaux résilients. L’injection de digues BIR moyennes avec une dose encore plus élevée de 40 mg/kg de poly(I:C) produit une progéniture sans altération significative du comportement identifiée à l’aide des tests utilisés à ce jour (Figure 5A-F)8. Cela suggère une relation en U inversé entre l’activation immunitaire et la susceptibilité à l’AMI.

Figure 5
Graphique 5. La progéniture mâle des mères exposées à une dose intermédiaire de poly(I:C) présente les plus grandes altérations du comportement. (A-F) Descendance mâle de mères exposées à 30 mg/kg de poly(I:C) (ANOVA unidirectionnelle nichée; F3,27 = 8,775; Faible : P = 0,0427; Moyen : P = 0,0062; Élevé : (P = 0,9568) mais pas 20 mg/kg ou 40 mg/kg de poly(I:C) présentent des altérations du toilettage répétitif et du comportement d’élevage exploratoire. De plus, les animaux du groupe de traitement poly(I:C) à 30 mg/kg présentent des formes disparates de susceptibilité, et la progéniture mâle de mères BIR moyennes montre un comportement répétitif accru et une exploration réduite, tandis que la progéniture mâle de mères à taux élevé de BIR ne montre aucune altération du comportement répétitif, mais a un comportement exploratoire accru (A, D ; ANOVA unidirectionnelle imbriquée; F3,15 = 9,407, Faible : P = 0,4910 ; Moyenne : P < 0,001 ; Haute : P = 0,0117). La progéniture exposée à 20 mg/kg de poly(I:C) ne semblait pas atteindre le seuil d’activation immunitaire requis pour modifier le développement neuronal puisqu’elle ne présentait aucune altération des comportements testés, tandis que la progéniture exposée à 40 mg/kg de poly(I:C) était également la plupart du temps résiliente à ses effets (B, C, E, F). Les barres représentent la moyenne ± SEM. Cette figure a été modifiée à partir d’Estes et al.8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1. L’immunoréactivité initiale n’est pas corrélée au poids de l’animal. Les souris femelles vierges présentent une large gamme de réponses IL-6 à 5 mg/kg de Poly(I:C) injecté avant la gestation d’une manière indépendante du poids, R2 = 0,0086, P = 0,9. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

L’infection maternelle modifie le cours du développement du cerveau chez l’homme et chez les rongeurs et les primates non humains 4,5,7. Ici, une procédure pour induire l’AMI chez les souris à un point temporel de mi-gestation en utilisant poly(I: C) est décrite. Cette méthode intègre l’évaluation du BIR avant la grossesse, ce qui augmente la reproductibilité et offre la possibilité d’étudier mécaniquement les mécanismes qui conduisent à la résilience et à la susceptibilité de la progéniture au MIA8. Après MIA, les mères du groupe BIR moyen (avec des niveaux d’IL-6 dans le milieu 50%) génèrent de manière fiable une progéniture adulte avec des altérations des comportements répétitifs, des altérations des niveaux de MHCI sur les neurones de la progéniture nouveau-née telles que déterminées par immunocytochimie, et des niveaux élevés de tyrosine hydroxylase striatale, MEF2 et protéine STAT3 de la progéniture nouveau-née déterminée par Western blot8.

L’utilisation de l’AIM comme modèle environnemental confère une pertinence translationnelle accrue car elle répond aux critères d’un modèle de maladie : construction, visage et validité prédictive7. Cependant, comme pour tout modèle environnemental, il faut prendre grand soin de minimiser les variables externes. De nombreux facteurs tels que le vendeur, le lot poly(I:C), le moment de l’injection, l’âge des mères et même le système de cage peuvent modifier l’impact de l’AMI sur la progéniture 8,9,39. Comme indiqué précédemment, la puissance du poly(I:C) est incohérente entre les fabricants, les lots et même les bouteilles d’un lot en raison de la grande variabilité des concentrations d’ARNds et des poids moléculaires 8,40. Étant donné que cette variabilité peut accroître l’hétérogénéité de la réponse immunitaire maternelle, il est essentiel que les laboratoires déterminent la dose efficace pour chaque lot afin de maintenir une reproductibilité maximale dans les phénotypes observables. Par exemple, il a été noté que les souris Charles River exposées à l’AIM produisent des phénotypes BIR et dose-dépendants constants dans la progéniture, et les souris de Taconic peuvent également être touchées de manière similaire, avec quelques différences entre les groupes de traitement8. De plus, il est essentiel que les chercheurs normalisent les pratiques d’élevage et tiennent des registres détaillés pour accroître la reproductibilité du modèle. La publication rédigée par Kentner et al. a décrit les nombreux détails qui devraient être inclus dans les rapports expérimentaux et peut également servir de liste de contrôle pour les chercheurs lorsqu’ils finalisent leurs protocoles9.

Le BIR est évalué à l’aide des taux sériques relatifs d’interleukine-6 (IL-6) de souris femelles vierges. La division de ces souris en trois groupes (faible, moyen et élevé) révèle des modèles résilients et sensibles reproductibles8. Étant donné que le BIR est une question de concentration relative d’IL-6, il n’est pas crucial de tester rigoureusement la puissance poly(I:C) de haut poids moléculaire comme cela est nécessaire avec le poly(I:C) de poids moléculaire mixte utilisé pour induire l’activation immunitaire maternelle pendant la gestation. Le BIR est une mesure relativement nouvelle qui peut ne pas réduire tous les résultats variables.

Les réponses immunitaires des mères lors de leur première exposition à des doses gestationnelles de poly(I:C) peuvent différer de leur réponse lors de grossesses et d’expositions ultérieures. À cette fin, l’utilisation de femelles vierges réduit le potentiel de variabilité que les altérations de la réponse immunitaire résultant de grossesses multiples pourraient présenter. La méthode basée sur le poids de l’estimation du point temporel de la grossesse est nécessaire car les souris ne tombent souvent pas enceintes dans les 24 premières heures suivant l’accouplement.

Il est important de noter que ce modèle présente des défis statistiques. Parce que l’AMI est induite chez les mères, la progéniture ne peut pas être randomisée dans les conditions de traitement. Ainsi, chaque portée doit être considérée comme un n de 1 9,41,42, et les individus au sein de cette portée doivent être moyennés pour créer chaque point de données. Le plan statistique le plus approprié pour ces données utilise donc des analyses imbriquées8. Un minimum de six portées par groupe (BIR x dose) est nécessaire pour détecter de manière fiable les altérations des mesures comportementales et moléculaires. Des différences significatives entre les sexes ont été largement notées dans la littérature de l’AIM et, par conséquent, les sexes ne devraient jamais être regroupés dans les analyses 8,9,43,44.

Le BIR est un outil prédictif relativement nouveau, et il n’a pas encore été défini en termes d’impact mécaniste. On ne sait toujours pas si le BIR est associé à des réponses immunitaires gestationnelles spécifiques, mais la réponse IL-6 des souris avant la grossesse n’est pas équivalente à leur réponse pendant la grossesse8. Le BIR représente donc une mesure prédictive corrélative, et d’autres recherches sont en cours pour déterminer ses origines.

Malgré la variabilité inhérente au modèle MIA, aucun autre modèle environnemental des troubles neuropsychiatriques et des NDD à ce jour ne peut fournir le même niveau de pertinence translationnelle. Une préparation et des essais pilotes approfondis sont nécessaires pour assurer la cohérence du modèle MIA, mais la robustesse des résultats phénotypiques compense cet investissement initial. En fin de compte, les modèles animaux MIA offrent un potentiel inégalé pour étudier un facteur de risque unique qui crée des grappes divergentes et distinctes d’altérations comportementales et moléculaires chez la progéniture, similaires à celles observées dans les populations humaines.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions la Dre Myka Estes pour sa persévérance à aborder la variabilité dans le modèle d’AIM chez la souris et tous les contributeurs d’Estes et al.8 pour leur travail qui a mené à l’élaboration du protocole méthodologique décrit ici. La recherche rapportée ici a été soutenue par NIMH 2P50 MH106438-06 (A.K.M.) et NIMH T32MH112507 (K.P.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% NaCl physiological endotoxin free saline Sigma-Aldrich 7647-14-5 Control and vehicle for Poly(I:C)
35mm petri dish Thomas Scientific 1219Z45 Used to hold oil during tail bleed
7.5% TGX gels Bio-rad 4561084 Optional
Ancare Nestlets Fisher Scientific NC9365966 Optional
anti-β-tubulin Millipore MAB3408 Optional
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Standards Group I Bio-rad 171I50001
Bio-Plex Pro Reagent Kit with Flat Plate Bio-rad 171304070M
Bovine Serum Albumin ThermoFisher 23209 Optional
Centrifuge Eppendorf 5810R Optional
Covidien Monoject 1/2 mL Insulin Syringe with 28G x 1/2 in. Needle Spectrum 552-58457-083
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D9779-10G Optional
Environmental enrichment Bio-serv K3327 and K3322 Optional
Ethovision Noldus Ethovision Optional
Fluorsecent-tagged seondary ntibodies Li-cor 925-32213 and 925-68072 Optional
Food-grade edible oil (like olive, canola or grapeseed) Various vendors Use to lubricate tail during tail bleeds
HBSS ThermoFisher 14060040 Optional
High molecular weight polyinositic:polycytidilic acid Invivogen #tlrl-pic-5 Used to establish females' BIR
Humane Mouse Restrainer AIMS 1000 Used to restrain mouse during tail bleeds
Image Studio Software Licor 5.2 Optional
Laemmli buffer Bio-rad 1610737EDU Optional
Luminex200 ThermoFisher APX10031
Microvette CB300 300μl Serum capillary tube Sarstedt 16.440.100
Mixed molecular weight polyinositic:polycytidilic acid Sigma-Aldrich #P0913 Gestational induction of MIA
monoclonal anti-MEF2A AbCam ab76063 Optional
monoclonal anti-STAT3 Cell signaling 12640S Optional
Observer Noldus Observer Optional
Odyssey blocking buffer (TBS) Li-cor 927-50003 Optional
Odyssey CLx imaging system Li-cor 9140 Optional
Omnipure PBS Millipore 65054L Optional
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23227 Optional
polyclonal anti_TH Pel-Freez P4101-150 Optional
PVDF membrane Bio-rad 162-0177 Optional
Qsonica Sonicator Q500 Fisher Scientific 15-338-282 Optional
Quick blood stopper Petco 17140
Seal-Rite 1.5 ml microcentrifuge tube, natural non-sterile USA Scientific 1615-5500
Soldering stand Amazon B08Y12QC73 Used to hold capillary tube during tail bleeds
Sunflower seeds Bio-serv S5137-1 Use to increase breeding efficiency
The Bio-Plex Pro Mouse IL-6 set, Bio-rad 171G5007M
Tris base Fisher Scientific BP152-1 Optional
Tween 20 Bio-rad 23209 Optional

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References

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Neurosciences numéro 186
Génération d’un modèle reproductible d’activation immunitaire maternelle en milieu de gestation à l’aide de Poly(I:C) pour étudier la susceptibilité et la résilience de la progéniture
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Prendergast, K., McAllister, A. K. Generating a Reproducible Model of Mid-Gestational Maternal Immune Activation using Poly(I:C) to Study Susceptibility and Resilience in Offspring. J. Vis. Exp. (186), e64095, doi:10.3791/64095 (2022).

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