Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

عزل خلايا الكبد المتجددة بعد استئصال الكبد الجزئي في الفئران

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64493
Automatic Translation
1, 1
1Swiss HPB Laboratory, Department of Visceral & Transplant Surgery, University Hospital Zurich (USZ)

Summary

خلايا الكبد المحملة بالدهون متأصلة في تجديد الكبد ولكنها عادة ما تضيع عند الطرد المركزي المتدرج الكثافة. هنا ، نقدم بروتوكول عزل الخلايا الأمثل الذي يحتفظ بخلايا الكبد الدهنية ، مما ينتج عنه مجموعات تمثيلية من خلايا الكبد المتجددة بعد استئصال الكبد الجزئي في الفئران.

Abstract

تم استخدام استئصال الكبد الجزئي على نطاق واسع للتحقيق في تجديد الكبد في الفئران ، ولكن عزل الغلة العالية لخلايا الكبد القابلة للحياة لتطبيقات الخلية المفردة في المصب يمثل تحديا. لوحظ تراكم ملحوظ للدهون داخل خلايا الكبد المتجددة خلال أول 2 أيام من تجديد الكبد الطبيعي في الفئران. هذا ما يسمى بالتنكس الدهني المرتبط بالتجديد العابر (TRAS) مؤقت ولكنه يتداخل جزئيا مع المرحلة التكاثرية الرئيسية. تنقية تدرج الكثافة هي العمود الفقري لمعظم البروتوكولات الحالية لعزل خلايا الكبد الأولية. نظرا لأن التنقية المتدرجة تعتمد على كثافة الخلايا وحجمها ، فإنها تفصل بين مجموعات خلايا الكبد غير الدهنية والخلايا الكبدية الدهنية. لذلك ، غالبا ما تفقد خلايا الكبد الدهنية ، مما ينتج عنه أجزاء غير تمثيلية من خلايا الكبد.

يصف البروتوكول المقدم طريقة سهلة وموثوقة للعزل في الجسم الحي لتجديد خلايا الكبد بغض النظر عن محتواها من الدهون. يتم عزل خلايا الكبد من ذكور الفئران C57BL / 6 بعد 24-48 ساعة من استئصال الكبد من خلال نهج نضح كولاجيناز كلاسيكي من خطوتين. تدفع المضخة التمعجية القياسية المحاليل الدافئة عبر الوريد الأجوف السفلي القسطرة إلى البقايا ، باستخدام تقنية التروية الرجعية مع التدفق الخارجي عبر الوريد البابي. يتم فصل خلايا الكبد عن طريق كولاجيناز لإطلاقه من كبسولة جليسون. بعد الغسيل والطرد المركزي الدقيق ، يمكن استخدام خلايا الكبد لأي تحليلات المصب. في الختام ، تصف هذه الورقة تقنية مباشرة وقابلة للتكرار لعزل مجموعة تمثيلية من خلايا الكبد المتجددة بعد استئصال الكبد الجزئي في الفئران. قد تساعد هذه الطريقة أيضا في دراسة مرض الكبد الدهني.

Introduction

يمكن للكبد تجديد نفسه حتى بعد فقدان الأنسجة بشكل كبير. تتضح هذه القدرة التجديدية الفريدة بوضوح من خلال النموذج التجريبي لاستئصال الكبد الجزئي (70٪) ، والذي تم وصفه لأول مرة في الفئران من قبل هيغينز وأندرسون في عام 19311. في هذا النموذج ، تتم إزالة 70٪ من الكبد جراحيا من الحيوانات عن طريق قص فصوص الكبد الكبيرة. ثم تنمو الفصوص المتبقية من خلال تضخم تعويضي لاستعادة كتلة الكبد الأصلية في غضون أسبوع واحد تقريبا بعد الجراحة ، وإن كان ذلك دون استعادة بنية الكبد الأصلية 2,3. تم تطوير عمليات استئصال الكبد الإضافية بكميات متفاوتة من إزالة الأنسجة ، مثل استئصال الكبد الممتد بنسبة 86٪ حيث تكون بقايا الكبد صغيرة جدا بحيث لا يمكن استعادتها ، مما يؤدي في النهاية إلى فشل الكبد بعد استئصال الكبد (PHLF) والموت اللاحق في 30٪ -50٪ من الحيوانات4،5،6. تمكن هذه النماذج من دراسة تجديد الكبد الطبيعي والفاشل ، اعتمادا على كمية الأنسجة المقطوعة (الشكل 1).

على الرغم من أن نماذج الفئران من استئصال الكبد قد استخدمت بنجاح لسنوات عديدة ، إلا أن الأساليب التحليلية الأكثر تقدما لم تسمح إلا مؤخرا برؤية أعمق على مستوى الخلية الواحدة. بالنسبة لمعظم هذه الطرق ، ومع ذلك ، فإن وجود خلايا الكبد الفردية هو شرط أساسي أساسي. تعتمد معظم بروتوكولات عزل خلايا الكبد الأولية على تقنية نضح كولاجيناز من خطوتين وتنقية تدرج الكثافة اللاحقة لفصل خلايا الكبد القابلة للحياة عن الحطام وغير المتني ، وكذلك الخلايا الميتة7،8،9. تم وصف هذه الطريقة لأول مرة من قبل بيري وفريند في 196910 وتم تكييفها من قبل Seglen وزملائه في 197211,12. ومع ذلك ، نظرا لأن الطرد المركزي المتدرج يعتمد على كثافة الخلايا وحجمها ، فغالبا ما تفقد خلايا الكبد المحملة بالدهون أثناء التنقية القياسية. في حين أن هذه الخسارة قد تكون ضئيلة بالنسبة للعديد من الأسئلة البحثية ، إلا أنها جانب حاسم لتجديد الكبد المبكر. خلال أول 2 أيام ، تتراكم خلايا الكبد داخل كبد الفأر المتجدد الدهون ، وبالتالي تنمو في الحجم وتغمس في الكثافة. يعمل هذا التنكس الدهني العابر المرتبط بالتجديد (TRAS) على توفير وقود متجدد وهو مؤقت ، ولكنه يتداخل جزئيا مع المرحلة التكاثرية الرئيسية ويتم توزيعه بشكل غير متساو داخل فصيصات الكبد - الوحدات الوظيفية للكبد13,14. بعد استئصال الكبد الممتد بنسبة 86٪ ، يحدث TRAS أيضا ولكنه يستمر ، لأن التجدد متوقف ولا تتأكسد الدهون14. لذلك ، فإن التنقية المتدرجة لخلايا الكبد بعد استئصال الكبد بنسبة 70٪ أو 86٪ ستنتج كسور غير تمثيلية ، حيث يتم فقدان معظم خلايا الكبد المحملة بالدهون بسبب كثافتها المنخفضة15.

في بروتوكول العزل المعدل هذا ، يتم عزل خلايا الكبد من الفئران C57BL / 6 بعد 24-48 ساعة من استئصال الكبد من خلال نهج نضح كولاجيناز كلاسيكي من خطوتين. عادة ، يتم القنية والتروية من بقايا عزل الخلايا عن طريق الوريد البابي. ومع ذلك ، فإن المقاومة الوعائية البورتية في البقايا الصغيرة المتبقية بعد الاستئصال الكبير عالية16 ، وبالتالي فإن التروية حساسة. نظرا لأن الوريد الأجوف لا يتأثر باستئصال الكبد ، يمكن إجراء التروية بسهولة في الاتجاه الرجعي عن طريق قنية الوريد الأجوف. تدفع المضخة التمعجية القياسية المحاليل الدافئة عبر الوريد الأجوف السفلي القسطرة إلى بقايا الكبد ، باستخدام التروية الرجعية مع التدفق عبر الوريد البابي (الشكل التكميلي S1). يتم فصل خلايا الكبد عن طريق الكولاجين ويتم إطلاقها من كبسولة جليسون. بعد الغسيل والمعالجة الدقيقة لخلايا الكبد القابلة للحياة عن طريق العزل التدريجي باستخدام نهج الطرد المركزي منخفض السرعة ، يمكن استخدام خلايا الكبد لأي تحليلات المصب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

كانت جميع التجارب على الحيوانات متوافقة مع اللوائح الفيدرالية السويسرية للحيوانات ووافق عليها المكتب البيطري في زيورخ (رقم 007/2017 ، 156/2019) لضمان رعاية الإنسان. تم الاحتفاظ بذكور الفئران C57BL / 6 الذين تتراوح أعمارهم بين 10-12 أسبوعا في دورة نهارية / ليلية لمدة 12 ساعة مع حرية الوصول إلى الطعام والماء. تألفت كل مجموعة تجريبية من ستة إلى ثمانية. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والمعدات والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. استئصال الكبد الجزئي في الفئران

  1. لاستئصال الكبد القياسي (70٪) ، قم بربط واستئصال الفص الجانبي الأيسر والجزء الأيمن من الفص المتوسط والجزء الأيسر من الفص المتوسط (الشكل 1 ب). لاستئصال الكبد الممتد (86٪)4 ، قم أيضا بإزالة الفصوص المذنبة والفص الأمامي الأيمن (الشكل 1C).
  2. ملاحظة: استئصال الكبد القياسي هو إجراء تم استخدامه في أبحاث تجديد الكبد لسنوات عديدة. تتوفر بروتوكولات لهذا الإجراء 3,17 ، بما في ذلك بروتوكول Mitchell and Willenbring 18 بمساعدة الفيديو. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول التقنيات المستخدمة هنا لاستئصال الكبد في الملف التكميلي 1.

Figure 1
الشكل 1: استئصال الكبد القياسي (70٪) والممتد (86٪) في الفئران. أ: فصوص كبد الفأر الخمسة ومساهمات كل منها في الوزن الكلي للكبد. (ب) رسم تخطيطي لاستئصال الكبد بنسبة 70٪ في الفئران. تمثل الفصوص الداكنة بقايا الكبد المستقبلية. (ج) رسم تخطيطي لاستئصال الكبد بنسبة 86٪ في الفئران. تمثل الفصوص الداكنة بقايا الكبد المستقبلية. (د) الحجم الدقيق للأنسجة المقطوعة بعد استئصال الكبد بنسبة 70٪ و 86٪. (ه) بطن الفأر مباشرة بعد استئصال الكبد بنسبة 70٪ ؛ (F) بطن الفأر على الفور (يسار) و 48 ساعة (يمين) بعد 86٪ - استئصال الكبد. لاحظ اللون الشاحب للبقايا الصخرية (السهم الأبيض). ن = 6-7 / مجموعة. الاختصارات: sHx = استئصال الكبد القياسي. eHx = استئصال الكبد الممتد. LW = وزن الكبد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. تحضير محاليل التروية

  1. تحضير مخازن التروية والهضم والحفظ (انظر الجدول 1).
    1. اضبط الأس الهيدروجيني لجميع المحاليل العازلة عند 37 درجة مئوية عن طريق إضافة هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) أو كلوريد الهيدروجين (HCl) حسب الحاجة. الرقم الهيدروجيني الأمثل للمخازن المؤقتة هو 7.4.
    2. ضع المخزن المؤقت للحفظ و Medium E من ويليامز على الجليد.
  2. تحضير المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي وتخزينه على الجليد.

الجدول 1: المحاليل والمخازن المؤقتة المستخدمة لهضم وتنقية خلايا الكبد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

3. إعداد معدات التروية

  1. قم بتسخين حمام الماء إلى 42 درجة مئوية وضع محلول التروية (50 مل) ومخزن الهضم (10-20 مل) في حمام مائي. لا تضيف كولاجيناز إلى مخزن الهضم حتى الآن.
  2. تحضير المضخة التمعجية وإدخال الأنبوب. يوضح الشكل 2 الإعداد الكامل للتروية.
    1. قم بتوصيل قنية 26 G IV بنهاية مخرج الأنبوب باستخدام موصل قفل Luer. أدخل طرف مدخل الأنبوب في أنبوب التروية العازلة المسخن مسبقا في الحمام المائي. اغسل الأنبوب بنسبة 70٪ من الإيثانول ، متبوعا ب 50 مل من كلوريد الصوديوم المعقم (NaCl 0.9٪). قم بتجهيز الأنبوب بمخزن مؤقت للتروية الدافئة (سرعة المضخة 3 مل / دقيقة).
  3. قم بتخدير الفأر باستخدام تخدير استنشاق الأيزوفلوران (800 مل / دقيقة O 2 ، 3٪ -5٪ إيزوفلوران للتحريض و2٪ للصيانة أثناء العملية). تعامل مع الأيزوفلوران تحت غطاء المختبر ووفر تهوية كافية.
  4. يجب تطبيق البوبرينورفين تحت الجلد قبل 30 دقيقة من الجراحة بجرعة 0.1 ملغ/ كغ من وزن الجسم.
  5. لمنع انخفاض حرارة الجسم ، ضع الفأر المخدر على وسادة تدفئة وضع منديلا من القماش ملفوفا أسفل الجزء العلوي من البطن لرفع الكبد فوق الأعضاء الأخرى وتسهيل الوصول إلى الوريد الأجوف السفلي.
    ملاحظة: لا تستخدم الأنسجة السميكة جدا لأن التواء الأوعية ممكن وستتأثر فعالية التروية.
  6. أضف مرهم العين لمنع تلف القرنية.
  7. قبل البدء في الجراحة ، تأكد من تخدير الحيوان بشكل كاف عن طريق اختبار منعكس سحب الدواسة (قرصة وسادة القدم على كلا القدمين الخلفيتين). في حالة الاستجابة ، قم بتوفير تخدير إضافي وأعد الاختبار قبل بدء الإجراء.
  8. تنظيف البطن مع 70 ٪ من الإيثانول.
    1. أعد فتح شق خط الوسط عن طريق قطع الخيط وسحب حواف الجرح برفق. إذا كان استئصال الكبد أقدم من 24-48 ساعة ، فقم بإزالة الخيط وقطع الجلد بالمقص.
    2. ثبت خياطة البولي بروبلين 5-0 على القص ، واسحبها بشكل جمجمي ، وقم بإصلاحها في هذا الوضع. استخدم مبعدة أو مشابك بسيطة لإبقاء البطن مفتوحا. يجب كشف تجويف البطن قدر الإمكان لتحسين الوصول والتصور.
  9. حرك الأمعاء إلى اليمين باستخدام مسحات القطن للكشف عن الوريد البابي والوريد الأجوف. استخدم قطعة قماش مبللة للاحتفاظ بالأمعاء.
  10. ضع جسما ثقيلا يبلغ ارتفاعه حوالي 2 سم (على سبيل المثال ، حلقة وزن مطلية بالسيليكون للقوارير الحجمية) بجوار الأرجل الخلفية للفأر (الشكل التكميلي S2A). ضع الأنبوب مع قنية 26 G IV المتصلة على الجسم وضع الإبرة بعناية فوق الوريد الأجوف. اضبط طول الأنبوب.
  11. ضع محلول مخزون كولاجيناز المحضر في أنبوب عازلة للهضم المسخن مسبقا. أضف 250 ميكرولتر من محلول المرق إلى 10 مل من محلول الهضم. تحضير 10-20 مل من المخزن المؤقت الهضم لكل. بالنسبة للحيوانات الكبيرة أو تروية الكبد الكامل ، قم بإعداد ما يصل إلى 30 مل من محلول الهضم.
    ملاحظة: يوصى بإضافة محلول مرق كولاجيناز إلى محلول الهضم الدافئ قبل 30 دقيقة تقريبا من بدء عملية الهضم.
    Figure 2
    الشكل 2: نظرة عامة على إعداد التروية. (أ) طاولة جراحية مع المعدات اللازمة للتروية. ب: المواد اللازمة لتحضير الكبد، وكذلك استخراج خلايا الكبد وعزلها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. القنية والتروية

  1. اضبط سرعة المضخة على 3 مل / دقيقة وقم بتشغيل المضخة. دع المخزن المؤقت للتروية يصل إلى الإبرة. تخلص من أول 2-3 مل من محلول التروية.
  2. أداء قنية الوريد الأجوف السفلي.
    1. أثناء مرور المخزن المؤقت عبر الإبرة، أدخل قنية 26 G IV بزاوية ضحلة في الوريد الأجوف أسفل الكلى. تأكد من أن الإبرة مائلة تشير إلى الأعلى.
    2. استخدم قطعة قطن لسحب الوريد الأجوف برفق ذيليا أسفل موقع البزل بحيث يسهل التوتر المقدم إدخال القنية في الوريد. ابحث عن الدم في حجرة الفلاش للقسطرة عندما تدخل الإبرة التجويف.
    3. دفع الإبرة 2-3 مم إضافية للتأكد من أن طرف القسطرة البلاستيكية قد دخل الوريد أيضا.
    4. حرك القسطرة البلاستيكية فوق الإبرة وفي الوريد الأجوف 5 مم أخرى. قم بإزالة الإبرة ببطء وبعناية فائقة.
      ملاحظة: لا ينصح بتثبيت القنية برباط. تستغرق هذه الخطوة وقتا طويلا حيث يجب أولا تشريح السفينة لهذا الغرض. إذا تم وضع القنية بشكل فضفاض ودعمها بجسم ما ، فلا يلزم إجراء مزيد من التثبيت (انظر إعداد التروية في الشكل التكميلي S2). لتثبيت موقع القنية ومنع التدفق العكسي ، يمكن إضافة قطرة واحدة من n-butyl-cyanoacrylate الأحادي إلى موقع القنية.
  3. عندما يسقط الدم من القنية ، املأه بمحلول التروية الدافئ باستخدام حقنة.
  4. أعد توصيل الأنبوب بالقنية ، ولا يزال يعمل بسرعة مضخة تبلغ 3 مل / دقيقة. دع المخزن المؤقت للتروية يدخل الكبد.
  5. بعد 2-3 ثوان ، ابحث عن بقع بيضاء تتشكل في الكبد و / أو توسع / تورم الوريد البابي ، مما يشير إلى أن مخزن التروية يتدفق عبر الكبد ويدخل فصيصات الكبد من الوريد المركزي (الشكل 3).
  6. انتظر حتى ينتفخ الوريد البابي بشكل واضح خلال 1-2 ثانية بعد ظهور بقع بيضاء على سطح الكبد. قطع الوريد البابي مع مقص بعيدا قدر الإمكان من هيلوس الكبد. استخدم مشبك وعاء صغير لتسمية (وليس إغلاق) موقع القطع (الشكل 3 ب).
    ملاحظة: هذا يبسط تقييم التدفق عبر الكبد أثناء عملية التروية. ينظف الكبد من الدم على الفور ويتحول إلى اللون الأصفر والأبيض في غضون ثوان قليلة (الشكل 3C). يسهل القطع الإضافي عبر الجلد على الجانب الأيمن من فتحة البطن تدفق الدم وكذلك محلول التروية (الشكل 3B والشكل التكميلي S2B ، C).
  7. زيادة التدفق حتى 4-7 مل / دقيقة اعتمادا على وزن الحيوان وحجم الكبد ومدى استئصال الكبد السابق.
  8. المشبك الوريد البابي مع ملاقط أو المشبك الوعائي لمدة 7-10 ثوان. تأكد من عدم مرور أي سوائل.
    ملاحظة: يتضخم الكبد بشكل واضح أثناء التثبيت ويسترخي عند إطلاقه. هذا أمر بالغ الأهمية لطرد الكبد كله وتطهيره من أي دم متبقي.
  9. قم بإجراء مشبك ثان بعد حوالي 30 ثانية وتأكد من تضخم الكبد واسترخاءه. استمر في طرد الحيوان حتى يصبح المخزن المؤقت المتدفق من الوريد البابي واضحا ، ولكن على الأقل لمدة 3-4 دقائق.
    ملاحظة: تعتمد سرعة المضخة على الأنبوب وكذلك حجم الكبد. يجب تقييمه بشكل فردي.
  10. في هذه المرحلة من الإجراء ، كان يجب أن يحدث القتل الرحيم بشكل ثانوي بعد الاستنزاف. تأكد من توقف الدورة الدموية الجهازية (لا توجد ضربات قلب أو وميض للقلب). لضمان الوفاة ، يتم إجراء استرواح الصدر الثنائي في هذه المرحلة من الإجراء كطريقة فيزيائية ثانوية للقتل الرحيم.
    ملاحظة: قلل سرعة المضخة قليلا إذا توقفت الدورة الدموية الجهازية (لا توجد ضربات قلب أو وميض للقلب).

Figure 3
الشكل 3: عملية التروية من القنية إلى الهضم. أ: تشريح كبد الفأر مع الوريد الأجوف السفلي (السهم الأبيض) والوريد البابي (السهم الأصفر). ب: قنية الوريد الأجوف السفلي. يتم تأمين القنية برباط (سهم أبيض) ، ويتم تمييز موقع التدفق الخارجي عبر الوريد البابي المفتوح (غير مثبت) بمشبك وعاء صغير. (ج) لاحظ ظهور تراكيب غير مكتملة قبل أن يزيل مخزن التروية الكبد من كل الدم المتبقي (سهم أبيض). يتم شق الجلد (السهم الأصفر) ويتم وضع قطعة قطن لضمان تصريف الدم وسوائل التروية. يمكن إجراء لقط متقطع باستخدام مشبك أو ملاقط وعائية. (د) يجب تطهير الكبد من كل الدم (*). بعد دخول مخزن الهضم المحتوي على كولاجيناز إلى الكبد ، لن يسترخي بعد التثبيت وسيزداد حجم فصوص الكبد. (ه) بعد فترة، يمكن ملاحظة ظهور فقاعات على سطح الكبد (*). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. الهضم

  1. أوقف مضخة التروية مؤقتا وانقل أنبوب المدخل بسرعة من مخزن التروية المؤقت إلى محلول الهضم المسخن مسبقا. أعد تشغيل المضخة.
  2. قبل أن يصل المخزن المؤقت للهضم إلى الكبد ، قم بتثبيت الوريد البابي مرة أخرى لمدة 3-4 ثوان. تأكد من استرخاء الكبد عند إطلاق المشبك وبقاء سائل التروية صافيا.
    ملاحظة: يحتوي محلول الهضم على الفينول الأحمر ويمكن تمييزه بسهولة عن المخزن المؤقت للتروية الشفافة. هذا يسمح لسهولة التتبع داخل الأنبوب.
  3. بمجرد وصول المخزن المؤقت للهضم إلى الكبد ، قم بتثبيت الوريد البابي مرة أخرى بمشبك وعاء صغير.
    ملاحظة: عند التثبيت ، يتضخم الكبد ولكنه لا يرتاح عند تحرير المشبك. هذا طبيعي.
  4. لتسهيل عملية الهضم ، أغلق الوريد الأجوف العلوي بمشبك وعائي أسفل الحجاب الحاجز مباشرة للسماح لمخزن الهضم بالمرور من الوريد الأجوف السفلي إلى الكبد إلى التدفق الخارجي عبر الوريد البابي المفتوح.
    ملاحظة: يضمن هذا التثبيت تجاوز الدورة الدموية الجهازية ومنع الاتصال غير الضروري بمكونات / مثبطات الدم المتبقية. هذه الخطوة اختيارية ، حيث يصعب الاقتراب من الوريد الأجوف العلوي خلف أنسجة الكبد المتضخمة بعد الجراحة الوهمية ، ولكن الوصول أسهل بكثير في الفئران التي تم استئصال الكبد.
  5. هضم لمدة 4 دقائق تقريبا بمعدل تدفق 5 مل / دقيقة. مع تقدم عملية الهضم ، ابحث عن علامات بدء انتفاخ الكبد وأقسام صغيرة واضحة / شفافة على سطح الكبد. علاوة على ذلك ، لاحظ أن الكبد يأخذ نسيج قطعة قماش مبللة ويبدو رطبا تقريبا (الشكل 3E). تحقق من الاتساق عن طريق لمس بعناية بقطعة قطن مبللة.
  6. استمر في التروية حتى يمكن ملاحظة اختلاف ملحوظ في نسيج سطح الكبد. لاحظ أن الكبد يفترض لونا فاتحا جدا ومظهرا شمبانيا (الشكل 3E) ، وأن كبسولة جليسون (أي كيس الكبد) تنفصل عن الحمة. أوقف عملية الهضم بمجرد أن يكتسب الكبد هذه الخصائص ، لأن الإفراط في الهضم يمكن أن يتلف خلايا الكبد. قم بإزالة الإبرة قبل دخول الهواء إلى الكبد.
    ملاحظة: عادة ما تكون هناك حاجة إلى 10-20 مل من محلول الهضم للوصول إلى الهضم الكافي. هذا يعتمد على حجم الحيوان ، ومدى استئصال الكبد ، وإعداد الأنابيب ، وجودة محلول الكولاجيناز. إذا لزم الأمر ، قم بزيادة وقت التروية بدلا من سرعة التروية. يمكن أن يؤدي الضغط الشديد في نظام الأوعية الدموية إلى انفجار الكبد وقد يفقد سائل التروية / الهضم في الفضاء خلف الصفاق.

6. تحضير الكبد

  1. إزالة الكبد بلطف من تجويف البطن. كن حذرا جدا لأنه الآن واهية وهشة للغاية.
  2. أمسك النسيج الضام المركزي بين الفصوص باستخدام الملقط وارفعه قليلا لأعلى ، باستخدامه كنقطة ربط.
  3. قطع جميع وصلات الكبد إلى الأعضاء الأخرى ، وإزالة المرارة ، ووضع الكبد في العازلة للحفاظ على الجليد.
    ملاحظة: من الناحية المثالية ، يجب أن يتم استخراج خلايا الكبد والمعالجة الإضافية على الفور للحفاظ على صلاحية خلايا الكبد. ومع ذلك ، إذا لزم الأمر ، يمكن تخزين الكبد لفترة قصيرة عند 4 درجات مئوية (على سبيل المثال ، للنقل). يجب ألا يتجاوز هذا التأخير 30-40 دقيقة.

7. استخراج خلايا الكبد

  1. انقل الكبد إلى طبق بتري 10 سم وأضف 10 مل من Williams' Medium E المثلج.
  2. تمزق كبسولة جليسون بملاقط ذات أطراف دقيقة في مواقع قليلة على طول سطح الكبد. أمسك جزءا مركزيا (على سبيل المثال ، النسيج الضام في هيلوس الكبد) بزوجين من الملقط واسحبهما ببطء بعيدا ، مما يسمح للكبسولة بالتمزق دون إتلاف خلايا الكبد. حرر الخلايا عن طريق هز الكبسولة برفق (الشكل التكميلي S3).
    ملاحظة: من الناحية المثالية ، يتمزق الكبد بسهولة ويطلق الخلايا. لا تستخدم القوة. يمكن أن تساعد مكشطة الخلايا في إزالة جميع الخلايا تماما وزيادة إنتاجية الخلايا. لا تقطع الكبد إلى قطع بالمقص.
  3. قم بتصفية 5 مل من لب الكبد من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 مل. شطف الفلتر مع 10 مل من وسط بارد الجليد الطازج. قم بتصفية 5 مل المتبقية من اللب من خلال مصفاة الخلية.
    ملاحظة: استخدم ماصة مصلية سعة 25 مل لنقل لب الكبد مع خلايا الكبد المنفصلة (الشكل 4 أ). تزيد الماصات الأصغر ذات الفتحات الأصغر من إجهاد القص وتتلف خلايا الكبد بشكل لا رجعة فيه.
  4. أضف ما مجموعه 30 مل من الوسط البارد لشطف طبق بتري ، وقم بترشيحه ، وأضف التعليق إلى أنبوب 50 مل حتى يمتلئ. جميع الخلايا المعزولة معلقة الآن (الشكل 4 ب).

Figure 4
الشكل 4: التنقية بالطرد المركزي اللطيف. أ: تجانس الكبد المتبقي بعد خطوة الاستخراج. (ب) عرض مجهري (تكبير 20x) للمتجانسة ؛ لاحظ التلوث الملحوظ بالحطام. (ج) خطوات الطرد المركزي للتنقية، (د) المناظر المجهرية للطافات المراد التخلص منها. ه: المنظر المجهري لجزء الخلية الكبدية المنقاة. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

8. عزل خلايا الكبد

  1. تدور عند 50 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية (أقل تسارع وأقل فرامل ممكنة).
    ملاحظة: خلايا الكبد أكثر كثافة من خلايا الكبد غير المتنية. بسبب قوة الطرد المركزي المنخفضة ، يتم تكوير خلايا الكبد فقط ، بينما تبقى الخلايا الأخرى (مثل الخلايا المناعية وكريات الدم الحمراء والخلايا الجيبية) في المادة الطافية.
  2. نضح معظم المادة الطافية ، وترك 1 مل لإعادة تعليق الخلايا عن طريق تحريك الأنبوب برفق.
  3. أضف 40 مل من وسط Williams' E البارد وقم بتدويره مرة أخرى عند 50 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية (تسارع منخفض ، فرامل منخفضة) لإزالة خلايا الكبد الميتة وحطام الخلايا وخلايا الكبد الدهنية القابلة للحياة (الشكل 4C).
  4. تخلص من معظم المادة الطافية ، واترك 1 مل لإعادة تعليق الخلايا عن طريق تدوير الأنبوب.
  5. أضف 40 مل من وسط Williams' E البارد وقم بتدويره مرة أخرى عند 50 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية (تسارع منخفض ، فرامل منخفضة).
  6. نضح معظم المادة الطافية ، وترك 1 مل لإعادة تعليق الخلايا عن طريق تحريك الأنبوب برفق.
    ملاحظة: لا توقف هذه العملية حتى يتم إصلاح الخلايا أو تحليلها. خلايا الكبد هشة للغاية وأي تأخير في عملية التروية والهضم والتنقية يمكن أن يتلف الخلايا.
  7. حدد تركيز الخلية النهائي بعد إضافة التريبان الأزرق ، باستخدام غرفة عد محسنة من نيوباور.
    ملاحظة: تمت الآن إزالة معظم الحطام والخلايا غير المتنية ، مما أدى إلى حبيبات نظيفة من حوالي 10-15 × 106 خلايا كبدية متبقية بعد استئصال الكبد بنسبة 70٪.
  8. اعتمادا على التركيز المطلوب ، أضف المزيد من الوسط المثلج. استخدم معلق خلايا الكبد لأي تحليل نهائي أو ابدأ مزرعة خلية أولية.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يبقى عدد قليل فقط من الخلايا المناعية وغير المتنية (<5٪) في التعليق. إذا كنت ترغب في مزيد من التنقية ، فقم بإجراء اختيار سلبي لخلايا CD31 + و CD45 + عن طريق فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا أو مضان (MACS / FACS). حتى الآن ، لا توجد علامة سطحية موثوقة وقوية لخلايا متني الكبد.

9. إعداد خلايا الكبد المعزولة لقياس التدفق الخلوي

  1. الطرد المركزي خلايا الكبد في 100 × غرام لمدة 5 دقائق.
  2. تخلص من المادة الطافية وأضف الكمية المطلوبة من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي ، اعتمادا على تركيز تعليق الخلية.
  3. أضف 1 مل من معلق الخلية في أنبوب قياس التدفق الخلوي. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 100 × غرام والتخلص من المادة الطافية.
  4. أضف 100-200 ميكرولتر من صبغة الصلاحية الخضراء المخففة Alexa Fluor 488 Zombie (تركيز 1: 400) إلى الخلايا ورجها برفق. أعد تعليق خلايا الكبد بعناية عن طريق الاهتزاز اليدوي أو باستخدام خلاط دوامة بسرعة منخفضة (بحد أقصى 2-3) لمدة 2 ثانية.
    ملاحظة: لا تستخدم أطراف الماصة الصغيرة لإعادة تعليق الخلايا. إنها هشة للغاية ويسبب إجهاد القص المطبق تلفا ويقلل من صلاحية الخلية. إذا لم يكن من الممكن تجنب السحب ، فاستخدم ماصة سعة 1000 ميكرولتر بعد قطع أصغر جزء من الطرف لتكبير القطر وماصة الخلايا ببطء شديد.
  5. ضع الأنابيب على الثلج أو قم بتخزينها في درجة حرارة الغرفة ، اعتمادا على التلوين المطلوب. احتضان الخلايا لمدة 20-30 دقيقة في الظلام.
  6. أضف 2 مل من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي واغسل الخلايا 3x. طرد مركزي الخلايا بعد كل خطوة غسيل على 100 × غرام لمدة 5 دقائق.
  7. أضف 2 مل من المخزن المؤقت للتثبيت (1: 1 4٪ PFA و PBS). أعد تعليق خلايا الكبد بعناية عن طريق الاهتزاز اليدوي أو باستخدام خلاط دوامة بسرعة منخفضة (بحد أقصى 2-3) لمدة 2 ثانية.
  8. إصلاح الخلايا لمدة 30 دقيقة.
  9. جهاز طرد مركزي عند 100 × جم لمدة 5 دقائق أخرى ، وتخلص من المادة الطافية ، وأضف محلول قياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا في مخزن مؤقت لقياس التدفق الخلوي قبل التحليل حتى 72 ساعة بعد العزل.

10. تحليل خلايا الكبد مع قياس التدفق الخلوي

  1. تحليل خلايا الكبد باستخدام فارز الخلايا المنشط بالتألق.
    ملاحظة: ضع في اعتبارك الحجم الكبير نسبيا لخلايا الكبد واضبط الفولتية. ابدأ بجهد منخفض ولا تزيد عن 350 فولت للتشتت الأمامي (FSC) و 220 فولت للتشتت الجانبي (SSC).
    1. اضبط الفولتية ل FSC و SSC على الحجم الكبير المقدر للخلايا. تحديد عدد خلايا الكبد وتسجيل جميع الأحداث باستخدام SSC-A و FSC-A (الشكل 5A).
    2. لاحظ أن الحطام والخلايا غير المتنية معروضة في الزاوية اليسرى السفلية من مخطط كثافة FSC مقابل SSC ويتم استبعادها (الشكل 5A).
    3. نظرا لأن الخلايا المزدوجة يمكن أن تؤثر على التحليل ، فقم بإنشاء مخطط كثافة ارتفاع التشتت الجانبي (SSC-H) مقابل مساحة التشتت الجانبي (SSC-A) لاستبعاد الثنائيات ، كما هو موضح في الشكل 5B.
    4. حدد العدد النهائي لخلايا الكبد عن طريق بوابة خلايا CD31- (علامة البطانة) وخلايا CD45- (علامة المناعة) (الشكل 5C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يبلغ TRAS ذروته في 16 ساعة بعد استئصال الكبد ويختفي تدريجيا بعد 32-48 ساعة بعد استئصال الكبد القياسي ، لكنه يستمر بعد 48 ساعة بعد استئصال الكبد الممتد. من الناحية المجهرية ، يمكن رؤية TRAS بسهولة كبشرة شاحبة من بقايا الكبد (الشكل 1F) ويمكن ملاحظتها في الفئران التي تم استئصال الكبد فيها بين 16 ساعة و 48 ساعة بعد الجراحة.

العائد النهائي المقدر هو 10-15 × 10 6 خلايا كبدية بعد 70٪ - استئصال الكبد و 4-9 × 106 بعد استئصال الكبد الممتد 86٪ في الفئران ، بمتوسط صلاحية نهائية بنسبة 78٪ و 65٪ على التوالي. هذا يتوافق مع النسبة المئوية المتوقعة مقارنة بإجمالي العائد من 50-70 × 106 من كبد الفأر الكامل (الشكل 6A ، C). بعد استئصال الكبد الجزئي ، تظهر خلايا الكبد زيادة في حجم الخلية مقارنة بالكبد الطبيعي ، وهو ما يتوافق مع زيادة محتواها من الدهون (الشكل 6 ب). تظهر استراتيجية البوابات في الشكل التكميلي S4.

Figure 6
الشكل 6: إنتاج الخلايا الكبدية، وحجمها، وصلاحيتها. (أ) عدد خلايا كبد فأر كامل وبقايا 24 ساعة بعد استئصال الكبد بنسبة 70٪ و 86٪. ب: حساب حجم الخلية للخلايا الكبدية المعزولة. لاحظ الزيادة الملحوظة في حجم الخلية بعد 24 ساعة من استئصال الكبد ، لكل من 70٪ و 86٪. ج: صلاحية الخلايا الكبدية المعزولة بعد كل خطوة من خطوات عملية التنقية. تم قياس الجدوى عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام صبغة الجدوى الخضراء Alexa Fluor 488 Zombie. تؤخذ النسب المئوية من جميع مفردات خلايا الكبد. للاطلاع على استراتيجية البوابات، انظر الشكل التكميلي S6 والشكل التكميلي S4. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحرافات المعيارية مع n = 6-8 / مجموعة. الاختصارات: sHx = استئصال الكبد القياسي. eHx = استئصال الكبد الممتد. بدون استئصال = جراحة وهمية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يمكن ملاحظة زيادة محتوى الدهون في خلايا الكبد الفئرانية بعد 24 ساعة من استئصال الكبد الجزئي من خلال زيادة في الدقة (الشكل 7 ؛ لاستراتيجية البوابات ، انظر الشكل التكميلي S5) أو ملاحظتها مباشرة من خلال وجود حويصلات دهنية داخل خلايا الكبد المتضخمة (الشكل 8 والملف التكميلي 1).

Figure 7
الشكل 7: زيادة التحبب وحجم الخلية مقاسة بقياس التدفق الخلوي. أ: زيادة التحبب بين الخلايا الكبدية المعزولة بعد 24 ساعة من استئصال الكبد كعلامة غير مباشرة لوجود الحويصلات الليبيدية. (ب) مدرج تكراري يوضح SSC. (ج) تمثل النسب المئوية جزء الخلايا ذات الكثافة الحبيبية السيتوبلازمية العالية، التي تقيسها إشارة SSC. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحرافات المعيارية مع n = 6-8 / مجموعة. الاختصارات: sHx = استئصال الكبد القياسي. eHx = استئصال الكبد الممتد. بدون استئصال = جراحة وهمية ؛ FSC = إشارة التشتت الأمامية ؛ SSC = مبعثر جانبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: تلطيخ السودان الوريدي كعلامة على محتوى الدهون في خلايا الكبد الطازجة المعزولة. أ: خلايا كبدية فأر كاملة طازجة دون جراحة سابقة. زيادة حجم ومحتوى الدهون في خلايا الكبد 24 ساعة (ب) بعد 70٪ - استئصال الكبد و (ج) 86٪ - استئصال الكبد. لاحظ الوجود المصاحب لكل من خلايا الكبد الكبيرة والحنية وخلايا الكبد الأصغر غير الدهنية. قضبان المقياس = 30 ميكرومتر (B-D). تشير أشرطة الخطأ إلى الانحرافات المعيارية مع n = 6-8 / مجموعة. الاختصارات: sHx = استئصال الكبد القياسي. eHx = استئصال الكبد الممتد. بدون استئصال = جراحة وهمية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تبقى نسبة منخفضة جدا من الخلايا المناعية وغير المتنية في التعليق النهائي. يتم تحقيق مزيد من التنقية بواسطة FACS أو MACS ، إذا رغبت في ذلك. يستخدم الاختيار السلبي لخلايا CD31 + و CD45 + عن طريق قياس التدفق الخلوي لتوضيح وقياس الخلايا غير المتنية (الشكل 5).

Figure 5
الشكل 5: استراتيجية بوابة قياس التدفق الخلوي واختيار الخلايا المتنية CD31 وCD45. (أ) مخطط البوابة مع جميع الأحداث المسجلة ؛ النظر في الحجم الكبير نسبيا من خلايا الكبد واستخدام الفولتية المعدلة. لا تذهب أعلى من 350 فولت ل FSC و 220 فولت ل SSC. (ب) بوابة مفردة. (ج) يتم اختيار الخلايا الكبدية عن طريق بوابة خلايا CD31- (علامة بطانية) وخلايا CD45 (علامة مناعية). يمكن إجراء هذا الاختيار في فارز الخلايا المنشط بالتألق لاختيار الخلايا المتنية لمزيد من التحليلات النهائية ، إذا لزم الأمر ؛ ن = 4-5 / مجموعة. الاختصارات: FSC = مبعثر أمامي ؛ SSC = مبعثر جانبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لإثبات فعالية البروتوكول المعدل في الاحتفاظ بالخلايا الحنية ، تم عزل خلايا الكبد باستخدام نهج تدرج الكثافةالكلاسيكي 7 (الشكل 9 أ). على عكس الإجراء المعدل (الشكل 9 ب) ، كانت طبقة الخلايا الدهنية مرئية بوضوح أعلى تدرج الكثافة. أكد تحليل الخلايا الغياب الصارخ لخلايا الكبد المحملة بالدهون في الحبيبات بعد الطرد المركزي المتدرج الكثافة. في المقابل ، تم إثراء الخلايا من الطبقة الدهنية بخلايا الكبد الدهنية وجزء كبير من الخلايا غير المتنية والميتة (الشكل 9 أ). وبالتالي ، فإن العزلة الكلاسيكية تحرم حصاد الخلايا الدهنية ، في حين أن هذا البروتوكول المعدل الذي يحذف تدرج الكثافة يحتفظ بمجموعات فرعية محملة بالدهون ، مما يتيح الاستكشاف غير المتحيز لتجديد الكبد دون الانحراف نحو خلايا الكبد الخالية من الدهون.

Figure 9
الشكل 9: نواتج الخلايا الكبدية الدهنية باتباع بروتوكول عزل تدرج الكثافة الكلاسيكي مقارنة بالبروتوكول المحسن . (أ) باستخدام طريقة تنقية تدرج الكثافة الكلاسيكية (التركيز النهائي لمحلول تدرج الكثافة بنسبة 90٪ في محلول ملحي مخزن بالفوسفات) ، يتم جمع خلايا الكبد الميتة في طبقة خلوية أعلى محلول تدرج الكثافة. (ب) لا تتكون هذه الطبقة من خلايا غير متنية وخلايا كبدية غير قابلة للحياة فحسب، بل تتكون أيضا من خلايا كبدية دهنية كبيرة وقابلة للحياة. (ج) تحتوي الحبيبات التي يتم الحصول عليها بعد الطرد المركزي المتدرج الكثافة على خلايا كبدية هزيلة أصغر حجما، وخالية في الغالب من الخلايا الحنية الدهنية. هذا هو الجزء "النقي" المعزول بالبروتوكول الكلاسيكي. د: مع البروتوكول المحسن، لا تفقد الخلايا الكبدية المملوءة بالليبيدات، وتحبيبات جميع الخلايا الكبدية. يتكون الطافي (E) في الغالب من خلايا كبدية ميتة ومجزأة وخلايا غير متنية ، في حين أن الحبيبات (F) عبارة عن خليط من خلايا الكبد ذات الحجم المتغير ومحتوى الدهون. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: البروتوكولات التكميلية. (أ) تلطيخ الدهون بالسودان الرابع؛ ب: استئصال الكبد القياسي والممتد في الفئران. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S1: نظرة عامة على إعداد التروية. (1) قنية الوريد الأجوف السفلي. (2) قم بتغذية الكبد بمحلول التروية الدافئ لتحضير الكالسيوم. (3) قم بتسخين المخزن المؤقت للهضم باستخدام الكولاجين و Ca2+ لفصل الخلايا في الجسم الحي. قم بإزالة الكبد و (4) قم بتخزينه في مخزن مؤقت للحفظ المثلج (بحد أقصى 30 دقيقة). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: إعداد التروية. (أ) طاولة الإرواء مع فوهة إيزوفلوران ، ومصباح تسخين الضوء الأحمر ، وأنبوب التروية. يمكن وضع جسم ثقيل أسفل الأنبوب لتثبيته وتقليل خطر الإزاحة. (ب) خلال الدقائق القليلة الأولى من التروية، يتدفق بعض الدم عبر الوريد البابي ويتجمع في تجويف البطن المفتوح. ج: يشق جدار البطن من جانب واحد لتصريف الدم. مسحة القطن تسهل الصرف. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S3: كبسولة غليسون. (أ) تتمزق كبسولة جليسون بملاقط ذات أطراف دقيقة في مواقع قليلة على طول سطح الكبد، وتنطلق خلايا الكبد عن طريق هز الكبسولة برفق. (ب) يجب أن يتمزق الكبد بسهولة. ج: كيس الكبد الفارغ (كبسولة جليسون) مع الخلايا الكبدية المنطلقة معلقة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S4: استراتيجية بوابة قياس التدفق الخلوي لفحص الجدوى. (أ) تم تسجيل جميع الأحداث. (ب) بوابة مفردة. (ج) تلطيخ حي / ميت باستخدام صبغة الصلاحية الخضراء Alexa Fluor 488 Zombie. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S5: استراتيجية بوابة قياس التدفق الخلوي لقياس الحبيبة. (أ) تم تسجيل جميع الأحداث. (ب) بوابة مفردة. (ج) مخطط نقطي للتشتت الجانبي (SSC; المحور x ) مقابل التشتت الأمامي (FSC; المحور ص ) لتحليل مستويات الدقة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S6: تنقية خلايا الكبد. (أ) بيليه الخلية بعد خطوة الطرد المركزي الأولى ؛ لاحظ الطبقة الدهنية أعلى الوسط. ب: كريات الخلايا الكبدية بعد الجولة الثانية من الطرد المركزي. ج: الخلايا الكبدية المنقاة في نهاية عملية التنقية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر البروتوكول المنشور طريقة موثوقة ومباشرة لعزل غلة عالية من خلايا الكبد الفأر الطبيعية والدهنية لتحليلات المصب أحادية الخلية أو التحليل المجمع للخلايا بعد فرز FACS. الميزة المميزة لتنقية تدرج الكثافة هي أن محتوى الدهون الخلوية ليس له أي تأثير أساسي على العائد الفعال لخلايا الكبد. وبالتالي ، سيتم الاحتفاظ بجزء من خلايا الكبد الدهنية وإدراجها في التحليلات النهائية. هذا ليس أمرا بالغ الأهمية لدراسة أمراض الكبد الدهنية فحسب ، بل إنه أمر بالغ الأهمية أيضا لأي تحليل للعمليات التي تلي عمليات استئصال الكبد الرئيسية ، حيث تظهر خلايا الكبد تنكس دهني ديناميكي زمانيا ومكانيا خلال أول 2-3 أيام من التجديد. على الرغم من أن تحليلات (الخلية الواحدة) لخلايا الكبد المعزولة قد أجريت بالفعل بعد استئصال الكبد19،20،21 ، يجب افتراض أن عدد الخلايا التي تم تحليلها كان ، جزئيا على الأقل ، محروما من خلايا الكبد المحملة بالدهون ، وبالتالي ، لم تكن النتائج ممثلة تماما وتميل نحو خلايا الكبد الخالية من الدهون.

حاليا ، لم يتم توضيح وظيفة TRAS بشكل كامل. على سبيل المثال ، لا تزال الاختلافات المكانية في محتوى الدهون داخل فصيصات الكبد غير مفهومة. لذلك ، هناك حاجة إلى طريقة تسمح بالكشف الكمي والنوعي دون استبعاد هذه الخلايا بدقة من التحليلات (على سبيل المثال ، لنسخ الخلية الواحدة ، وقياس التدفق الخلوي ، والأيض).

بشكل عام ، فإن إنتاجية خلايا الكبد مع هذا البروتوكول المحسن متفوقة بشكل ملحوظ على الطرق الأخرى لعزل خلايا الكبد المحتوية على الدهون (على سبيل المثال ، من الفئران المصابة بالتهاب الكبد الدهني غير الكحولي ، NASH) باستخدام تنقية تدرج الكثافة15. ومع ذلك ، يمكن أن يختلف إنتاج الخلايا وصلاحيتها ومحتوى الدهون بين المستحضرات. يبدو أن هناك عدة عوامل مسؤولة.

أولا ، ستختلف دفعات مختلفة من مزيج كولاجيناز أو كولاجيناز في نشاطها الأنزيمي. ومع ذلك ، فإن الاختلافات من الكثير إلى الكثير ليست حرجة كما هو الحال مع الكولاجين التقليدي. ومع ذلك ، قد يكون من الضروري ضبط تركيز العمل. يمكن تقليل الاختلافات بشكل أكبر عن طريق التخزين المناسب حتى الاستخدام (الليوفيليزات الجافة ومحاليل المخزون المعاد ترطيبها عند -15 إلى -25 درجة مئوية) وتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة ، ولكن لا يمكن التخلص منها تماما. لذلك ، يوصى باستخدام الكولاجين فقط من دفعة معينة لسلسلة تجريبية معينة. بالإضافة إلى ذلك ، يعتمد النشاط الأنزيمي على درجة الحرارة التي يصل عندها مخزن الهضم إلى الكبد ، مع درجة حرارة مثالية تتراوح بين 35 درجة مئوية و 37 درجة مئوية لمزيج من الكولاجين الأول والثاني22. ستقلل درجات الحرارة المنخفضة من النشاط الأنزيمي ، في حين أن درجات الحرارة فوق 50 درجة مئوية يمكن أن تؤدي إلى تمسخ البروتين بشكل لا رجعة فيه. اختبر ذلك مسبقا وقم بتحسين الظروف التجريبية عن طريق ضبط درجة الحرارة الأولية لمخزن الهضم المؤقت وطول وقطر الأنبوب البلاستيكي وسرعة التدفق. على سبيل المثال ، من المتوقع حدوث انخفاض في درجة حرارة العازلة تصل إلى 10 درجات مئوية داخل أنبوب بطول 60 سم. قم بتصحيح درجة الحرارة باستخدام وسادات التسخين ومصابيح الأشعة تحت الحمراء ، إذا لزم الأمر. تعرض الكولاجين قدرتها المثلى على الهضم عند درجة حموضة 7.4. لذلك ، ينصح بضبط الرقم الهيدروجيني للمحاليل العازلة بالفعل عند درجة حرارة عمل تبلغ حوالي 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.

ثانيا ، من الأهمية بمكان طرد الكبد (أو الفأر بأكمله) بشكل كاف باستخدام محلول التروية قبل البدء في عملية الهضم للتخلص من المثبطات المحتملة مثل المصل أو الألبومين. من الناحية المثالية ، لا يبدأ التروية إلا بعد توقف الدورة الدموية الجهازية ، لضمان انتقال المخزن المؤقت للهضم فقط من الوريد الأجوف عبر الكبد إلى التدفق الخارجي عبر الوريد البابي المفتوح. يمكن إغلاق الوريد الأجوف العلوي بمشبك وعائي صغير. هذا يمنع ملامسة مكونات الدم المتبقية / مثبطات. طريقة أخرى لغسل الكبد على النحو الأمثل هي لقط متقطع من الوريد البابي. يجب أن يتم ذلك بعناية - وبمجرد وصول المخزن المؤقت للهضم إلى الكبد - يتم إجراؤه مرة واحدة فقط لتجنب إتلاف الخلايا المهضومة بالفعل.

ثالثا ، خلايا الكبد المتجددة حساسة ، وقد أظهرت التجربة أنها تتطلب أوقات هضم أقصر ومعالجة أكثر حذرا لتجنب الإفراط في الهضم وإلحاق الضرر بالخلايا. لحصاد الكبد برفق قدر الإمكان ، يوصى بإمساك الهيلوس الكبدي بمشبك ثم قطع الوريد الأجوف العلوي أولا وتحرير الكبد من الوصلات بالوريد والحجاب الحاجز. بعد ذلك ، يمكن قطع الوريد الأجوف السفلي والوريد البابي ، مما يتيح تعبئة الكبد ويحرره بسهولة من الأربطة المعدية المعوية والمريء من جانب والكلى اليمنى على الجانب الآخر. في الفئران التي تم استئصال الكبد ، من الممكن الإمساك بعناية بأحد الأربطة من الفصوص المتوسطة لإزالة الكبد. إذا جرت محاولة لسحب الكبد بالقوة ، فقد تتمزق كبسولة غليسون ، وقد تضيع الخلايا المعزولة.

أخيرا ، من الضروري عدم مقاطعة أو تأخير إجراء التروية والمعالجة الإضافية لخلايا الكبد ، لأن هذا سيؤثر على الفور وحتما على الجدوى. من الناحية المثالية ، يتم إجراء التروية في فريق مكون من شخصين على الأقل وعلى واحد في كل مرة. ومع ذلك ، فإن هذه المتطلبات في الوقت والقوى العاملة هي أحد قيود هذه الطريقة ، على الرغم من أن هذا ينطبق على الطرق البديلة أيضا.

هناك قيد آخر يتمثل في النقاء النهائي لتعليق الخلية الناتج ، حيث أن ميزة عدم فقدان خلايا الكبد الدهنية إلى تدرج الكثافة تؤدي إلى نسبة صغيرة من الخلايا غير المتنية و / أو المناعية المتبقية. في العينة الموضحة ، يكون جزء CD45 + (الخلايا المناعية) و CD31 + (الخلايا البطانية) أقل من 5٪ ، وعند اختيار حجم الخلية أولا أثناء قياس التدفق الخلوي ، فإن النسب المئوية ل CD45 + و CD31 + هي 1.2٪ و 2.2٪ على التوالي (الشكل 5). بالنسبة لمعظم التطبيقات ، يكون هذا المستوى من النقاء كافيا ، لكن الطرق شديدة الحساسية أو الاستخدام الإضافي في مزارع الخلايا الأولية ربما يتطلب درجة أعلى. استخدمت العديد من الدراسات CD31 و CD45 كعلامات جهازية لفرز مجموعات الخلايا الكبدية بواسطة MACS 23,24 أو FACS25.

طريقة العزل المحسنة هذه مناسبة بشكل مثالي لدراسة تجديد الكبد ، وخاصة الفترة المبكرة التي تظهر بكميات كبيرة من خلايا الكبد الدهنية. PHLF ، الذي يتميز بتنكس دهني مستمر ، هو موضوع ذو صلة بشكل خاص يتطلب البحث. بعد عمليات استئصال الكبد الممتدة التي تترك وراءها بقايا هامشية ، يمكن أن يتطور PHLF ويمثل بالفعل السبب الأكثر شيوعا للوفاة بسبب جراحة الكبد. علم الأحياء المرضي غير مفهوم إلا جزئيا ، ولا يتوفر حاليا علاج26. بالنظر إلى أن PHLF يحد بشكل كبير من تطبيق جراحة الكبد (مثل علاج الأورام الخبيثة الكبدية) ، فإن استكشاف أسبابها وتحديد التدابير المحتملة هو حاجة طبية واضحة.

توجد حاجة أيضا لدراسة الأمراض التي تشترك في تنكس دهني كبدي كنقطة انطلاق. ومن الأمثلة البارزة على ذلك مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) ، والذي قد يتطور إلى NASH وفي النهاية إلى سرطان الخلايا الكبدية (HCC) 27. أدى انتشار أنماط الحياة المستقرة بالتزامن مع النظام الغذائي الغربي إلى انتشار وباء NAFLD في جميع أنحاء العالم ، وبالتالي ، من المتوقع أن يرتفع معدل الإصابة بسرطان الكبد28,29. التنكس الدهني ، بدوره ، يرتبط ارتباطا وثيقا بالسمنة ، ومتلازمة التمثيل الغذائي ، ومرض السكري من النوع 2 ، وجميع الأمراض مع ارتفاع معدلالإصابة 30. لذلك ، يمثل التنكس الدهني عبئا متزايدا على نظام الرعاية الصحية الحالي ، مما يستدعي وسائل فعالة لإدارته. تتيح طريقة نضح كولاجيناز المحسنة المكونة من خطوتين دراسة خلايا الكبد الدهنية على مستوى الخلية الواحدة ، وبالتالي يجب أن تساعد في استكشاف أسباب وعواقب تراكم الدهون في الخلايا الكبدية.

يقدم هذا البروتوكول تقنية سهلة وسريعة وموثوقة للعزل في الجسم الحي لتجديد خلايا الكبد من الفئران بعد استئصال الكبد الجزئي (70٪) والممتد (86٪). لا يعتمد هذا النهج على تنقية التدرج ويمكن استخدامه للتحقيق في عمليات تجديد الكبد مع تضمين خلايا الكبد المحملة بالدهون والتي عادة ما تفقد أثناء بروتوكولات العزل التقليدية. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة للبحث عن أمراض الكبد المختلفة المرتبطة بالتغيرات الدهنية ولا تقتصر على أنواع الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة من قبل Swiss National Fond (منحة المشروع 310030_189262).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Alexa Fluor 488 Zombie green BioLegend 423111 Amine-reactive viability dye
Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% Provet AG QN01AB06 CAUTION: needs ventilation
EDTA solution Sigma-Aldrich E8008-100ML -
Ethanol Sigma-Aldrich V001229 Dilute with water to 70%
Fetal bovine serum (FCS) Gibco A5256701 -
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red Sigma-Aldrich H9269-6x600ML For digestion/preservation
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red Sigma-Aldrich H6648-6x500ML For perfusion buffer
HEPES solution, 1 M Sigma-Aldrich 83264-100ML-F -
Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) B. Braun 1050052 For stabilization of cannulation site
Hoechst 33258 Staining Dye Solution Abcam ab228550 -
Liberase Research Grade Roche 5401119001 Lyophilized collagenases I/II
NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer B. Braun 123 -
Paralube Vet Ointment Dechra 17033-211-38 -
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco A1286301 -
Sudan IV – Lipid staining Sigma-Aldrich V001423 -
Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL Indivior Europe Ltd. 345928 Narcotics. Store securely.
Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered Sigma-Aldrich T8154 For cell counting
Williams’ Medium E Sigma-Aldrich W4128-500ML -
Materials
25 mL serological pipette, Greiner Cellstar Merck P7865 -
50 mL Falcon tubes TPP - -
BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G BD Falcon 391349 -
Cell scraper, rotating blade width 25 mm TPP 99004 -
Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon BD Falcon 352360 -
Fenestrated sterile surgical drape - - Reusable cloth material
Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) Drifton FILLINGNOZZLE#16 To go into the tubes
Flow cytometry tubes, 5 mL BD Falcon 352008 -
Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm Drifton LM41 Connection tube to syringe
Petri dishes, 96 x 21 mm TPP 93100 -
Prolene 5-0 Ethicon 8614H To retract the sternum
Prolene 6-0 Ethicon 8695H For skin suture
Prolene 8-0 Ethicon EH7470E Ligature gall bladder
Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm Drifton SC0374T Perfusion tube
Equipment
BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer BD - -
Isis rodent shaver Aesculap GT421 -
Isofluran station Provet - -
Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 Labogene - -
Neubauer-improved counting chamber Marienfeld - -
Oxygen concentrator – EverFlo Philips  1020007 0 – 5 L/min
Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix TPP 94700 -
Shenchen perfusion pump – YZ1515x Shenchen YZ1515x -
Surgical microscope – SZX9 Olympus - -
ThermoLux warming mat Thermo Lux - -
Vortex Genie 2, 2700 UpM NeoLab 7-0092 -
Water bath – Precision GP 02 Thermo scientific - Adjust to 42 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
  2. Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
  3. Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. Partial hepatectomy in mice. Lab Animal. 49, 1 Suppl 81-88 (2015).
  4. Lehmann, K., et al. Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration. Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).
  5. Makino, H., et al. A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice. Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).
  6. Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N. Liver Pathology. Gayam, V., Engin, O. , IntechOpen. (2019).
  7. Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).
  8. Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
  9. Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers. Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).
  10. Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
  11. Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver. Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).
  12. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
  13. Trotter, N. L. A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy. Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).
  14. Kachaylo, E., et al. PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice. Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).
  15. Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
  16. Dold, S., et al. Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation. PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).
  17. Boyce, S., Harrison, D. A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse. Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).
  18. Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).
  19. Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration. JCI Insight. 5 (22), (2020).
  20. Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver. Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).
  21. Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation. Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).
  22. Roche, Liberase TM Research Grade. , (2020).
  23. Giugliano, S., et al. Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication. Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).
  24. Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).
  25. Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes. Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).
  26. Helling, T. S. Liver failure following partial hepatectomy. HPB. 8 (3), 165-174 (2006).
  27. Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. Hepatocellular carcinoma and lifestyles. Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).
  28. Park, W. Y., et al. Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study. Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).
  29. Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude. Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
  30. Roeb, E. Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD). Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).

Tags

الطب، العدد 190،
عزل خلايا الكبد المتجددة بعد استئصال الكبد الجزئي في الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Breuer, E., Humar, B. Isolation of… More

Breuer, E., Humar, B. Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice. J. Vis. Exp. (190), e64493, doi:10.3791/64493 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter