Summary
Gli epatociti carichi di lipidi sono inerenti alla rigenerazione del fegato, ma di solito vengono persi con la centrifugazione a gradiente di densità. Qui, presentiamo un protocollo di isolamento cellulare ottimizzato che mantiene gli epatociti steatosici, producendo popolazioni rappresentative di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi.
Abstract
L'epatectomia parziale è stata ampiamente utilizzata per studiare la rigenerazione epatica nei topi, ma l'isolamento di alte rese di epatociti vitali per applicazioni a valle di singole cellule è impegnativo. Un marcato accumulo di lipidi all'interno degli epatociti rigeneranti si osserva durante i primi 2 giorni di normale rigenerazione epatica nei topi. Questa cosiddetta steatosi associata alla rigenerazione transitoria (TRAS) è temporanea ma si sovrappone parzialmente alla fase proliferativa principale. La purificazione a gradiente di densità è la spina dorsale della maggior parte dei protocolli esistenti per l'isolamento degli epatociti primari. Poiché la purificazione del gradiente si basa sulla densità e sulla dimensione delle cellule, separa le popolazioni di epatociti non steatotici da quelli steatotici. Pertanto, gli epatociti grassi spesso vengono persi, producendo frazioni epatocitarie non rappresentative.
Il protocollo presentato descrive un metodo semplice e affidabile per l'isolamento in vivo degli epatociti rigeneranti indipendentemente dal loro contenuto lipidico. Gli epatociti di topi maschi C57BL/6 vengono isolati 24-48 ore dopo l'epatectomia mediante un classico approccio di perfusione della collagenasi in due fasi. Una pompa peristaltica standard guida le soluzioni riscaldate attraverso la vena cava inferiore cateterizzata nel resto, utilizzando una tecnica di perfusione retrograda con deflusso attraverso la vena porta. Gli epatociti sono dissociati dalla collagenasi per il loro rilascio dalla capsula di Glisson. Dopo il lavaggio e un'attenta centrifugazione, gli epatociti possono essere utilizzati per eventuali analisi a valle. In conclusione, questo articolo descrive una tecnica semplice e riproducibile per l'isolamento di una popolazione rappresentativa di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi. Il metodo può anche aiutare lo studio della malattia del fegato grasso.
Introduction
Il fegato può rigenerarsi anche dopo una grave perdita di tessuto. Questa capacità rigenerativa unica è esplicitamente illustrata dal modello sperimentale di epatectomia parziale (70%), descritto per la prima volta nei ratti da Higgins e Anderson nel 19311. In questo modello, il 70% del fegato viene rimosso chirurgicamente dagli animali tagliando i lobi del fegato più grandi. I lobi rimanenti crescono quindi attraverso l'ipertrofia compensatoria per ripristinare la massa epatica originale entro circa 1 settimana dopo l'intervento chirurgico, anche se senza ripristino dell'architettura epatica originale 2,3. Sono state sviluppate ulteriori epatectomie con quantità variabili di rimozione tissutale, come l'epatectomia estesa all'86% in cui il residuo epatico è troppo piccolo per recuperare, portando infine a insufficienza epatica postepatectomia (PHLF) e successiva morte nel 30% -50% degli animali 4,5,6. Questi modelli consentono lo studio della rigenerazione epatica normale e fallita, a seconda della quantità di tessuto resecato (Figura 1).
Sebbene i modelli murini di epatectomie siano stati utilizzati con successo per molti anni, solo recentemente i metodi analitici più avanzati hanno permesso una visione più approfondita a livello di singola cellula. Per la maggior parte di questi metodi, tuttavia, la presenza di singoli epatociti è un prerequisito di base. La maggior parte dei protocolli per l'isolamento degli epatociti primari si basano su una tecnica di perfusione della collagenasi in due fasi e sulla successiva purificazione del gradiente di densità per separare gli epatociti vitali dai detriti e dalle cellule morte non parenchimali, nonché dalle cellule morte 7,8,9. Questo metodo è stato descritto per la prima volta da Berry e Friend nel 196910 e adattato da Seglen e colleghi nel 197211,12. Tuttavia, poiché la centrifugazione a gradiente si basa sulla densità e sulle dimensioni delle cellule, gli epatociti carichi di lipidi vengono spesso persi durante la purificazione standard. Mentre tale perdita può essere trascurabile per molte domande di ricerca, è un aspetto cruciale per la rigenerazione precoce del fegato. Durante i primi 2 giorni, gli epatociti all'interno del fegato di topo rigenerante accumulano lipidi, crescendo così di dimensioni e diminuendo in densità. Questa steatosi associata alla rigenerazione transitoria (TRAS) serve a fornire carburante rigenerativo ed è temporanea, ma si sovrappone parzialmente alla fase proliferativa principale ed è distribuita in modo non uniforme all'interno dei lobuli epatici - le unità funzionali del fegato13,14. Dopo l'epatectomia estesa all'86%, tuttavia, si verifica anche TRAS ma persiste, perché la rigenerazione è in stallo e i lipidi non vengono ossidati14. Pertanto, la purificazione a gradiente degli epatociti dopo epatectomie al 70% o all'86% produrrà frazioni non rappresentative, poiché la maggior parte degli epatociti carichi di lipidi viene persa a causa della loro bassa densità15.
In questo protocollo di isolamento modificato, gli epatociti di topi C57BL/6 vengono isolati 24-48 ore dopo l'epatectomia mediante un classico approccio di perfusione della collagenasi in due fasi. Di solito, l'incannulamento e la perfusione del residuo per l'isolamento cellulare vengono eseguiti tramite la vena porta. Tuttavia, la resistenza portovascolare nei piccoli resti lasciati dopo la resezione maggiore è alta16, e quindi la perfusione è delicata. Poiché la vena cava rimane inalterata dalle epatectomie, la perfusione può essere facilmente eseguita in direzione retrograda tramite incannulamento della vena cava. Una pompa peristaltica standard guida le soluzioni riscaldate attraverso la vena cava inferiore cateterizzata nel residuo epatico, utilizzando la perfusione retrograda con deflusso attraverso la vena porta (Figura supplementare S1). Gli epatociti sono dissociati dalle collagenasi e rilasciati dalla capsula di Glisson. Dopo il lavaggio e l'attenta lavorazione degli epatociti vitali mediante isolamento graduale utilizzando un approccio di centrifugazione a bassa velocità, gli epatociti possono essere utilizzati per qualsiasi analisi a valle.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati conformi alle prescrizioni federali svizzere sugli animali e approvati dall'Ufficio veterinario di Zurigo (n. 007/2017, 156/2019) che garantisce l'assistenza umana. I topi maschi C57BL/6 di età compresa tra 10 e 12 settimane sono stati tenuti in un ciclo giorno/notte di 12 ore con libero accesso a cibo e acqua. Ogni gruppo sperimentale era composto da sei a otto animali. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, le attrezzature e i reagenti utilizzati in questo protocollo.
1. Epatectomia parziale nei topi
- Per l'epatectomia standard (70%), legare e resecare il lobo laterale sinistro, la porzione destra del lobo mediano e la porzione sinistra del lobo mediano (Figura 1B). Per l'epatectomia estesa (86%)4, rimuovere anche i lobi caudati e il lobo anteriore destro (Figura 1C).
- NOTA: L'epatectomia standard è una procedura che è stata utilizzata nella ricerca sulla rigenerazione del fegato per molti anni. I protocolli per questa procedura sono disponibili3,17, incluso il protocollo video-assistito di Mitchell e Willenbring18. Ulteriori dettagli sulle tecniche utilizzate qui per le epatectomie sono disponibili nel file supplementare 1.
Figura 1: Epatectomia standard (70%) ed estesa (86%) nei topi. (A) I cinque lobi del fegato di topo e i loro rispettivi contributi al peso totale del fegato. (B) Illustrazione schematica dell'epatectomia al 70% nei topi. I lobi scuri rappresentano il futuro residuo di fegato. (C) Illustrazione schematica dell'epatectomia all'86% nei topi. I lobi scuri rappresentano il futuro residuo di fegato. (D) Volume preciso di tessuto resecato dopo epatectomia al 70% e all'86%. (E) Addome del topo immediatamente dopo 70%-epatectomia; (F) addome del topo immediatamente (a sinistra) e 48 ore (a destra) dopo l'86% di epatectomia. Si noti il colore pallido del residuo steatosico (freccia bianca). n = 6-7/gruppo. Abbreviazioni: sHx = epatectomia standard; eHx = epatectomia estesa; LW = peso del fegato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
2. Preparazione delle soluzioni di perfusione
- Preparare i tamponi di perfusione, digestione e conservazione (vedere Tabella 1).
- Regolare il pH di tutte le soluzioni tampone a 37 °C aggiungendo idrossido di sodio (NaOH) o acido cloridrico (HCl) secondo necessità. Il pH ottimale per i tamponi è 7,4.
- Posizionare il buffer di conservazione e il Medium E di Williams sul ghiaccio.
- Preparare il tampone citometrico a flusso e conservarlo sul ghiaccio.
Tabella 1: Soluzioni e tamponi utilizzati per la digestione e la purificazione degli epatociti. Clicca qui per scaricare questa tabella.
3. Preparazione dell'apparecchiatura di perfusione
- Riscaldare il bagnomaria a 42 °C e posizionare il tampone di perfusione (50 ml) e il tampone di digestione (10-20 ml) nel bagnomaria. Non aggiungere ancora collagenasi al tampone di digestione.
- Preparare la pompa peristaltica e inserire il tubo. La configurazione completa della perfusione è mostrata nella Figura 2.
- Collegare una cannula da 26 G IV all'estremità di uscita del tubo utilizzando un connettore Luer lock. Inserire l'estremità di ingresso del tubo nel tubo tampone di perfusione preriscaldato nel bagno d'acqua. Lavare il tubo con etanolo al 70%, seguito da 50 ml di cloruro di sodio sterile (NaCl 0,9%). Innescare il tubo con tampone di perfusione caldo (velocità della pompa di 3 mL/min).
- Sedare il topo usando l'anestesia per inalazione di isoflurano (800 mL/min O 2, 3%-5% isoflurano per l'induzione e2% per il mantenimento durante la procedura). Maneggiare l'isoflurano sotto una cappa da laboratorio e fornire un'adeguata ventilazione.
- Somministrare buprenorfina per via sottocutanea 30 minuti prima dell'intervento chirurgico alla dose di 0,1 mg/kg di peso corporeo.
- Per prevenire l'ipotermia, posizionare il topo sedato su un pad riscaldante e mettere un tessuto di stoffa arrotolato sotto l'addome superiore per elevare il fegato sopra gli altri organi e facilitare l'accesso alla vena cava inferiore.
NOTA: Non utilizzare tessuti troppo spessi in quanto è possibile attorcigliarsi dei vasi e l'efficacia della perfusione ne risenterebbe. - Aggiungi unguento per gli occhi per prevenire danni alla cornea.
- Prima di iniziare l'intervento, assicurarsi che l'animale sia adeguatamente anestetizzato testando il riflesso di ritiro del pedale (pizzico del cuscinetto su entrambi i piedi posteriori). In caso di risposta, fornire anestesia aggiuntiva e ripetere il test prima di iniziare la procedura.
- Pulire l'addome con etanolo al 70%.
- Riaprire l'incisione della linea mediana tagliando la sutura e separando delicatamente i bordi della ferita. Se l'epatectomia è più vecchia di 24-48 h, rimuovere la sutura e tagliare la pelle con le forbici.
- Fissare una sutura in polipropilene 5-0 allo sterno, tirarla cranicamente e fissarla in questa posizione. Utilizzare un divaricatore o semplici clip per mantenere l'addome aperto. La cavità addominale deve essere esposta il più possibile per ottimizzare l'accesso e la visualizzazione.
- Sposta l'intestino verso destra usando tamponi di cotone per rivelare la vena porta e la vena cava. Utilizzare un panno umido per trattenere l'intestino.
- Posizionare un oggetto pesante di circa 2 cm di altezza (ad esempio, un anello di peso rivestito di silicone per palloni volumetrici) accanto alle zampe posteriori del topo (figura supplementare S2A). Posizionare il tubo con la cannula 26 G IV collegata sull'oggetto e posizionare con attenzione l'ago sopra la vena cava. Regolare la lunghezza del tubo.
- Mettere la soluzione madre di collagenasi preparata nel tubo tampone di digestione preriscaldato. Aggiungere 250 μL della soluzione madre a 10 mL di tampone di digestione. Preparare 10-20 ml di tampone digestivo per animale. Per animali più grandi o perfusione di fegati interi, preparare fino a 30 ml di tampone digestivo.
NOTA: Si consiglia di aggiungere la soluzione madre di collagenasi al tampone di digestione riscaldato circa 30 minuti prima dell'inizio del processo di digestione.
Figura 2: Panoramica sulla configurazione della perfusione. (A) Tavolo chirurgico con l'attrezzatura necessaria per la perfusione. (B) I materiali necessari per la preparazione del fegato, nonché l'estrazione e l'isolamento degli epatociti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
4. Incannulamento e perfusione
- Regolare la velocità della pompa a 3 ml/min e accendere la pompa. Lasciare che il tampone di perfusione preriscaldato raggiunga l'ago. Scartare i primi 2-3 ml di tampone di perfusione.
- Eseguire l'incannulamento della vena cava inferiore.
- Mentre il tampone scorre attraverso l'ago, inserire la cannula 26 G IV con un angolo poco profondo nella vena cava sotto il rene. Assicurarsi che la smussatura dell'ago punti verso l'alto.
- Utilizzare un batuffolo di cotone per tirare delicatamente la vena cava caudalmente sotto il sito di puntura in modo che la tensione fornita faciliti l'inserimento della cannula nella vena. Cerca sangue nella camera flash del catetere quando l'ago entra nel lume.
- Avanzare l'ago di altri 2-3 mm per assicurarsi che anche la punta del catetere di plastica sia entrata nella vena.
- Far scorrere il catetere di plastica sopra l'ago e nella vena cava di altri 5 mm. Rimuovere l'ago lentamente e con molta attenzione.
NOTA: Non è consigliabile fissare la cannula con una legatura. Questo passaggio richiede molto tempo in quanto la nave deve prima essere sezionata per questo scopo. Se la cannula è posizionata liberamente e sostenuta con un oggetto, non è necessaria alcuna ulteriore fissazione (vedere l'impostazione della perfusione nella figura supplementare S2). Per stabilizzare il sito di incannulazione e prevenire il riflusso, è possibile aggiungere una singola goccia di n-butil-cianoacrilato monomerico sul sito di incannulazione.
- Quando il sangue cade dalla cannula, riempirlo con tampone di perfusione caldo usando una siringa.
- Riattaccare il tubo alla cannula, ancora funzionante a una velocità della pompa di 3 ml/min. Lascia che il tampone di perfusione entri nel fegato.
- Dopo 2-3 secondi, cercare macchie bianche che si formano nel fegato e / o espansione / gonfiore della vena porta, che indicano che il tampone di perfusione scorre attraverso il fegato ed entra nei lobuli epatici dalla vena centrale (Figura 3).
- Attendere che la vena porta si gonfi visibilmente entro 1-2 secondi dopo la comparsa di macchie bianche sulla superficie del fegato. Tagliare la vena porta con le forbici il più distalmente possibile dall'ilo del fegato. Utilizzare una micro clip per recipienti per etichettare (non occludere) il sito di taglio (Figura 3B).
NOTA: Questo semplifica la valutazione del flusso attraverso il fegato durante il processo di perfusione. Il fegato si libera istantaneamente dal sangue e diventa giallo-bianco in pochi secondi (Figura 3C). Un ulteriore taglio attraverso la pelle sul lato destro dell'apertura addominale facilita il deflusso del sangue e la soluzione di perfusione (Figura 3B e Figura supplementare S2B,C). - Aumentare il flusso fino a 4-7 ml / min a seconda del peso dell'animale, delle dimensioni del fegato e dell'estensione dell'epatectomia precedente.
- Bloccare la vena porta con pinzette o morsetto vascolare per 7-10 s. Assicurarsi che non vi sia alcun fluido che stia attraversando.
NOTA: Il fegato si gonfia visibilmente durante il serraggio e si rilassa al momento del rilascio. Questo è fondamentale per lavare l'intero fegato e liberarlo da qualsiasi sangue residuo. - Eseguire un secondo morsetto dopo circa 30 secondi e assicurarsi che il fegato si gonfi e si rilassi. Continuare con il lavaggio dell'animale fino a quando il tampone che fuoriesce dalla vena porta è chiaro, ma almeno per 3-4 minuti.
NOTA: La velocità della pompa dipende dal tubo e dalle dimensioni del fegato. Deve essere valutato individualmente. - A questo punto della procedura, l'eutanasia avrebbe dovuto avvenire secondariamente al dissanguamento. Confermare che la circolazione sistemica si è fermata (nessun battito cardiaco o sfarfallio del cuore). Per garantire la morte, il pneumotorace bilaterale viene eseguito in questa fase della procedura come metodo fisico secondario di eutanasia.
NOTA: Ridurre leggermente la velocità della pompa se la circolazione sistemica si è fermata (nessun battito cardiaco o sfarfallio cardiaco).
Figura 3: Processo di perfusione dall'incannulamento alla digestione. (A) Anatomia del fegato di topo con la vena cava inferiore (freccia bianca) e la vena porta (freccia gialla). (B) Incannulamento della vena cava inferiore. La cannula è fissata con una legatura (freccia bianca) e la posizione del deflusso attraverso la vena porta aperta è contrassegnata (non bloccata) con un morsetto micro vaso. (C) Notare la comparsa di strutture a chiazze prima che il tampone di perfusione abbia liberato il fegato da tutto il sangue rimanente (freccia bianca). La pelle viene incisa (freccia gialla) e viene posizionato un batuffolo di cotone per garantire il drenaggio del sangue e del liquido di perfusione. Il bloccaggio intermittente può essere eseguito con un morsetto vascolare o una pinzetta. (D) Il fegato deve essere eliminato da tutto il sangue (*). Dopo che il tampone di digestione contenente collagenasi è entrato nel fegato, non si rilasserà più dopo il serraggio e i lobi del fegato aumenteranno di dimensioni. (E) Dopo un po ', si può osservare un aspetto frizzante sulla superficie del fegato (*). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
5. Digestione
- Mettere in pausa la pompa di perfusione e trasferire rapidamente il tubo di ingresso dal tampone di perfusione al tampone di digestione preriscaldato. Riavviare la pompa.
- Prima che il tampone di digestione raggiunga il fegato, bloccare la vena porta ancora una volta per 3-4 s. Assicurarsi che il fegato si rilassi al rilascio del morsetto e che il liquido di perfusione rimanga chiaro.
NOTA: Il tampone di digestione contiene rosso fenolo ed è facilmente distinguibile dal tampone di perfusione chiaro. Ciò consente un facile tracciamento all'interno del tubo. - Non appena il tampone di digestione ha raggiunto il fegato, bloccare nuovamente la vena porta con una micro clip vascolare.
NOTA: Durante il bloccaggio, il fegato si gonfia ma non si rilassa al rilascio del morsetto. Questo è normale. - Per facilitare il processo di digestione, chiudere la vena cava superiore con un morsetto vascolare direttamente sotto il diaframma per consentire al tampone di digestione di passare dalla vena cava inferiore al fegato fino al deflusso attraverso la vena porta aperta.
NOTA: Questo bloccaggio assicura che la circolazione sistemica sia bypassata e che venga evitato il contatto non necessario con componenti / inibitori del sangue residui. Questo passaggio è facoltativo, in quanto è difficile avvicinarsi alla vena cava superiore dietro il tessuto epatico allargato dopo un intervento chirurgico fittizio, ma l'accesso è molto più facile nei topi epatectomizzati. - Digerire per circa 4 minuti ad una portata di 5 ml/min. Man mano che la digestione progredisce, cerca segni del fegato che inizia a gonfiarsi e piccole sezioni chiare / trasparenti sulla superficie del fegato. Inoltre, osservare che il fegato assume la consistenza di un pezzo di stoffa bagnato e appare quasi fradicio (Figura 3E). Sondare la consistenza toccando con attenzione con un batuffolo di cotone umido.
- Continuare con la perfusione fino a quando non si può osservare una marcata differenza nella consistenza superficiale del fegato. Si osservi che il fegato assume un colore molto chiaro e un aspetto frizzante (Figura 3E), e la capsula di Glisson (cioè il sacco del fegato) si separa dal parenchima. Interrompere il processo di digestione non appena il fegato ha acquisito queste proprietà, poiché l'eccessiva digestione può danneggiare gli epatociti. Rimuovere l'ago prima che l'aria entri nel fegato.
NOTA: Di solito sono necessari 10-20 ml di tampone di digestione per raggiungere una digestione sufficiente. Ciò dipende dalle dimensioni dell'animale, dall'estensione dell'epatectomia, dalla configurazione dei tubi e dalla qualità della soluzione di collagenasi. Se necessario, aumentare il tempo di perfusione piuttosto che la velocità di perfusione. Troppa pressione nel sistema vascolare può causare lo scoppio del fegato e il fluido di perfusione / digestione potrebbe essere perso nello spazio retroperitoneale.
6. Preparazione del fegato
- Rimuovere delicatamente il fegato dalla cavità addominale. Fate molta attenzione perché ora è molto fragile e fragile.
- Afferrare il tessuto connettivo centrale tra i lobi usando una pinza e sollevarlo leggermente verso l'alto, usandolo come punto di ancoraggio.
- Tagliare tutte le connessioni del fegato ad altri organi, rimuovere la cistifellea e posizionare il fegato nel tampone di conservazione ghiacciato.
NOTA: Idealmente, l'estrazione degli epatociti e l'ulteriore elaborazione dovrebbero avvenire immediatamente per mantenere la vitalità degli epatociti. Tuttavia, se necessario, il fegato può essere conservato per un breve periodo a 4 °C (ad es. per il trasporto). Questo ritardo non deve superare i 30-40 minuti.
7. Estrazione degli epatociti
- Trasferire il fegato in una capsula di Petri da 10 cm e aggiungere 10 ml di Medium E di Williams ghiacciato.
- Rompere la capsula di Glisson con pinzette a punta fine in alcuni punti lungo la superficie del fegato. Afferrare una parte centrale (ad esempio, tessuto connettivo all'ilo del fegato) con due paia di pinzette e separarle lentamente, permettendo alla capsula di strapparsi senza danneggiare gli epatociti. Rilasciare le cellule agitando delicatamente la capsula (Figura supplementare S3).
NOTA: Idealmente, il fegato si strappa facilmente e rilascia le cellule. Non applicare la forza. Un raschietto cellulare può aiutare a rimuovere completamente tutte le cellule e aumentare la resa cellulare. Non tagliare il fegato a pezzi con le forbici. - Filtrare 5 ml di polpa epatica attraverso un filtro cellulare da 100 μm in un tubo da 50 ml. Risciacquare il filtro con 10 ml di mezzo fresco ghiacciato. Filtrare i restanti 5 ml di polpa attraverso il filtro cellulare.
NOTA: Utilizzare una pipetta sierologica da 25 mL per trasferire la polpa epatica con gli epatociti dissociati (Figura 4A). Pipette più piccole con aperture più piccole aumentano lo sforzo di taglio e danneggiano irreversibilmente gli epatociti. - Aggiungere un totale di 30 ml di mezzo freddo per sciacquare la capsula di Petri, filtrarla e aggiungere la sospensione al tubo da 50 ml fino a quando non è pieno. Tutte le cellule isolate sono ora in sospensione (Figura 4B).
Figura 4: Purificazione mediante centrifugazione delicata . (A) Omogenato di fegato rimasto dopo la fase di estrazione. (B) Vista microscopica (ingrandimento 20x) dell'omogenato; Si noti la marcata contaminazione con detriti. (C) Fasi di centrifugazione di purificazione e (D) viste microscopiche dei surnatanti da eliminare. (E) Vista microscopica della frazione epatocitaria purificata. Barre di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
8. Isolamento degli epatociti
- Girare a 50 × g per 5 minuti a 4 °C (accelerazione più bassa e freno più bassi possibili).
NOTA: Gli epatociti sono più densi delle cellule epatiche non parenchimali. A causa della bassa forza di centrifugazione, solo gli epatociti sono pellettati, mentre altre cellule (ad esempio, cellule immunitarie, eritrociti e cellule sinusoidali) rimangono nel surnatante. - Aspirare la maggior parte del surnatante, lasciando 1 mL per risospendere le cellule ruotando delicatamente il tubo.
- Aggiungere 40 ml di mezzo Williams' E freddo e ruotare nuovamente a 50 × g per 10 minuti a 4 °C (bassa accelerazione, freno basso) per rimuovere ulteriormente gli epatociti morti e i detriti cellulari e gli epatociti vitali e grassi del pellet (Figura 4C).
- Scartare la maggior parte del surnatante, lasciando 1 mL per risospendere le cellule ruotando il tubo.
- Aggiungere 40 mL di Williams' E medium freddo e girare di nuovo a 50 × g per 5 minuti a 4 °C (bassa accelerazione, freno basso).
- Aspirare la maggior parte del surnatante, lasciando 1 mL per risospendere le cellule ruotando delicatamente il tubo.
NOTA: non interrompere questo processo finché le celle non vengono fissate o analizzate. Gli epatociti sono molto fragili e qualsiasi ritardo nel processo di perfusione, digestione e purificazione può danneggiare le cellule. - Determinare la concentrazione finale della cellula dopo l'aggiunta di blu di tripano, utilizzando una camera di conteggio migliorata da Neubauer.
NOTA: La maggior parte dei detriti e delle cellule non parenchimali sono state rimosse, risultando in un pellet pulito di circa 10-15 × 106 epatociti rimasti dopo il 70% di epatectomia. - A seconda della concentrazione desiderata, aggiungere più mezzo ghiacciato. Utilizzare la sospensione di cellule epatocitarie per qualsiasi analisi a valle o iniziare una coltura cellulare primaria.
NOTA: In questa fase, solo poche cellule immunitarie e non parenchimali (<5%) rimangono nella sospensione. Se si desidera un'ulteriore purificazione, eseguire una selezione negativa delle celle CD31+ e CD45+ mediante selezione cellulare attivata magneticamente o a fluorescenza (MACS/FACS). Ad oggi, non esiste un marcatore di superficie affidabile e robusto per le cellule parenchimali del fegato.
9. Preparazione degli epatociti isolati per citometria a flusso
- Centrifugare gli epatociti a 100 × g per 5 minuti.
- Scartare il surnatante e aggiungere la quantità desiderata di tampone citometrico a flusso, a seconda della concentrazione della sospensione cellulare.
- Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare in un tubo di citometria a flusso. Centrifugare per 5 minuti a 100 × g ed eliminare il surnatante.
- Aggiungere 100-200 μL del colorante vitalità verde Alexa Fluor 488 Zombie diluito (concentrazione 1:400) alle cellule e agitarle delicatamente. Risospendere con cautela gli epatociti agitando manualmente o utilizzando un miscelatore a vortice a bassa velocità (massimo 2-3) per 2 s.
NOTA: non utilizzare piccole punte di pipette per risospendere le celle. Sono molto fragili e lo stress di taglio applicato provoca danni e riduce la vitalità cellulare. Se il pipettaggio non è evitabile, utilizzare una pipetta da 1.000 μL dopo aver tagliato la parte più piccola dalla punta per allargare il diametro e pipettare le celle molto lentamente. - Posizionare i tubi sul ghiaccio o conservarli a temperatura ambiente, a seconda della colorazione desiderata. Incubare le cellule per 20-30 minuti al buio.
- Aggiungere 2 ml di tampone citometrico a flusso e lavare le cellule 3 volte. Centrifugare le celle dopo ogni fase di lavaggio a 100 × g per 5 minuti.
- Aggiungere 2 mL di tampone di fissazione (1:1 4% PFA e PBS). Risospendere con cautela gli epatociti agitando manualmente o utilizzando un miscelatore a vortice a bassa velocità (massimo 2-3) per 2 s.
- Fissare le celle per 30 minuti.
- Centrifugare a 100 × g per altri 5 minuti, eliminare il surnatante e aggiungere tampone citometrico a flusso.
NOTA: Le cellule possono essere conservate in tampone citometrico a flusso prima dell'analisi fino a 72 ore dopo l'isolamento.
10. Analisi degli epatociti con citometria a flusso
- Analizzare gli epatociti utilizzando un selezionatore cellulare attivato dalla fluorescenza.
NOTA: Considerare le dimensioni relativamente grandi degli epatociti e regolare le tensioni. Inizia con una bassa tensione e non andare oltre 350 V per la dispersione diretta (FSC) e 220 V per la dispersione laterale (SSC).- Regolare le tensioni per FSC e SSC in base alle grandi dimensioni stimate delle celle. Identificare la popolazione di epatociti e registrare tutti gli eventi utilizzando SSC-A e FSC-A (Figura 5A).
- Si osservi che i detriti e le celle non parenchimali sono visualizzati nell'angolo in basso a sinistra del grafico di densità FSC rispetto a SSC e sono esclusi (Figura 5A).
- Poiché le celle doppiette possono influenzare l'analisi, costruisci un grafico di densità SSC-H (side scatter height) rispetto a SSC-A (side scatter area) per escludere doppietti, come mostrato nella Figura 5B.
- Selezionare la popolazione finale di epatociti mediante il gating delle cellule CD31- (marcatore endoteliale) e CD45- (marcatore immunitario) (Figura 5C).
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Representative Results
La TRAS raggiunge il picco a 16 ore dopo l'epatectomia e gradualmente scompare 32-48 ore dopo l'epatectomia standard, ma persiste oltre le 48 ore dopo l'epatectomia prolungata. Macroscopicamente, TRAS è facilmente visibile come una carnagione pallida del residuo epatico (Figura 1F) e può essere osservato in topi epatectomizzati tra 16 h e 48 h dopo l'intervento chirurgico.
La resa finale stimata è di 10-15 × 10 6 epatociti dopo epatectomia al 70% e 4-9 × 106 dopo epatectomia estesa all'86% nei topi, con una vitalità finale media del 78% e del 65%, rispettivamente. Ciò corrisponde alla percentuale attesa rispetto a una resa totale di 50-70 × 106 da un fegato di topo intero (Figura 6A,C). Dopo epatectomie parziali, gli epatociti mostrano un aumento delle dimensioni delle cellule rispetto al fegato normale, corrispondente al loro aumentato contenuto lipidico (Figura 6B). La strategia di gating è mostrata nella figura supplementare S4.
Figura 6: Resa degli epatociti, dimensione delle cellule e vitalità. (A) Conta cellulare di un intero fegato di topo e di residui 24 ore dopo l'epatectomia al 70% e all'86%. (B) Volume cellulare calcolato di epatociti isolati. Si noti il marcato aumento delle dimensioni delle cellule 24 ore dopo l'epatectomia, sia per il 70% che per l'86%. (C) Vitalità cellulare di epatociti isolati dopo ogni fase del processo di purificazione. La vitalità è stata misurata mediante citometria a flusso utilizzando il colorante di vitalità verde Alexa Fluor 488 Zombie. Le percentuali sono prese da tutti i singoletti degli epatociti. Per la strategia di gating, vedere la figura supplementare S6 e la figura supplementare S4. Le barre di errore si riferiscono alle deviazioni standard con n = 6-8 / gruppo. Abbreviazioni: sHx = epatectomia standard; eHx = epatectomia estesa; senza resezione = chirurgia fittizia. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Un aumento del contenuto lipidico negli epatociti murini 24 ore dopo l'epatectomia parziale può essere osservato da un aumento della granularità (Figura 7; per la strategia di gating, vedi Figura supplementare S5) o direttamente osservato dalla presenza di vescicole lipidiche all'interno di epatociti ingrossati (Figura 8 e File supplementare 1).
Figura 7: Aumento della granularità e delle dimensioni delle cellule misurate mediante citometria a flusso. (A) Aumento della granularità tra gli epatociti isolati 24 ore dopo l'epatectomia come marker indiretto per la presenza di vescicole lipidiche. (B) Istogramma che mostra SSC. (C) Le percentuali rappresentano la frazione di cellule ad alta intensità granulare citoplasmatica, misurata dal segnale SSC. Le barre di errore si riferiscono alle deviazioni standard con n = 6-8 / gruppo. Abbreviazioni: sHx = epatectomia standard; eHx = epatectomia estesa; senza resezione = chirurgia fittizia; FSC = segnale di dispersione diretta; SSC = dispersione laterale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Colorazione Sudan IV come marker del contenuto di grassi di epatociti freschi isolati. (A) Epatociti da un fegato di topo intero fresco senza previo intervento chirurgico. Aumento delle dimensioni e del contenuto di grasso degli epatociti 24 h (B) dopo 70%-epatectomia e (C) 86%-epatectomia. Si noti la presenza concomitante sia di epatociti steatosici più grandi che di epatociti non steatosici più piccoli. Barre di scala = 30 μm (B-D). Le barre di errore si riferiscono alle deviazioni standard con n = 6-8 / gruppo. Abbreviazioni: sHx = epatectomia standard; eHx = epatectomia estesa; senza resezione = chirurgia fittizia. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Una percentuale molto bassa di cellule immunitarie e non parenchimali rimane nella sospensione finale. Un'ulteriore purificazione è ottenuta da FACS o MACS, se lo si desidera. La selezione negativa delle cellule CD31+ e CD45+ mediante citometria a flusso viene utilizzata per dimostrare e quantificare le cellule non parenchimali (Figura 5).
Figura 5: Strategia di gating della citometria a flusso e selezione delle cellule parenchimali CD31- e CD45-. (A) Diagramma di gating con tutti gli eventi registrati; Considerare le dimensioni relativamente grandi degli epatociti e utilizzare tensioni regolate. Non andare oltre 350 V per FSC e 220 V per SSC. (B) Canottiera. (C) Gli epatociti sono selezionati mediante cellule CD31- (marcatore endoteliale) e CD45- (marcatore immunitario). Questa selezione può essere eseguita in un selezionatore cellulare attivato dalla fluorescenza per selezionare cellule parenchimali per ulteriori analisi a valle, se necessario; n = 4-5/gruppo. Abbreviazioni: FSC = forward scatter; SSC = dispersione laterale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Per dimostrare l'efficacia del protocollo modificato nel trattenere le cellule steatosiche, gli epatociti sono stati isolati utilizzando il classico approccio del gradiente di densità7 (Figura 9A). A differenza della procedura modificata (Figura 9B), uno strato di cellule adipose era chiaramente visibile al di sopra del gradiente di densità. L'analisi delle cellule ha confermato una grave assenza di epatociti carichi di lipidi nel pellet dopo centrifugazione a gradiente di densità. Al contrario, le cellule dello strato grasso sono state arricchite con epatociti steatosici e una frazione sostanziale di cellule non parenchimali e morte (Figura 9A). Pertanto, l'isolamento classico priva il prelievo di cellule steatotiche, mentre questo protocollo modificato che omette il gradiente di densità mantiene le sottopopolazioni cariche di lipidi, consentendo l'esplorazione imparziale della rigenerazione epatica senza inclinarsi verso epatociti magri.
Figura 9: Rese degli epatociti steatosici seguendo il classico protocollo di isolamento densità-gradiente rispetto al protocollo migliorato. (A) Con il classico metodo di purificazione densità-gradiente (concentrazione finale della soluzione a gradiente di densità al 90% in soluzione salina tamponata con fosfato), gli epatociti morti vengono raccolti in uno strato cellulare sopra la soluzione a gradiente di densità. (B) Questo strato non è costituito solo da cellule non parenchimali ed epatociti non vitali, ma anche da epatociti vitali, grandi e grassi. (C) Il pellet ottenuto in seguito a centrifugazione a gradiente di densità contiene epatociti magri di dimensioni inferiori ed è per lo più privo di cellule steatosiche. Questa è la frazione "pura" che viene isolata con il protocollo classico. (D) Con il protocollo migliorato, gli epatociti pieni di lipidi non vengono persi e tutti gli epatociti vengono pellettati. Il surnatante (E) è costituito principalmente da epatociti morti e frammentati e cellule non parenchimali, mentre il pellet (F) è una miscela di epatociti di dimensioni variabili e contenuto lipidico. Barre di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Fascicolo supplementare 1: Protocolli supplementari. (A) Colorazione dei lipidi con Sudan IV; (B) epatectomia standard ed estesa nei topi. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S1: Panoramica sulla configurazione della perfusione. (1) Cannulare la vena cava inferiore. (2) Perfondere il fegato con tampone di perfusione caldo per chelare il calcio. (3) Riscaldare il tampone di digestione con collagenasi e Ca2+ per dissociare le cellule in vivo. Rimuovere il fegato e (4) conservare in un tampone di conservazione ghiacciato (massimo 30 min). Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Impostazione della perfusione. (A) Tavola di perfusione con ugello di isoflurano, lampada riscaldante a luce rossa e tubo di perfusione. Un oggetto pesante può essere posizionato sotto il tubo per stabilizzarlo e ridurre il rischio di spostamento. (B) Durante i primi minuti della perfusione, un po 'di sangue defluirà attraverso la vena porta e si raggrupperà nella cavità addominale aperta. (C) La parete addominale è incisa su un lato per drenare il sangue. Un batuffolo di cotone facilita il drenaggio. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S3: capsula di Glisson. (A) La capsula di Glisson viene rotta con pinzette a punta fine in alcuni punti lungo la superficie del fegato e le cellule epatiche vengono rilasciate agitando delicatamente la capsula. (B) Il fegato dovrebbe lacerarsi facilmente. (C) Il sacco epatico vuoto (capsula di Glisson) con epatociti rilasciati in sospensione. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S4: Strategia di gating della citometria a flusso per lo screening di vitalità. (A) Tutti gli eventi sono stati registrati. (B) Canottiera. (C) Colorazione viva / morta con Alexa Fluor 488 Zombie colorante di vitalità verde. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S5: Strategia di gating della citometria a flusso per la misurazione della granularità. (A) Tutti gli eventi sono stati registrati. (B) Canottiera. (C) Dot plot della dispersione laterale (SSC; asse x ) rispetto allo scatter in avanti (FSC; asse y ) per analizzare i livelli di granularità. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S6: Purificazione degli epatociti. A) pellet cellulare dopo la prima fase di centrifugazione; Nota lo strato grasso sopra il mezzo. B) Pellet di epatociti dopo il secondo ciclo di centrifugazione. (C) Epatociti purificati al termine del processo di purificazione. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il protocollo pubblicato fornisce un metodo affidabile e diretto per isolare un'alta resa di epatociti murini normali e steatotici per analisi a valle a singola cellula o analisi di massa di cellule dopo la selezione FACS. Il netto vantaggio rispetto alla purificazione del gradiente di densità è che il contenuto lipidico cellulare non ha essenzialmente alcun impatto sulla resa effettiva degli epatociti. Pertanto, la frazione di epatociti steatosici sarà mantenuta e inclusa nelle analisi a valle. Questo non è solo cruciale per lo studio delle malattie epatiche steatogene, ma anche fondamentale per qualsiasi analisi dei processi a seguito di epatectomie maggiori, in cui gli epatociti mostrano una steatosi temporalmente e spazialmente dinamica entro i primi 2-3 giorni dalla rigenerazione. Anche se le analisi (unicellulari) di epatociti isolati sono già state eseguite dopo le epatotectomie 19,20,21, si deve presumere che la popolazione cellulare analizzata fosse, almeno parzialmente, priva di epatociti carichi di lipidi e i risultati, quindi, non erano pienamente rappresentativi e inclinati verso epatociti magri.
Attualmente, la funzione di TRAS non è completamente chiarita. Ad esempio, le differenze spaziali nel contenuto lipidico all'interno dei lobuli epatici rimangono poco comprese. Pertanto, è necessario un metodo che consenta la rilevazione quantitativa e qualitativa senza escludere precisamente queste cellule dalle analisi (ad esempio, per la trascrittomica a singola cellula, la citometria a flusso e la metabolomica).
Nel complesso, la resa degli epatociti con questo protocollo migliorato è marcatamente superiore rispetto ad altri metodi per l'isolamento di epatociti contenenti grasso (ad esempio, da topi con steatoepatite non alcolica, NASH) utilizzando la purificazione a gradiente di densità15. Tuttavia, la resa cellulare, la vitalità e il contenuto di grassi possono variare tra i preparati. Diversi fattori sembrano essere responsabili.
In primo luogo, diversi lotti di miscele di collagenasi o collagenasi varieranno nella loro attività enzimatica; Tuttavia, le differenze lot-to-lot non sono così critiche come con le collagenasi tradizionali. Tuttavia, può essere necessario regolare la concentrazione di lavoro. Le differenze possono essere ulteriormente minimizzate con una corretta conservazione fino all'uso (liofilizzati secchi e soluzioni madre reidratate a -15-25 °C) ed evitando cicli ripetitivi di gelo-scongelamento, ma non possono essere completamente eliminate. Pertanto, si raccomanda di utilizzare solo collagenasi di un lotto specifico per una determinata serie sperimentale. Inoltre, l'attività enzimatica dipende dalla temperatura alla quale il tampone di digestione raggiunge il fegato, con una temperatura ottimale tra 35 °C e 37 °C per una miscela di collagenasi I e II22. Temperature più basse riducono l'attività enzimatica, mentre temperature superiori a 50 °C possono portare a una denaturazione irreversibile della proteina. Testare questo in anticipo e ottimizzare le condizioni sperimentali regolando la temperatura iniziale del tampone di digestione, la lunghezza e il diametro del tubo di plastica e la velocità del flusso. Ad esempio, è prevedibile un calo della temperatura del tampone fino a 10 °C entro una lunghezza del tubo di 60 cm. Correggere la temperatura utilizzando cuscinetti riscaldanti e lampade a infrarossi, se necessario. Le collagenasi mostrano la loro capacità di digestione ottimale ad un pH di 7,4; pertanto, si consiglia di regolare il pH delle soluzioni tampone già ad una temperatura di esercizio di circa 37 °C prima dell'uso.
In secondo luogo, è fondamentale lavare sufficientemente il fegato (o l'intero topo) con tampone di perfusione prima di iniziare il processo di digestione per eliminare potenziali inibitori come il siero o l'albumina. Idealmente, la perfusione viene avviata solo dopo che la circolazione sistemica si è fermata, per garantire che il tampone di digestione si muova solo dalla vena cava attraverso il fegato fino al deflusso attraverso la vena porta aperta. La vena cava superiore può essere chiusa con un piccolo morsetto vascolare. Ciò impedisce il contatto con componenti / inibitori del sangue residui. Un altro metodo per lavare in modo ottimale il fegato è il bloccaggio intermittente della vena porta. Questo dovrebbe essere fatto con attenzione e - una volta che il tampone di digestione ha raggiunto il fegato - eseguito solo una volta per evitare di danneggiare le cellule già digerite.
In terzo luogo, gli epatociti rigeneranti sono sensibili e l'esperienza ha dimostrato che richiedono tempi di digestione più brevi e una gestione più attenta per evitare un'eccessiva digestione e danni alle cellule. Per raccogliere il fegato il più delicatamente possibile, si consiglia di afferrare l'ilo epatico con un morsetto e quindi, prima tagliare la vena cava superiore e liberare il fegato dalle connessioni alla vena e al diaframma. Successivamente, la vena cava inferiore e la vena porta possono essere tagliate, il che consente la mobilizzazione del fegato e lo libera facilmente dai legamenti gastrointestinali, dall'esofago da un lato e dal rene destro dall'altro lato. Nei topi epatectomizzati, è possibile afferrare attentamente una delle legature dai lobi mediani per rimuovere il fegato. Se si tenta di estrarre il fegato con la forza, la capsula di Glisson può rompersi e le cellule isolate potrebbero perdersi.
Infine, è essenziale che la procedura di perfusione e l'ulteriore elaborazione degli epatociti non vengano interrotte o ritardate, poiché ciò influenzerà immediatamente e inevitabilmente la vitalità. Idealmente, la perfusione viene eseguita in una squadra di almeno due persone e su un animale alla volta. Questi requisiti in termini di tempo e manodopera, tuttavia, sono uno dei limiti di questo metodo, sebbene ciò valga anche per i metodi alternativi.
Un'altra limitazione è la purezza finale della sospensione cellulare risultante, poiché il vantaggio di non perdere epatociti steatosici in un gradiente di densità si traduce in una piccola percentuale di cellule rimanenti non parenchimali e / o immunitarie. Nel campione mostrato, la frazione di CD45+ (cellule immunitarie) e CD31+ (cellule endoteliali) è inferiore al 5% e, quando si seleziona per la dimensione della cellula prima durante la citometria a flusso, le percentuali di CD45+ e CD31+ sono rispettivamente dell'1,2% e del 2,2% (Figura 5). Per la maggior parte delle applicazioni, questo livello di purezza è sufficiente, ma i metodi altamente sensibili o l'ulteriore utilizzo in colture cellulari primarie richiedono probabilmente un grado più elevato. Numerosi studi hanno utilizzato CD31 e CD45 come marcatori sistemici per ordinare le popolazioni di cellule epatiche in base a MACS 23,24 o FACS25.
Questo metodo di isolamento migliorato è ideale per lo studio della rigenerazione epatica, in particolare il periodo precoce che si presenta con quantità significative di epatociti steatosici. La PHLF, caratterizzata da steatosi persistente, è un argomento particolarmente rilevante che richiede ricerca. A seguito di epatectomie estese che lasciano resti marginali, PHLF può svilupparsi e rappresenta la causa più comune di morte a causa di chirurgia epatica. La sua patobiologia è solo parzialmente compresa, e attualmente non è disponibile alcun trattamento26. Dato che PHLF limita significativamente l'applicazione della chirurgia epatica (come per la cura delle neoplasie epatiche), esplorare le sue cause e identificare potenziali misure è una chiara necessità medica.
Esiste anche la necessità di studiare le malattie che condividono la steatosi epatica come punto di partenza. Un esempio importante è la steatosi epatica non alcolica (NAFLD), che può progredire verso la NASH e infine verso il carcinoma epatocellulare (HCC)27. La diffusione di stili di vita sedentari in combinazione con la dieta occidentale ha portato a un'epidemia mondiale di NAFLD e, di conseguenza, si prevede che l'incidenza dell'HCC aumenteràdi 28,29. La steatosi, a sua volta, è anche strettamente legata all'obesità, alla sindrome metabolica e al diabete di tipo 2, tutte malattie con un'incidenza crescente30. Pertanto, la steatosi rappresenta un onere crescente per l'attuale sistema sanitario, che richiede mezzi efficaci per la sua gestione. Questo metodo migliorato di perfusione della collagenasi in due fasi consente lo studio degli epatociti steatosici a livello di singola cellula, e quindi dovrebbe aiutare ad esplorare le cause e le conseguenze dell'accumulo lipidico epatocellulare.
Questo protocollo presenta una tecnica facile, veloce e affidabile per l'isolamento in vivo di epatociti rigeneranti da topi dopo epatectomia parziale (70%) ed estesa (86%). Questo approccio non si basa sulla purificazione del gradiente e può essere utilizzato per studiare i processi di rigenerazione epatica con l'inclusione di epatociti carichi di lipidi che di solito vengono persi durante i protocolli di isolamento tradizionali. Inoltre, questo metodo può essere applicato anche per la ricerca di varie malattie del fegato associate a cambiamenti steatotici e non è limitato alle specie di topo.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero (sovvenzione 310030_189262).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | - |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | - |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | - |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | - |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | - |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | - |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | - |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | - |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | - |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | - |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | - | - |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | - |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | - |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | - |
| Fenestrated sterile surgical drape | - | - | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | - |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | - |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | - | - |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | - |
| Isofluran station | Provet | - | - |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | - | - |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | - | - |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | - |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | - |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | - | - |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | - | - |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | - |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | - | Adjust to 42 °C |
References
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