Summary
نقدم هنا طريقة غير وراثية لتوليد كرويات كبدية ذاتية بشرية باستخدام خلايا أحادية النواة معزولة من الدم المحيطي المستقر.
Abstract
يمكن أن تشكل خلايا الكبد البشرية بنية ثلاثية الأبعاد (3D) قادرة على النمو في الثقافة لعدة أسابيع ، والحفاظ على قدرتها الوظيفية. نظرا لطبيعتها في التجمع في أطباق الاستزراع ذات الخصائص اللاصقة المنخفضة أو المعدومة ، فإنها تشكل تجمعات من خلايا الكبد المتعددة التي تسمى كرويات الكبد البشري. يعتمد تكوين كرويات الكبد 3D على الميل الطبيعي للخلايا الكبدية للتجمع في غياب ركيزة لاصقة. هذه الهياكل 3D تمتلك استجابات فسيولوجية أفضل من الخلايا ، والتي هي أقرب إلى بيئة في الجسم الحي . استخدام ثقافات خلايا الكبد 3D له مزايا عديدة عند مقارنته بالثقافات الكلاسيكية ثنائية الأبعاد (2D) ، بما في ذلك بيئة دقيقة أكثر صلة بيولوجيا ، ومورفولوجيا معمارية تعيد تجميع الأعضاء الطبيعية بالإضافة إلى تنبؤ أفضل فيما يتعلق بحالة المرض وفي استجابات شبيهة بالجسم الحي للأدوية. يمكن استخدام مصادر مختلفة لتوليد كرويات ، مثل أنسجة الكبد الأولية أو خطوط الخلايا الخالدة. يمكن أيضا هندسة أنسجة الكبد 3D باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) لاشتقاق خلايا الكبد. لقد حصلنا على كرويات الكبد البشري باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم (BD-PSCs) المتولدة من الدم المحيطي غير المعالج عن طريق تنشيط البروتين المرتبط بغشاء الإنسان المرتبط ب GPI والمتمايز إلى خلايا الكبد البشرية. تم تحليل خلايا الكبد البشرية المشتقة من BD-PSCs وكرويات الكبد البشري عن طريق الفحص المجهري الضوئي والتنميط المناعي باستخدام علامات خلايا الكبد البشرية.
Introduction
في السنوات الأخيرة ، أصبحت أنظمة الاستزراع الكروي ثلاثية الأبعاد (3D) أداة مهمة لدراسة مختلف مجالات أبحاث السرطان واكتشاف الأدوية وعلم السموم. تثير هذه الثقافات اهتماما كبيرا لأنها تسد الفجوة بين أحاديات زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) والأعضاء المعقدة1.
في حالة عدم وجود سطح لاصق ، مقارنة بثقافة الخلايا 2D ، يعتمد تكوين الكائنات الكروية على التقارب الطبيعي لهذه الخلايا للتجمع في شكل 3D. تنظم هذه الخلايا نفسها في مجموعات تتكون من نوع واحد أو أكثر من الخلايا الناضجة. خالية من المواد الغريبة ، تتفاعل هذه الخلايا مع بعضها البعض كما هو الحال في بيئتها المكروية الأصلية. الخلايا في ثقافة 3D أقرب بكثير ولها اتجاه مناسب تجاه بعضها البعض ، مع إنتاج مصفوفة خارج الخلية أعلى من الثقافات ثنائية الأبعاد ، وتشكل بيئة قريبة من البيئة الطبيعية 2.
تم استخدام النماذج الحيوانية لفترة طويلة لدراسة البيولوجيا البشرية والأمراض3. في هذا الصدد ، هناك اختلافات جوهرية بين البشر والحيوانات ، مما يجعل هذه النماذج غير مناسبة تماما للدراسات الاستقراءية. تمثل كرويات الثقافة ثلاثية الأبعاد والكائنات العضوية أداة واعدة لدراسة البنية الشبيهة بالأنسجة والتفاعل والحديث المتبادل بين أنواع الخلايا المختلفة التي تحدث في الجسم الحي ويمكن أن تساهم في تقليل أو حتى استبدال النماذج الحيوانية. فهي ذات أهمية خاصة لدراسة التسبب في أمراض الكبد وكذلك منصات فحص المخدرات4.
تعتبر ثقافة كروية 3D ذات أهمية خاصة لأبحاث السرطان لأنها يمكن أن تقضي على الانقطاع بين الخلايا وبيئتها عن طريق تقليل الحاجة إلى علاج التربسين أو كولاجيناز اللازم لإعداد أحاديات الخلايا السرطانية لثقافات 2D. تمكن الأجسام الكروية للورم من دراسة كيفية تلقي الخلايا الطبيعية مقابل الخلايا الخبيثة للإشارات من محيطهاوالاستجابة لها 5 وهي جزء مهم من دراسات بيولوجيا الورم.
بالمقارنة مع monolayer ، تشبه ثقافات 3D التي تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا أنسجة الورم في خصائصها الهيكلية والوظيفية ، وبالتالي فهي مناسبة لدراسة ورم خبيث وغزو الخلايا السرطانية. هذا هو السبب في أن هذه النماذج الكروية تساهم في تسريع أبحاث السرطان6.
تساعد الكائنات الكروية أيضا في تطوير التكنولوجيا اللازمة لإنشاء عضويات بشرية لأن بيولوجيا الأنسجة والأعضاء صعبة للغاية للدراسة ، خاصة في البشر. التقدم في زراعة الخلايا الجذعية يجعل من الممكن تطوير ثقافات 3D مثل المواد العضوية التي تتكون من الخلايا الجذعية وأسلاف الأنسجة وكذلك أنواع مختلفة من الخلايا الناضجة (الأنسجة) من عضو مع بعض الخصائص الوظيفية مثل العضو الحقيقي الذي يمكن استخدامه لنمذجة تطور الأعضاء والأمراض ، ولكن يمكن اعتبارها أيضا مفيدة في الطب التجديدي7.
عادة ما تستخدم خلايا الكبد البشرية الأولية لدراسة البيولوجيا المختبرية لخلايا الكبد البشرية ، ووظائف الكبد ، والسمية التي يسببها الدواء. ثقافات خلايا الكبد البشرية لها عيبان رئيسيان ، أولا ، التوافر المحدود للأنسجة الأولية مثل خلايا الكبد البشرية ، وثانيا ، ميل خلايا الكبد إلى عدم التمايز بسرعة في ثقافة 2D وبالتالي فقدان وظيفة خلايا الكبد المحددة8. الثقافات الكبدية 3D متفوقة في هذا الصدد وقد تم تصنيعها مؤخرا من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المتمايزة (hESCs) أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) 9. تعتبر كرويات 3D الكبدية المهندسة بيولوجيا ذات أهمية خاصة لدراسة التطور والسمية والأمراض الوراثية والمعدية للكبد ، وكذلك في اكتشاف الأدوية لعلاج أمراض الكبد10. أخيرا ، لديهم أيضا إمكانية استخدامها سريريا ، مع العلم أن أمراض الكبد الحادة لها معدل وفيات يقارب 80٪ ، والكبد الاصطناعي الحيوي و / أو كرويات الكبد يمكن أن تنقذ هؤلاء المرضى من خلال توفير وظائف الكبد الجزئية حتى يمكن العثور على متبرع مناسب11.
لقد أنشأنا بروتوكولا لتوليد كرويات كبدية بشرية باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم (BD-PSCs) لإعداد كرويات مختلفة الحجم تحتوي على 4000 إلى 1 × 106 خلايا وتحليلها عن طريق الفحص المجهري الضوئي والتألق المناعي. اختبرنا أيضا قدرة الوظيفة الخاصة بخلايا الكبد ، وتقييم تعبير إنزيمات السيتوكروم P450 3A4 (CYP3A4) و 2E1 (CYP2E1) التي تنتمي إلى عائلة السيتوكروم P450 التي لها أدوار مهمة في التمثيل الغذائي الخلوي والدواء من خلال عملية إزالة السموم12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على الموافقة الأخلاقية (ACA CELL Biotech GmbH / 25b-5482.2-64-1) لإجراء هذه التجارب وتم توقيع الموافقة المستنيرة من قبل جميع المتبرعين قبل استخراج الدم وفقا للإرشادات المؤسسية.
1. تحضير الخلايا أحادية النواة (MNCs) من الدم المحيطي البشري (PB)
- استخراج 30 مل من الدم من المتبرعين الأصحاء بمساعدة الطاقم الطبي المدربين وفقا للبروتوكول القياسي.
- عزل PBMNCs باستخدام وسائط تدرج الكثافة وفقا للبروتوكول الذي نشره Becker-Kojić et al.13. عزل طبقة الطور البيني بين البلازما ووسائط تدرج الكثافة عن طريق السحب واستخدام محلول ملحي عازل للفوسفات معقم (PBS) لغسل الخلايا المعزولة.
- استخدم غرفة العد واحسب عدد الخلايا باستخدام الطرق القياسية.
2. إلغاء تمايز الشركات متعددة الجنسيات عند التنشيط باستخدام البروتين السكري البشري المرتبط ب GPI
- ضع 6 × 106 خلايا أحادية النواة في PBS / 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) في أنبوب بوليسترين (15 مل) واحتضانها مع الجسم المضاد المحدد لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية وفقا لبيكر كوجيتش وآخرون 13.
- قم بطرد الخلايا عند 300 × جم في درجة حرارة الغرفة واستبدل PBS / BSA بوسط Dulbecco المعدل من Iscove المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS).
- تنمو الخلايا في أنابيب البوليسترين 15 مل في حاضنة CO2 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 8-10 أيام كما هو موضح في Becker-Kojić et al.13. في اليوم الخامس (D5) ، أضف 1-2 مل من وسط Iscove المكمل ب 10٪ FBS لكل أنبوب سعة 15 مل.
3. فرز الخلايا غير المتمايزة التي تم إنشاؤها حديثا
- معلق خلية مستزرع بالطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 300 × جم ونضح باستخدام ماصة معقمة المادة الطافية الناتجة وفقا لبيكر كوجيتش وآخرون 13.
- إعادة تعليق الحبيبات التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي في 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS البارد (PBS pH 7.2 و 0.5٪ BSA و 2 mM EDTA) وإضافة 10 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي الموجب بحجم النانو CD45 واحتضانها على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- اغسل تعليق الخلية ب 2 مل من المخزن المؤقت PBS ، وطرده مركزيا عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وأضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS إلى الخلايا وأعد تعليقه جيدا.
- ماصة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS المبرد مسبقا في العمود لغسله ووضعه في المجال المغناطيسي باستخدام حامل مغناطيسي.
- اغسل الخلايا الموضوعة على العمود ، مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS واجمع التدفق الذي يحتوي على الخلايا السالبة CD45 في وسط Iscove المكمل ب 10٪ FBS.
- استخدم غرفة العد لتحديد عدد الخلايا المعاد برمجتها.
4. إعداد أغطية زجاجية لتوليد خلايا الكبد البشرية
- افصل أغطية زجاجية (14 مم) واحتضنها في منظف غير أيوني لمدة 10 دقائق. اغسل أغطية الزجاج في ماء منزوع الأيونات حتى لا تبقى فقاعات واحتضانها في 1M HCl لمدة 30 دقيقة (مقتبس من Marchenko et al.14).
- اغسل أغطية الزجاج بالماء منزوع الأيونات 3x على الأقل وجففها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. أغطية الزجاج المجفف الأوتوكلاف في حاوية مناسبة.
5. طلاء لوحات زراعة الخلايا مع biolaminin للتمايز الكبدي 2D من BD-PSCs
- ضع أغطية زجاجية معقمة مع زوج معقم من الملقط في 4 ألواح بئر وقم بتشغيل مصابيح الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة لضمان ظروف معقمة.
- قم بإذابة حصص البيولامينين وأضف 120 ميكرولتر من 5 ميكروغرام / مل بيولامينين إلى كل زلة غطاء زجاجي. اترك أغطية الزجاج المطلي طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- إزالة فائض البيولامينين وإضافة 200 ميكرولتر من وسط تمايز خلايا الكبد كما هو موضح أدناه.
6. إعداد وسائط تمايز خلايا الكبد
- اصنع 500 مل من وسط استبدال مصل خروج المغلوب في البلاستيدات الكبدية (KSR) / ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) يتكون من 76.4٪ ضربة قاضية DMEM (KO-DMEM) ، 20٪ KSR ، 0.5٪ L-glutamine ، 1٪ أحماض أمينية غير أساسية (NEAA) ، 0.1٪ β-mercaptoethanol ، 1٪ DMSO ، و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين (قلم / بكتيريا العقدية).
- تحضير 500 مل من وسط نضج خلايا الكبد يحتوي على 1٪ L-glutamine ، 10 μM هيدروكورتيزون 21-هيميسوتشينات ملح الصوديوم (HCC) ، و 1٪ قلم / بكتيريا .
- وسط القسمة من المخزون وإضافة عامل نمو خلايا الكبد الطازجة (HGF) و oncostatin M (OSM) بتركيزات نهائية تبلغ 10 نانوغرام / مل و / أو 20 نانوغرام / مل لكل تغيير متوسط.
ملاحظة: Oncostatin M هو سيتوكين ينتمي إلى مجموعة السيتوكينات interleukin 6 ، وهو مهم لتكوين الدم وكذلك لنمو الكبد.
7. زراعة الخلايا الكبدية المتمايزة عن BD-PSCs
- ضع 3 × 105 خلايا BD-PSCS في كل بئر من صفيحة 4 آبار مغلفة بالبولامينين.
- ضع ألواح 4 آبار في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. استزرع الخلايا لمدة 5 أيام في وسط KSR / DMSO الكبدي الذي يدعم تمايز الأديم الباطن وتغيير الوسط كل يومين.
- قم بالتبديل إلى وسط نضوج خلايا الكبد في اليوم الخامس واستزرع الخلايا لمدة 7-10 أيام إضافية في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. تغيير الوسيط كل 48 ساعة.
8.3D التمايز الكبدي الكروي
- عد الخلايا باستخدام غرفة العد.
- تعليق خلية غير متمايزة BD للطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة الخلايا الطافية وإعادة تعليق الخلايا غير المتمايزة BD في وسط KSR / DMSO عند 2 × 106 خلايا / مل.
- مرر الخلايا من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر لضمان تعليق خلية واحدة وإزالة أي حطام إضافي.
- عد الخلايا باستخدام غرفة العد وقم بإعداد حجم كاف لكل كثافة بذر خلية من أجل توزيع الحجم المطلوب لكل بئر. قم بإعداد تدرج مع البذر العلوي من 1 × 106 خلايا إلى كثافة بذر منخفضة تبلغ 4000 خلية.
- قم بتوزيع 100 ميكرولتر من وسط KSR / DMSO في 96 لوحة ربط منخفضة جيدا وأضف 100 ميكرولتر من تخفيف بذر الخلايا.
- ضع لوحة ربط منخفضة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 واستزراعها لمدة 5 أيام.
- تغيير 50 ٪ من الوسط من أيام 3-4 بعد البذر عندما تكون الكرويات مضغوطة بما فيه الكفاية.
- في اليوم 5 ، قم بتغيير الوسط إلى وسط نضج خلايا الكبد واستزرع الخلايا لمدة 7-10 أيام إضافية لمزيد من النضج. تغيير الوسيط كل يومين.
9. تحليل التألق المناعي لثقافات خلايا الكبد 2D المولدة حديثا
- قم بزراعة الخلايا وفقا لطريقة التمايز الموضحة أعلاه لمدة 4 و 8 و 15 و 24 يوما وإزالة الوسائط.
- احتضان الخلايا مع مثبت قبل التسخين يتكون من 4 ٪ بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق. تخلص من المثبت واغسل الخلايا 2x باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منها. أضف على الفور محلول 0.1٪ triton X-100 وتخلل الخلايا لمدة 5 دقائق. اغسل 2x مع برنامج تلفزيوني.
- أضف محلول حظر مصنوع من PBS و 5٪ BSA وضعه على لوحة متأرجحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت للتخفيف 1٪ BSA / PBS على النحو التالي: الألبومين (ALB) 1:50 ، ألفا -1 فيتوبروتين (AFP) 1: 250 ، السيتوكيراتين 18 (CK18) 1:50 ، العامل النووي لخلايا الكبد 4 ألفا (HNF4α) 1: 1000 وترانسثيريتين (TTR) 1:50. استخدم 50 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة لكل بئر.
- احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. ثم تخلص من محلول الأجسام المضادة ، واغسل الخلايا لمدة 5 دقائق ، وكرر خطوة الغسيل 3x.
- قم بإعداد الأجسام المضادة الثانوية التالية في محلول التخفيف: أرنب مضاد للدجاج IgG (أحمر تكساس) 1: 1000 ، الماعز المضاد للفأر IgG (488) 1: 1000 ، والماعز المضاد للأرانب (488) 1: 500. استخدم 50 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة لكل بئر واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل الخلايا 3x باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منها وقم بتركيب أغطية الغطاء بوسائط تثبيت تحتوي على DAPI للتحليل المجهري.
10. تلطيخ حي من كرويات الكبد المشكلة حديثا
- تخلص بعناية من وسائط الاستزراع مع عدم لمس الكائنات الكروية ، وأضف برنامج تلفزيوني طازج بمحلول 0.1٪ triton X-100 ، واحتضانه لمدة 5 دقائق لاختراق الخلايا.
- اغسل الكرويات بالوسط عن طريق سحب الخصمة ببطء لمدة 5 دقائق ، كرر 2x.
- احتضان الأجسام الكروية بالأجسام المضادة الأولية ALB (1:50) و AFP (1:250) و CK18 (1:50) و CYP2E1 (1:200) و CYP3A4 (1: 200) المحضرة في PBS مع 1٪ BSA لمدة ساعة واحدة في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. استخدم 50 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة لكل بئر.
- قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الزائد بعناية وغسل الأجسام الكروية بمتوسط 3x.
- قم بإعداد الأجسام المضادة الثانوية المقابلة للماعز المضاد للفأر IgG (Cy3) ، والماعز المضاد للفأر IgG (488) ، والأرانب المضادة للدجاج IgG (تكساس الأحمر) بتخفيف 1: 1000 و 1: 500 للماعز المضاد للأرانب (488) في PBS في 1٪ BSA. استخدم 50 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة لكل بئر واحتضانها لمدة 20 دقيقة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- اغسل بعناية 3x بمتوسط واترك اللوحة لمدة 30 دقيقة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 قبل إجراء الفحص المجهري الفلوري.
11. فحص الأجسام الكروية باستخدام المجهر الفلوري
- قم بتشغيل مصدر الضوء الفلوري قبل 10 دقائق من الاستخدام ، وقم بتشغيل الكمبيوتر وافتح برنامج التصوير.
- استخدم هدفا بتكبير 4x ، وانقر فوق الزر 4x في شريط الأدوات لتحديد شريط المقياس الصحيح ، ثم ضع لوحة 96 بئرا على لوحة مركز المسرح.
- قم بتشغيل مصدر ضوء LED ، واستخدم مرشح برايت فيلد ، وضع اللوحة في البئر محل الاهتمام باستخدام مقبض ضبط مرحلة المحور x-y.
- قم بالتغيير إلى مسار ضوء الكاميرا ، وانقر فوق الزر Live in Imaging Software لتصور الصورة على الشاشة ، وتأكد من توسيط الكرة الأرضية باستخدام مقابض المحور x-y والتركيز باستخدام مقبض التركيز الخشن / الدقيق.
ملاحظة: يظل شكل الأجسام الكروية ثابتا بعد تطبيق التلوين الحي. - اختر طريقة Brightfield Observation في شريط الأدوات ، واضبط إعدادات التعريض الضوئي على تلقائي ، وانقر فوق الزر لقطة في لوحة تحكم الكاميرا لالتقاط صورة. ثم احفظ الصورة كملف .vsi باستخدام الاسم المناسب في مجلد الاهتمام.
- ضع لوحة حماية الإضاءة المحيطة لإيقاف تشغيل ضوء LED ، وقم بالتغيير لتصفية الإثارة B ، واختر طريقة المراقبة 488 في شريط الأدوات ، وافتح الغالق ، والتقط صورة بالنقر فوق الزر لقطة ، وأغلق الغالق ، ثم احفظ الملف كما هو موضح أعلاه.
- كرر هذا باستخدام مرشح لإثارة G باستخدام طريقة المراقبة المناسبة (تكساس الأحمر أو CY3). ثم كرر الإجراء بأكمله لكل بئر من الاهتمام.
- أعد اللوحة إلى حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية واستزرعها كما هو موضح أعلاه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لقد نجحنا في تمييز BD-PSCs البشرية إلى خلايا سلف الأديم الباطن / الكبدي وخلايا الكبد من خلال تطبيق بروتوكول من خطوتين. يوضح الشكل 1 التغيرات المورفولوجية أثناء عملية التمايز الكبدي. تتمايز BD-PSCs إلى خلايا كبدية تمر بثلاث مراحل مختلفة. تمثل المرحلة الأولى التمايز إلى خلايا الأديم الباطن L4 ، والثانية ، التمايز إلى الخلايا السلفية الكبدية (الأرومة الكبدية) L8 ، والتي تظهر مورفولوجيا متعددة الأضلاع نموذجية ، والثالثة ، النضج إلى خلايا الكبد L15-L24.
تم إجراء تحليل التألق المناعي لتأكيد التمايز الكبدي ل BD-PSCs كما هو موضح في الشكل 2. تعبير قوي عن الأديم الباطن / علامة سلف الكبد البشري ، مثل ألفا فيتوبروتين (AFP) ، وهو بروتين بلازما رئيسي في مصل الجنين يكون تركيزه منخفضا جدا في الكائنات الحية البالغة ، وبالتالي يعتبر علامة على سلائف خلايا الكبد15 وترانسثيريتين (TTR) ، وهو بروتين رئيسي مرتبط بهرمون الغدة الدرقية يشارك في نقل هرمون الغدة الدرقية من مجرى الدم إلى الدماغ16 في الخلايا في المرحلة الأولى من عملية التمايز الكبدي عند L4 إلى L8. ومع ذلك ، ينخفض تعبيرها عند L15 ، في حين أن التعبير عن الألبومين (ALB) ، وهو بروتين البلازما الأكثر وفرة الذي ينتجه الكبد بشكل رئيسي وحرج تماما للتمايز الكبدي ، وكذلك العامل النووي لخلايا الكبد 4 ألفا (HNF-4α) ، وهو عامل نسخ خلايا الكبد الذي يشارك في التعبير عن الجينات الخاصة بالكبد17 يظهر أولا في L4 ، يرتفع طوال وقت التمايز L4-L15 ليصل إلى تعبير قوي ومستقر خلال وقت النضج L15-L24.
Cytokeratin 18 (CK18) هو بروتين هيكلي خلوي ، أحد المكونات الرئيسية للخيوط الوسيطة المعبر عنها في الكبد18. تظهر النتائج أنه ، كما هو متوقع ، يرتبط تعبير CK18 بخلايا الكبد الناضجة (L15-L24) ، ولا يتم التعبير عنه في الخلايا السلفية لخلايا الكبد.
بروتوكول محدد جيدا لتمايز خلايا الكبد في الثقافات 2D تمكن من هندسة الثقافات 3D الكبدية بدءا من BD-PSCs.
نوضح هنا أن التجمع التلقائي لهذه الخلايا في صفائح منخفضة التعلق تحتوي على وسط تحريض / نضج خلايا الكبد يبدأ تكوين كروي. تبع مسار النمو خلايا التصوير في L2 و L4 و L7. (الشكل 3 أ) هناك علاقة ثابتة بين حجم الكرة والعدد المتغير للخلايا ، كما هو موضح في الشكل 3B.
الكبد هو العضو الذي يتم فيه استقلاب معظم الأدوية في جسم الإنسان. السيتوكروم P450 هو فصيلة فائقة من الإنزيمات (أحادي الأكسجيناز) ذات أهمية محورية في عمليات التمثيل الغذائي للأدوية والخلايا ، وإزالة السموم من الكائنات الحيوية الأجنبية ، والتوازن. لتقييم النشاط الوظيفي المحتمل للكرويات الكبدية المشتقة من BD-PSCs ، قمنا بتحليل التعبير عن إنزيمات استقلاب الدواء مثل CYP3A4 و CYP2E1 ، أعضاء عائلات CYP3 و CYP219.
يتم استقلاب معظم الأدوية المستخدمة اليوم بما في ذلك الكوديين والسيكلوسبورين أ والإريثروميسين والأسيتامينوفين والديازيبام بالإضافة إلى العديد من المنشطات والمواد المسرطنة بسبب نشاط إنزيم CY3A420. يشارك CYP2E1 في عملية التمثيل الغذائي للركائز الداخلية مثل جلايكول الإيثيلين والبنزين ورابع كلوريد الكربون ، وخاصة أهم مركب شديد الطفرات مثل النيتروزامين21.
تكشف الأجسام الكروية التي تتشكل وتتمايز وفقا للبروتوكول الموجود في D14 ، والتي تعيش ملطخة بالأجسام المضادة لهذين الإنزيمين ، عن النشاط الوظيفي الكبدي المحتمل للكرويات المشتقة من BD-PSCs (الشكل 4).
الشكل 1: تمايز BD-PSCs إلى خلايا شبيهة بالكبد. صور مجهرية تمثيلية للتغيرات المورفولوجية خلال التمايز الكبدي ل BD-PSCs تظهر مورفولوجيا الأديم الباطن L4 ، أو الشكل المضلع L8 الذي وصل أخيرا إلى حالة النضج عند L15 إلى L24. قضبان المقياس: الصف العلوي 50 ميكرومتر ، الصف السفلي 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تحليل التألق المناعي لإعادة تمايز BD-PSCs نحو الخلايا الكبدية. يتم التعبير عن الأديم الباطن / خلايا الكبد السلف وعلامات محددة لخلايا الكبد أثناء تمايز الكبد من BD-PSCs في الثقافات 2D. في الأيام من L4 إلى L8 ، تظهر الصور المجهرية انخفاضا في تعبير الأديم الباطن / السلف الكبدي AFP و TTR بينما اختفى تعبيرها من L8-L24. ينشأ التعبير عن علامات خلايا الكبد ALB و HNFα عند L4 ويزداد أثناء النضج ، في حين ظهر تعبير CK18 أولا في L15 ، ليصل إلى الحد الأقصى عند L24. أشرطة المقياس للرسوم البيانية L4-L15: 50 ميكرومتر و L24: 20 ميكرومتر. يتم عرض التحكم في الشكل التكميلي 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تكوين كرويات ثلاثية الأبعاد عند التمايز الكبدي ل BD-PSCs. (أ) تم زرع أعداد الخلايا المتغيرة من خلايا BD-PSCs بدءا من 1 × 10 من 6 إلى 4000 خلية في ألواح منخفضة التعلق ، وتم إجراء التمايز وفقا للإجراء المكونمن مرحلتين كما هو مذكور في البروتوكول. تم تصوير جيل كرويات الكبد البشري 3D في نقاط زمنية مختلفة ، وتظهر صور تباين المرحلة التمثيلية في كل مرة خلال الفترة الزمنية للثقافة. شريط المقياس: 200 ميكرومتر. (ب) تم قياس أقطار ما لا يقل عن 4 كرويات كبدية لكل حجم عند L4 باستخدام برنامج التصوير المجهري وتم حساب الأحجام. تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: يتم التعبير عن العلامات الوظيفية للخلايا الكبدية في كرويات الكبد المشتقة من BD-PSCs. تم تمييز BD-PSCs إلى خلايا الكبد. تم إجراء تحليل التألق المناعي المباشر على الخلايا الحية في L14 باستخدام الأجسام المضادة ل ALB و AFP و CK18 و CYP2E1 و CYP3A4 ، أعضاء عائلة السيتوكروم P450. شريط المقياس: 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل التكميلي 1: التحكم السلبي لتحليل التألق المناعي لإعادة تمايز BD-PSCs نحو الخلايا الكبدية. يتم التعبير عن الأديم الباطن / خلايا الكبد السلف وعلامات محددة لخلايا الكبد أثناء تمايز الكبد من BD-PSCs في الثقافات 2D. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الكبد هو عضو رئيسي في جسم الإنسان له العديد من الوظائف البيولوجية الأساسية ، مثل إزالة السموم من الأيضات. بسبب فشل الكبد الحاد مثل تليف الكبد و / أو التهاب الكبد الفيروسي ، هناك ما يقرب من 2 مليون حالة وفاة سنويا في جميع أنحاء العالم. تحتل عمليات زرع الكبد المرتبة الثانية في عمليات زرع الأعضاء الصلبة في جميع أنحاء العالم ، ولكن يتم تلبية حوالي 10٪ فقط من الحاجة الحالية22.
غالبا ما تستخدم خلايا الكبد البشرية الأولية (PHH) لدراسة سمية الكبد. يمكن الحفاظ على هذه الخلايا في الثقافة لفترة قصيرة مع الاحتفاظ بوظائفها المحددة. أيضا ، عدد الخلايا المتاحة من متبرع واحد محدود ، بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن توسيع هذه الخلايا في الثقافة ، وبالتالي ، فإن النقص في PHH المانحة لا يزال العقبة الرئيسية أمام دراسات السمية الكبدية. تمثل PSCs مصدرا متجددا للأنسجة البشرية ويمكن استخدامها لتوليد الثقافات الكبدية ثلاثية الأبعاد11.
تظهر أنظمة زراعة الكبد 3D مزايا متعددة عند مقارنتها ب 2D. يتيح وقت التمايز الأقصر والمحاكاة الدقيقة للعمليات في الجسم الحي إجراء دراسات أكثر دقة حول السمية التي يسببها الدواء ، والتنبؤ بشكل أفضل بمسؤولية الكبد ، وهي أكثر فعالية من حيث التكلفة23. يمكن أن تكون مزارع الكبد الكروية بسبب ميزتها الذاتية ميزة كبيرة على خلايا الكبد البشرية الأولية (PHH) التي تتحايل على العيوب المتعلقة باستخدامها وقد تصبح معيارا ذهبيا للتطبيق في اختبار سمية الدواء ولها تطبيق مستقبلي محتمل في الطب التجديدي.
لقد أثبتنا هنا أن BD-PSCs المتولدة من الدم المحيطي في الحالة المستقرة يمكن تمييزها بنجاح إلى أسلاف الأدمة الداخلية / خلايا الكبد / خلايا الكبد الناضجة مع إفراز ثابت للألبومين واستقرار النمط الظاهري الذي يعبر عن علامات خلايا الكبد. علاوة على ذلك ، تظهر الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد لخلايا الكبد البشرية ثلاثية الأبعاد النشاط الوظيفي المحتمل من خلال التعبير عن الإنزيمات التي تنتمي إلى السيتوكروم P450 ، مثل CYP3A4 و CYP2E1.
الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هي الحصول على نوعية جيدة وعدد من الشركات متعددة الجنسيات البشرية الجديدة لعملية إعادة البرمجة. يؤدي استخدام الشركات متعددة الجنسيات المجمدة إلى تقليل عدد الخلايا المعاد برمجتها.
لقد قمنا بتصميم كرويات الكبد البشري باستخدام مزارع PBMNCs المنشطة مع وبدون تطبيق الفرز المغناطيسي المناعي الذي يفصل الخلايا المعاد برمجتها عن خلايا الدم الناضجة. يعتمد الاختلاف الطفيف في استخدام هاتين الطريقتين على الكثافة العالية لهيكل 3D عند استخدام الخلايا المعاد برمجتها المنقى. يظل التعبير عن علامات خلايا الكبد ثابتا في كل من مستحضرات زراعة الخلايا.
نظرا لمحدودية توافر PHH ، من المحتمل أن تمثل الطريقة أقرب بديل ذي صلة بيولوجيا لخلايا الكبد الطازجة الذاتية لدراسة الوظيفة الكبدية في المختبر ، مثل التمثيل الغذائي الغريبي وسمية الكبد ، والتدخل الممرض المضيف ، وبيولوجيا الخلية بشكل عام. إن إمكانية استخدام BD-PSCs في الطب التجديدي مع كونها ذاتية المنشأ وغير ماسخة هي موضوع مزيد من الدراسات في مختبرنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تعلن المؤلفة المقابلة أنها صاحبة براءة اختراع تتعلق بالبروتين المرتبط ب GPI البشري الجديد. شاركت في تأسيس وتعمل مع ACA CELL Biotech GmbH. يعلن المؤلفون الآخرون أنه لا يوجد تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويعرب أصحاب البلاغ عن امتنانهم الخاص للمساعدة التقنية التي قدمها أوكسانا وجون غريناكر. تم دعم هذا العمل من قبل ACA CELL Biotech GmbH هايدلبرغ ، ألمانيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
References
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620 (2019).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, Suppl 1 5-15 (2022).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
- Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , Academic Press. Chapter 13 251-268 (2020).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
- Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
- Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
- Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
- Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).
- Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).
- Crandall, B. F.
- Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
- Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
- Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
- Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).
- Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
- Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S.
- Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).
