Summary
Här presenterar vi en icke-genetisk metod för att generera humana autologa leversfäroider med hjälp av mononukleära celler isolerade från perifert blod vid steady-state.
Abstract
Mänskliga leverceller kan bilda en tredimensionell (3D) struktur som kan växa i kultur i några veckor och bevara deras funktionella kapacitet. På grund av sin natur att kluster i odlingsrätterna med låga eller inga vidhäftningsegenskaper bildar de aggregat av flera leverceller som kallas humana leversfäroider. Bildandet av 3D-leversfäroider bygger på levercellernas naturliga tendens att aggregera i frånvaro av ett vidhäftande substrat. Dessa 3D-strukturer har bättre fysiologiska svar än celler, som ligger närmare en in vivo-miljö . Användning av 3D-hepatocytkulturer har många fördelar jämfört med klassiska tvådimensionella (2D) kulturer, inklusive en mer biologiskt relevant mikromiljö, arkitektonisk morfologi som återmonterar naturliga organ samt en bättre förutsägelse avseende sjukdomstillstånd och in vivo-liknande svar på läkemedel. Olika källor kan användas för att generera sfäroider, som primär levervävnad eller odödliga cellinjer. 3D-levervävnaden kan också konstrueras genom att använda humana embryonala stamceller (hESC) eller inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) för att härleda hepatocyter. Vi har erhållit humana leversfäroider med hjälp av blod-härledda pluripotenta stamceller (BD-PSC) genererade från omanipulerat perifert blod genom aktivering av humant membranbundet GPI-bundet protein och differentierat till humana hepatocyter. BD-PSC-härledda humana leverceller och humana leversfäroider analyserades genom ljusmikroskopi och immunofenotypning med användning av humana hepatocytmarkörer.
Introduction
Under de senaste åren har tredimensionella (3D) sfäroidodlingssystem blivit ett viktigt verktyg för att studera olika områden inom cancerforskning, läkemedelsupptäckt och toxikologi. Sådana kulturer väcker stort intresse eftersom de överbryggar klyftan mellan tvådimensionella (2D) cellodlingsmonolager och komplexa organ1.
I frånvaro av en vidhäftande yta, jämfört med 2D-cellkulturen, är bildningen av sfäroider baserad på den naturliga affiniteten hos dessa celler till kluster i 3D-form. Dessa celler organiserar sig i grupper som består av en eller flera typer av mogna celler. Fria från främmande material interagerar dessa celler med varandra som i sin ursprungliga mikromiljö. Cellerna i 3D-kulturen är mycket närmare och har en korrekt orientering mot varandra, med högre extracellulär matrisproduktion än 2D-kulturer, och utgör en nära naturlig miljö 2.
Djurmodeller har länge använts för att studera mänsklig biologi och sjukdomar3. I detta avseende finns det inneboende skillnader mellan människor och djur, vilket gör att dessa modeller inte är helt lämpliga för extrapolativa studier. 3D-odlingssfäroider och organoider representerar ett lovande verktyg för att studera vävnadsliknande arkitektur, interaktion och överhörning mellan olika celltyper som förekommer in vivo och kan bidra till att minska eller till och med ersätta djurmodeller. De är av särskilt intresse för att studera patogenesen av leversjukdomar samt plattformar för läkemedelsscreening4.
3D-sfäroidodling är av särskild betydelse för cancerforskning eftersom den kan eliminera diskontinuiteten mellan cellerna och deras miljö genom att minska behovet av trypsinisering eller kollagenasbehandling som behövs för att förbereda tumörcellens monolager för 2D-kulturer. Tumörsfäroider möjliggör studier av hur normala kontra maligna celler tar emot och svarar på signaler från sin omgivning5 och är en viktig del av tumörbiologiska studier.
Jämfört med monolagret liknar 3D-kulturer bestående av olika celltyper tumörvävnader i deras strukturella och funktionella egenskaper och är därför lämpliga för att studera metastaser och invasion av tumörceller. Det är därför sådana sfäroidmodeller bidrar till att påskynda cancerforskningen6.
Sfäroider hjälper också till att utveckla tekniken för att skapa mänskliga organoider eftersom vävnads- och organbiologi är mycket utmanande att studera, särskilt hos människor. Framsteg inom stamcellsodling gör det möjligt att utveckla 3D-kulturer som organoider bestående av stamceller och vävnadsprogenitorer samt olika typer av mogna (vävnads) celler från ett organ med vissa funktionella egenskaper som ett riktigt organ som kan användas för att modellera organutveckling, sjukdomar, men de kan också anses vara användbara inom regenerativ medicin7.
Primära humana hepatocyter används vanligtvis för att studera in vitro-biologi av humana hepatocyter, leverfunktion och läkemedelsinducerad toxicitet. Kulturer av humana hepatocyter har två huvudsakliga nackdelar, för det första den begränsade tillgängligheten av primär vävnad som humana hepatocyter, och för det andra tendensen hos hepatocyter att snabbt dedifferentiera i 2D-kultur och därigenom förlora sin specifika hepatocytfunktion8. 3D-leverkulturer är överlägsna i detta avseende och har nyligen framställts av differentierade mänskliga embryonala stamceller (hESC) eller inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC)9. Bioengineered hepatiska 3D-sfäroider är av särskilt intresse för att studera utveckling, toxicitet, genetiska och infektionssjukdomar i levern, liksom vid läkemedelsupptäckt för behandling av leversjukdomar10. Slutligen har de också potential att användas kliniskt, med vetskap om att akuta leversjukdomar har en dödlighet på nästan 80%, bioartificiella lever- och / eller leversfäroider kan potentiellt rädda dessa patienter genom att tillhandahålla partiell leverfunktion tills en lämplig givare kan hittas11.
Vi har etablerat ett protokoll för generering av humana leversfäroider med hjälp av blod-härledda pluripotenta stamceller (BD-PSC) för att förbereda sfäroider av olika storlek innehållande 4000 till 1 x 106 celler och analyserat dem med hjälp av ljusmikroskopi och immunofluorescens. Vi testade också förmågan hos hepatocytspecifik funktion och bedömde uttrycket av cytokrom P450 3A4 (CYP3A4) och 2E1 (CYP2E1) enzymer som tillhör cytokrom P450-familjen som har viktiga roller i cellulär och läkemedelsmetabolism genom avgiftningsprocessen12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etiskt godkännande erhölls (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) för att utföra dessa experiment och informerat samtycke undertecknades av alla givare före blodutvinning i enlighet med institutionella riktlinjer.
1. Beredning av mononukleära celler från humant perifert blod
- Extrahera 30 ml blod från friska givare med hjälp av utbildad medicinsk personal enligt standardprotokollet.
- Isolera PBMNC med hjälp av densitetsgradientmedia enligt protokollet publicerat av Becker-Kojić et al.13. Isolera genom pipettering interfasskiktet mellan plasma- och densitetsgradientmedia och använd steril fosfatbuffertsaltlösning (PBS) för att tvätta de isolerade cellerna.
- Använd en räknekammare och räkna antalet celler med standardmetoder.
2. Dedifferentiering av multinationella företag vid aktivering med humant GPI-förankrat glykoprotein
- Placera 6 x 106 mononukleära celler i PBS/1% bovint serumalbumin (BSA) i ett polystyrenrör (15 ml) och inkubera med den specifika antikroppen i 30 minuter vid 37 °C enligt Becker-Kojić et al.13.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g vid rumstemperatur och ersätt PBS / BSA med Iscoves modifierade Dulbeccos medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS).
- Odla cellerna i 15 ml polystyrenrör i en 5% CO2-inkubator vid 37 °C i 8-10 dagar enligt beskrivningen i Becker-Kojić et al.13. På dag 5 (D5), tillsätt 1-2 ml av Iscoves medium kompletterat med 10% FBS till varje 15 ml rör.
3. Sortering av nygenererade dedifferentierade celler
- Centrifugera odlad cellsuspension vid rumstemperatur i 10 minuter vid 300 x g och aspirera med en steril pipett den resulterande supernatanten enligt Becker-Kojić et al.13.
- Återsuspendera pelleten som erhållits genom centrifugering i 90 μl kall PBS-buffert (PBS pH 7,2, 0,5 % BSA och 2 mM EDTA) och tillsätt 10 μL CD45-positiva magnetiska pärlor i nanostorlek och inkubera på is i 15 minuter.
- Tvätta cellsuspensionen med 2 ml PBS-buffert, centrifugera den vid 300 x g i 10 minuter vid rumstemperatur och tillsätt 500 μL PBS-buffert till cellerna och suspendera ordentligt.
- Pipettera 500 μL förkyld PBS-buffert i kolonnen för att tvätta och placera den i magnetfältet med hjälp av ett magnetstativ.
- Tvätta cellerna placerade på kolonnen två gånger med 500 μL PBS-buffert och samla genomströmning innehållande CD45-negativa celler i Iscoves medium kompletterat med 10% FBS.
- Använd en räknekammare för att bestämma antalet omprogrammerade celler.
4. Beredning av glastäckglas för generering av humana hepatocyter
- Separera glastäcken (14 mm) och inkubera dem med nonjoniskt rengöringsmedel i 10 minuter. Tvätta glastäcken i avjoniserat vatten tills inga bubblor finns kvar och inkubera dem i 1M HCl i 30 minuter (anpassad från Marchenko et al.14).
- Tvätta glastäcken med avjoniserat vatten minst 3x och torka dem över natten vid rumstemperatur. Autoklav torkat glas täckglas i en lämplig behållare.
5. Beläggning av cellodlingsplattor med biolaminin för 2D-leverdifferentiering av BD-PSC
- Placera autoklaverade glastäcken med en steril pincett i 4 brunnsplattor och slå på UV-lampor i 30 minuter för att säkerställa sterila förhållanden.
- Tina alikvoter av biolaminin och tillsätt 120 μl 5 μg/ml biolaminin till varje glastäcke. Låt de belagda glasöverdragen övernatta ligga på 4 °C.
- Ta bort överskottet av biolaminin och tillsätt 200 μL hepatocytdifferentieringsmedium enligt beskrivningen nedan.
6. Framställning av hepatocytdifferentieringsmedia
- Gör 500 ml hepatoblast knockout serumersättning (KSR) / dimetylsulfoxid (DMSO) medium bestående av 76.4% knockout DMEM (KO-DMEM), 20% KSR, 0.5% L-glutamin, 1% icke-essentiella aminosyror (NEAA), 0.1% β-merkaptoetanol, 1% DMSO och 1% penicillin-streptomycin (Pen / Strep).
- Bered 500 ml hepatocytmognadsmedium innehållande 1% L-glutamin, 10 μM hydrokortison-21-hemisuccinatnatriumsalt (HCC) och 1% Pen / Strep.
- Alikvot medium från stammen och tillsätt färsk hepatocyttillväxtfaktor (HGF) och onkostatin M (OSM) vid slutliga koncentrationer på 10 ng/ml och/eller 20 ng/ml för varje medieförändring.
OBS: Oncostatin M är ett cytokin som tillhör interleukin 6-gruppen av cytokiner, viktigt för hematopoies såväl som för leverutveckling.
7. Odling av leverceller differentierade från BD-PSC
- Sätt 3 x 105 BD-PSCS-celler i varje brunn på en 4-brunnsplatta belagd med biolaminin.
- Placera 4-brunnsplattorna i inkubatorn vid 37 °C och 5%CO2. Odla cellerna i 5 dagar i KSR / DMSO hepatoblast medium som stöder endodermal differentiering och ändra mediet varannan dag.
- Byt till hepatocytmognadsmedium på dag 5 och odla cellerna i ytterligare 7-10 dagar i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2. Byt medium var 48: e timme.
8.3D sfäroid leverdifferentiering
- Räkna celler med hjälp av en räknekammare.
- Centrifugera BD-dedifferentierad cellsuspension vid 300 x g i 10 minuter vid rumstemperatur. Ta bort supernatanten och suspendera BD-dedifferentierade celler i KSR/DMSO-medium vid 2 x 106 celler/ml.
- För cellerna genom en 40 μm cellsil för att säkerställa en encellssuspension och för att avlägsna ytterligare skräp.
- Räkna celler med hjälp av en räknekammare och förbered en tillräcklig volym för varje cellsådddensitet för att fördela den erforderliga volymen per brunn. Förbered en gradient med toppsådd av 1 x 106 celler till en låg sådddensitet på 4000 celler.
- Fördela 100 μL KSR/DMSO-medium i 96 väl låga fästplattor och tillsätt 100 μL cellsåddutspädning.
- Placera låg fästplatta i inkubatorn vid 37 °C och 5%CO2 och odla dem i 5 dagar.
- Byt 50% av mediet från dag 3-4 efter sådd när sfäroiderna är tillräckligt kompakta.
- På dag 5, byt medium till hepatocytmognadsmedium och odla cellerna i ytterligare 7-10 dagar för ytterligare mognad. Byt medium varannan dag.
9. Immunofluorescensanalys av nygenererade 2D-levercellskulturer
- Odla cellerna enligt differentieringsmetoden som beskrivs ovan i 4, 8, 15 och 24 dagar och ta bort media.
- Inkubera celler med förvärmt fixeringsmedel bestående av 4% paraformaldehyd i PBS i 10 min. Kassera fixeringsmedlet och tvätta cellerna 2x med PBS i 5 minuter vardera. Tillsätt omedelbart 0,1% triton X-100-lösning och permeabilisera cellerna i 5 minuter. Tvätta 2x med PBS.
- Tillsätt blockeringslösning av PBS och 5% BSA och placera på vippplattan i 1 timme vid rumstemperatur.
- Späd primära antikroppar i utspädningsbuffert 1% BSA/PBS enligt följande: albumin (ALB) 1:50, alfa-1 fetoprotein (AFP) 1:250, cytokeratin 18 (CK18) 1:50, hepatocytkärnfaktor 4 alfa (HNF4α) 1:1000 och trantetrain (TTR) 1:50. Använd 50 μl antikroppsutspädning per brunn.
- Inkubera cellerna i 1 h vid rumstemperatur. Kassera sedan antikroppslösningen, tvätta cellerna i 5 minuter och upprepa tvättsteget 3x.
- Bered följande sekundära antikroppar i utspädningsbuffert: kanin anti-kyckling IgG (Texas röd) 1:1000, get anti-mus IgG (488) 1:1000 och get anti-kanin (488) 1:500. Använd 50 μl antikroppsutspädning per brunn och inkubera cellerna i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna 3x med PBS i 5 minuter vardera och montera täckglasen med monteringsmedia som innehåller DAPI för mikroskopisk analys.
10. Levande färgning av nybildade leversfäroider
- Kassera försiktigt odlingsmedia medan du inte vidrör sfäroiderna, tillsätt nygjord PBS med 0,1% triton X-100-lösning och inkubera i 5 minuter för att permeabilisera cellerna.
- Tvätta sfäroiderna med mediet genom att långsamt pipettera i 5 min, upprepa 2x.
- Inkubera sfäroiderna med de primära antikropparna ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) och CYP3A4 (1:200) beredda i PBS med 1% BSA i 1 timme i 5% CO2-inkubator vid 37 °C. Använd 50 μl antikroppsutspädning per brunn.
- Ta försiktigt bort överskottet av antikroppslösningen och tvätta sfäroiderna med medium 3x.
- Bered motsvarande sekundära antikroppar get anti-mus IgG (Cy3), get anti-mus IgG (488) och kanin anti-kyckling IgG (Texas röd) vid en utspädning av 1:1000 och 1:500 för get anti-kanin (488) i PBS i 1% BSA. Använd 50 μl antikroppsspädning per brunn och inkubera i 20 minuter i inkubatorn vid 37 °C och 5 %CO2.
- Tvätta försiktigt 3x med medium och låt plattan stå i 30 minuter i inkubatorn vid 37 °C och 5%CO2 innan fluorescensmikroskopi utförs.
11. Undersökning av sfäroider med hjälp av ett fluorescensmikroskop
- Slå på fluorescensljuskällan 10 min före användning, slå på datorn och öppna bildåtergivningsprogrammet.
- Använd ett objektiv med 4x förstoring, klicka på knapp 4x i verktygsfältet för att välja rätt skalstapel och placera sedan 96-brunnsplattan på scenens mittplatta.
- Slå på LED-ljuskällan, använd ljusfältfiltret och placera plattan i den intressanta brunnen med hjälp av x-y-axelns stegjusteringsknapp.
- Byt till kamerans ljusbana, klicka på knappen Live i bildhanteringsprogramvara för att visualisera bilden på skärmen och se till att sfäroiden är centrerad med x-y-axelrattarna och fokusera med den grova / fina fokusratten.
OBS: Formen på sfäroiderna förblir konstant efter applicering av levande färgning. - Välj metoden Brightfield Observation i verktygsfältet, ställ exponeringsinställningarna till automatisk och klicka på knappen Snapshot i kamerans kontrollpanel för att ta en bild. Spara sedan bilden som .vsi-fil med lämpligt namn i mappen av intresse.
- Placera skärmningsplattan för att stänga av LED-ljuset, byt till filter för B-excitation, välj 488 Observationsmetod i verktygsfältet, öppna slutaren, ta en bild genom att klicka på knappen Snapshot, stäng slutaren och spara sedan filen enligt beskrivningen ovan.
- Upprepa detta med ett filter för G-excitation med lämplig observationsmetod (Texas röd eller CY3). Upprepa sedan hela proceduren för varje brunn av intresse.
- Sätt tillbaka plattan i 5 % CO2-inkubatorn vid 37 °C och odla den enligt beskrivningen ovan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi differentierade framgångsrikt humana BD-PSC i endoderm / hepatiska stamceller och hepatocyter genom att tillämpa ett tvåstegsprotokoll. Morfologiska förändringar under leverdifferentieringsprocessen visas i figur 1. BD-PSC differentieras till hepatocyter som går igenom tre olika steg. Det första steget representerar differentieringen i endodermala celler L4, den andra, differentiering till hepatiska stamceller (hepatoblast) L8, som uppvisar en typisk polygonal morfologi, och den tredje, mognaden till hepatocyter L15-L24.
Immunofluorescensanalys utfördes för att bekräfta leverdifferentieringen av BD-PSC enligt figur 2. Starkt uttryck av endoderm / human leverprogenitormarkör, som alfa-fetoprotein (AFP), ett viktigt plasmaprotein i fosterserum vars koncentration är mycket låg i vuxna organismer och därför anses vara en markör för hepatocyternas föregångare15 och transtyretin (TTR), ett viktigt sköldkörtelhormonbindande protein involverat i transport av tyroxin från blodomloppet till hjärnan16 finns i cellerna i det första steget av leverdifferentieringsprocessen vid L4 till L8. Men deras uttryck minskar vid L15, medan uttrycket av albumin (ALB), det vanligaste plasmaproteinet som produceras huvudsakligen av levern och är helt kritiskt för leverdifferentiering, liksom hepatocytkärnfaktor 4 alfa (HNF-4a), en hepatocyttranskriptionsfaktor som är involverad i uttrycket av leverspecifika gener17 visas först vid L4, stiger under hela differentieringstiden L4-L15 och når ett starkt och stabilt uttryck under mognadstiden L15-L24.
Cytokeratin 18 (CK18) är ett cytoskelettprotein, en av huvudkomponenterna i intermediärt filament uttryckt i levern18. Resultaten visar att CK18-uttryck, som förväntat, korrelerar med mogna hepatocyter (L15-L24), och det uttrycks inte i hepatocytprogenitorceller.
Det väldefinierade protokollet för hepatocytdifferentiering i 2D-kulturer möjliggör konstruktion av hepatiska 3D-kulturer som börjar med BD-PSC.
Vi visar här att spontan aggregering av dessa celler i plattor med låg bindning innehållande hepatocytinduktion/mognadsmedium initierar sfäroidbildning. Tillväxtspåret följdes av avbildningsceller vid L2, L4 och L7. (Figur 3A) Det finns en konsekvent korrelation mellan sfäroidvolym och det variabla antalet celler, som presenteras i figur 3B.
Levern är ett organ där de flesta läkemedel i människokroppen metaboliseras. Cytokrom P450 är en superfamilj av enzymer (monooxygenaser) som är av avgörande betydelse i processerna för läkemedels- och cellulär metabolism, avgiftning av xenobiotika och homeostas. För att bedöma den potentiella funktionella aktiviteten hos BD-PSCs-härledda leversfäroider analyserade vi uttrycket av läkemedelsmetaboliserande enzymer som CYP3A4 och CYP2E1, medlemmar i CYP3- och CYP2-familjer19.
De flesta av de läkemedel som används idag inklusive kodein, ciklosporin A, erytromycin, paracetamol och diazepam samt många steroider och cancerframkallande ämnen, metaboliseras på grund av aktiviteten av CY3A4-enzym20. CYP2E1 är involverat i metabolismen av endogena substrat som etylenglykol, bensen, koltetraklorid och särskilt den viktigaste mycket mutagena föreningen som nitrosamin21.
De sfäroider som bildas och differentieras enligt protokollet vid D14, levande färgade med antikroppar mot dessa två enzymer, avslöjar den potentiella leverfunktionella aktiviteten hos BD-PSC-härledda sfäroider (figur 4).
Figur 1: Differentiering av BD-PSC till leverliknande celler. Representativa mikrografer av morfologiska förändringar genom leverdifferentiering av BD-PSC som visar endodermal L4 eller polygonal form L8-morfologi som slutligen når mognadstillstånd vid L15 till L24. Skalstreck: övre raden 50 μm, nedre raden 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Immunofluorescensanalys av BD-PSCs omdifferentiering mot leverceller. Endoderm/hepatocyter, stamfader och hepatocyter specifika markörer uttrycks under leverdifferentiering av BD-PSC i 2D-kulturer. På dagarna L4 till L8 visar mikrografer minskat uttryck av endoderm / leverstamfader AFP och TTR medan deras uttryck försvann från L8-L24. Uttryck av hepatocyter ALB- och HNFα-markörer uppstår vid L4 och ökar under mognad, medan uttrycket av CK18 uppträdde först vid L15 och nådde maximalt vid L24. Skalstaplar för diagram L4-L15: 50 μm och för L24: 20 μm. Kontroll presenteras i kompletterande figur 1. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Bildning av 3D-sfäroider vid leverdifferentiering av BD-PSC. (A) Varierande cellantal BD-PSC som börjar med 1 x 106 till 4000 celler såddes i låga fästplattor och differentiering utfördes enligt tvåstegsproceduren som anges i protokollet. Genereringen av 3D-humana leversfäroider avbildades vid olika tidpunkter, som visas är representativa faskontrastbilder vid varje tidpunkt under kulturperioden. Skalstapel: 200 μm. (B) Diametrar på minst 4 leversfäroider för varje storlek mättes vid L4 med hjälp av mikroskopbildbehandlingsprogram och volymer beräknades. Felstaplar visar standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Hepatocytfunktionella markörer uttrycks i leversfäroider som härrör från BD-PSC. BD-PSC differentierades i hepatocyter. Direkt immunofluorescensanalys utfördes på levande celler vid L14 med antikroppar mot ALB, AFP, CK18 och CYP2E1 och CYP3A4, medlemmar av cytokrom P450-familjen. Skalstapel: 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Negativ kontroll för immunofluorescensanalys av BD-PSCs redifferentiering mot leverceller. Endoderm/hepatocyter, stamfader och hepatocyter specifika markörer uttrycks under leverdifferentiering av BD-PSC i 2D-kulturer. Skalstång: 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Levern är ett viktigt organ i människokroppen med många viktiga biologiska funktioner, såsom avgiftning av metaboliter. På grund av svår leversvikt som cirros och / eller viral hepatit finns det nästan 2 miljoner dödsfall per år över hela världen. Levertransplantationer rankas på andra plats i solida organtransplantationer över hela världen, men endast cirka 10% av det nuvarande behovet tillgodoses22.
Primära humana hepatocyter (PHH) används ofta för att studera levertoxicitet. Dessa celler kan bibehållas i kultur under en kort tid och behålla sina specifika funktioner. Antalet celler som är tillgängliga från en enda givare är också begränsat, dessutom kan dessa celler inte expanderas i kulturen, därför är bristen på donator-PHH fortfarande det största hindret för levertoxicitetsstudier. PSC utgör en förnyelsekälla för mänskliga vävnader och kan användas för generering av 3D-leverkulturer11.
Lever 3D-odlingssystem visar flera fördelar jämfört med 2D. Kortare differentieringstid och noggrann efterlikning av in vivo-processer möjliggör mer exakta studier av läkemedelsinducerad toxicitet, bättre förutsägelse av leveransvar och är mer kostnadseffektiva23. Leversfäroidkulturerna på grund av deras autologa egenskap kan vara en stor fördel jämfört med primära humana hepatocyter (PHH) som kringgår nackdelarna med deras användning och kan bli en guldstandard för tillämpning vid testning av läkemedelstoxicitet och har en potentiell framtida tillämpning inom regenerativ medicin.
Vi har här visat att BD-PSC genererade från steady-state perifert blod framgångsrikt kan differentieras till endodermala / hepatocytprogenitorer / mogna hepatocyter med stadig albuminsekretion och fenotypisk stabilitet som uttrycker hepatocytmarkörer. Dessutom visar de konstruerade 3D-humana hepatocytsfäroidkulturerna den potentiella funktionella aktiviteten genom att uttrycka enzymerna som tillhör cytokrom P450, som CYP3A4 och CYP2E1.
Det viktigaste steget i protokollet är att få god kvalitet och antal färska mänskliga multinationella företag för omprogrammeringsprocessen. Användningen av frysta multinationella företag resulterar i ett minskat antal omprogrammerade celler.
Vi har konstruerat humana leversfäroider med aktiverade PBMNC-kulturer med och utan att tillämpa immunomagnetisk sortering som separerar omprogrammerade celler från mogna blodkroppar. Den lilla skillnaden i att använda dessa två metoder är beroende av den högre densiteten hos 3D-strukturen vid användning av renade omprogrammerade celler. Uttrycket av hepatocytmarkörer förblir konsekvent i båda cellodlingspreparaten.
På grund av den begränsade tillgången på PHH representerar metoden potentiellt det biologiskt relevanta närmaste alternativet till autologa färska hepatocyter för att studera leverfunktion in vitro , som xenobiotiska metabolismer och levertoxicitet, värdpatogenintervention och cellbiologi i allmänhet. Möjligheten att använda BD-PSC i regenerativ medicin samtidigt som den är autolog och icke-teratogen är föremål för ytterligare studier i vårt laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Motsvarande författare förklarar att hon är patentinnehavare relaterad till nytt humant GPI-bundet protein. Hon grundade och arbetar med ACA CELL Biotech GmbH. De andra författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna är särskilt tacksamma för det tekniska biståndet från Oksana och John Greenacre. Detta arbete stöddes av ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
References
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620 (2019).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, Suppl 1 5-15 (2022).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
- Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , Academic Press. Chapter 13 251-268 (2020).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
- Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
- Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
- Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
- Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).
- Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).
- Crandall, B. F.
- Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
- Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
- Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
- Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).
- Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
- Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S.
- Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).
