Summary
כאן אנו מציגים שיטה לא גנטית ליצירת ספרואידים אוטולוגיים אנושיים בכבד באמצעות תאים חד-גרעיניים שבודדו מדם היקפי במצב יציב.
Abstract
תאי כבד אנושיים יכולים ליצור מבנה תלת ממדי (3D) המסוגל לגדול בתרבית במשך כמה שבועות, תוך שמירה על יכולתם התפקודית. בשל טבעם להתקבץ בתרבית צלחות בעלות תכונות דבק נמוכות או ללא תכונות דבק, הם יוצרים צברים של תאי כבד מרובים הנקראים ספרואידים של כבד אנושי. היווצרותם של ספרואידים תלת-ממדיים בכבד מסתמכת על הנטייה הטבעית של תאי הכבד להצטבר בהיעדר מצע דביק. למבנים תלת-ממדיים אלה יש תגובות פיזיולוגיות טובות יותר מאשר לתאים, הקרובים יותר לסביבה in vivo . לשימוש בתרביות הפטוציטים תלת-ממדיות יש יתרונות רבים בהשוואה לתרביות דו-ממדיות (2D) קלאסיות, כולל מיקרו-סביבה רלוונטית יותר מבחינה ביולוגית, מורפולוגיה אדריכלית המרכיבה מחדש איברים טבעיים, כמו גם חיזוי טוב יותר לגבי מצב המחלה ותגובות דמויות in vivo לתרופות. מקורות שונים יכולים לשמש ליצירת ספרואידים, כמו רקמת כבד ראשונית או קווי תאים אימורטליים. ניתן להנדס את רקמת הכבד התלת-ממדית גם באמצעות תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) או תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (hiPSCs) כדי להפיק הפטוציטים. השגנו ספרואידים אנושיים בכבד באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים שמקורם בדם (BD-PSCs) המופקים מדם היקפי ללא מניפולציה על ידי הפעלת חלבון הקשור לקרום אנושי הקשור ל- GPI ומובחן להפטוציטים אנושיים. תאי כבד אנושיים שמקורם ב-BD-PSCs וספרואידים של כבד אנושי נותחו במיקרוסקופ אור ואימונופנוטיפ באמצעות סמני כבד אנושיים.
Introduction
בשנים האחרונות מערכות תרבית ספרואידים תלת-ממדיות (3D) הפכו לכלי חשוב לחקר תחומים שונים של חקר סרטן, גילוי תרופות וטוקסיקולוגיה. תרביות כאלה מעוררות עניין רב משום שהן מגשרות על הפער בין חד-שכבות דו-ממדיות (2D) של תרביות תאים לבין איברים מורכבים1.
בהיעדר משטח דביק, בהשוואה לתרבית תאים דו-ממדית, היווצרות הספרואידים מבוססת על הזיקה הטבעית של תאים אלה להתקבץ בצורה תלת-ממדית. תאים אלה מתארגנים לקבוצות המורכבות מסוג אחד או יותר של תאים בוגרים. ללא חומרים זרים, תאים אלה מתקשרים זה עם זה כמו במיקרו-סביבה המקורית שלהם. התאים בתרבית תלת-ממדית קרובים הרבה יותר ובעלי אוריינטציה נכונה זה כלפי זה, עם ייצור מטריצה חוץ-תאית גבוה יותר מאשר תרביות דו-ממדיות, ומהווים סביבה טבעית קרובה 2.
מודלים של בעלי חיים שימשו במשך זמן רב לחקר ביולוגיה אנושית ומחלות3. בהקשר זה, ישנם הבדלים מהותיים בין בני אדם לבעלי חיים, מה שהופך מודלים אלה לא לגמרי מתאים למחקרים אקסטרפולטיביים. ספרואידים ואורגנואידים בתרבית תלת-ממדית מהווים כלי מבטיח לחקר ארכיטקטורה דמוית רקמה, אינטראקציה והצלבה בין סוגי תאים שונים המתרחשים in vivo ויכולים לתרום להפחתה או אפילו להחלפה של מודלים של בעלי חיים. הם מעניינים במיוחד לחקר הפתוגנזה של מחלות כבד, כמו גם פלטפורמות סינון תרופות4.
תרבית ספרואידים תלת-ממדית היא בעלת חשיבות מיוחדת לחקר הסרטן מכיוון שהיא יכולה לחסל את חוסר הרציפות בין התאים לסביבתם על ידי הפחתת הצורך בטריפסיניזציה או בטיפול בקולגנאז הדרוש להכנת חד-שכבות תאי הגידול לתרביות דו-ממדיות. ספרואידים סרטניים מאפשרים לחקור כיצד תאים נורמליים לעומת תאים ממאירים מקבלים ומגיבים לאותות מסביבתם5 והם חלק חשוב בלימודי ביולוגיה של גידולים.
בהשוואה לחד-שכבתיות, תרביות תלת-ממדיות המורכבות מסוגי תאים שונים דומות לרקמות הגידול בתכונותיהן המבניות והתפקודיות ולכן מתאימות לחקר גרורות ופלישה של תאי גידול. זו הסיבה שמודלים ספרואידים כאלה תורמים להאצת חקר הסרטן6.
ספרואידים גם עוזרים לפתח את הטכנולוגיה ליצירת אורגנואידים אנושיים מכיוון שביולוגיה של רקמות ואיברים מאתגרת מאוד למחקר, במיוחד בבני אדם. התקדמות בתרבית תאי גזע מאפשרת לפתח תרביות תלת ממדיות כמו אורגנואידים המורכבים מתאי גזע ואבות רקמות, כמו גם סוגים שונים של תאים בוגרים (רקמות) מאיבר עם כמה מאפיינים פונקציונליים כמו איבר אמיתי שניתן להשתמש בו כדי למדל התפתחות איברים, מחלות, אבל הם גם יכולים להיחשב שימושיים ברפואה רגנרטיבית7.
הפטוציטים אנושיים ראשוניים משמשים בדרך כלל לחקר ביולוגיה חוץ גופית של הפטוציטים אנושיים, תפקוד כבד ורעילות הנגרמת על ידי תרופות. לתרביות של הפטוציטים אנושיים יש שני חסרונות עיקריים, ראשית, הזמינות המוגבלת של רקמה ראשונית כמו הפטוציטים אנושיים, ושנית, הנטייה של הפטוציטים להתמיין במהירות בתרבית דו-ממדית ובכך לאבד את פונקציית הפטוציטים הספציפית שלהם8. תרביות כבד תלת-ממדיות הן טובות יותר בהקשר זה, ולאחרונה נוצרו מתאי גזע עובריים אנושיים ממוינים (hESCs) או מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (hiPSCs)9. ספרואידים תלת-ממדיים מהונדסים ביולוגית בכבד מעניינים במיוחד בחקר התפתחות, רעילות, מחלות גנטיות וזיהומיות של הכבד, כמו גם בגילוי תרופות לטיפול במחלות כבד10. לבסוף, יש להם גם פוטנציאל לשימוש קליני, בידיעה שלמחלות כבד חריפות יש שיעור תמותה של כמעט 80%, כבד ביו-מלאכותי ו / או ספרואידים בכבד יכולים להציל חולים אלה על ידי מתן תפקוד כבד חלקי עד שניתן למצוא תורם מתאים11.
קבענו פרוטוקול ליצירת ספרואידים אנושיים בכבד באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים שמקורם בדם (BD-PSCs) להכנת ספרואידים בגדלים שונים המכילים 4000 עד 1 x 106 תאים וניתחנו אותם באמצעות מיקרוסקופ אור ואימונופלואורסנציה. בדקנו גם את היכולת של תפקוד ספציפי לכבד, והערכנו את הביטוי של אנזימי ציטוכרום P450 3A4 (CYP3A4) ו-2E1 (CYP2E1) השייכים למשפחת הציטוכרום P450 שיש להם תפקידים חשובים במטבוליזם של תאים ותרופות באמצעות תהליך של ניקוי רעלים12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
התקבל אישור אתי (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) לביצוע ניסויים אלה והסכמה מדעת נחתמה על ידי כל התורמים לפני שאיבת הדם בהתאם להנחיות המוסדיות.
1. הכנת תאים חד-גרעיניים (MNCs) מדם היקפי אנושי (PB)
- לחלץ 30 מ"ל דם מתורמים בריאים בעזרת צוות רפואי מיומן על פי הפרוטוקול הסטנדרטי.
- בודד PBMNCs באמצעות מדיה שיפוע צפיפות על פי הפרוטוקול שפורסם על ידי Becker-Kojić et al.13. בודדו, על ידי פיפטינג, את שכבת הביניים בין פלזמה ומדיה הדרגתית צפיפות והשתמשו במי מלח חיץ פוספט סטריליים (PBS) כדי לשטוף את התאים המבודדים.
- השתמש בתא ספירה וספור את מספר התאים בשיטות סטנדרטיות.
2. דיפרנציאציה של MNCs עם הפעלה עם גליקופרוטאין מעוגן GPI אנושי
- מניחים 6 x 106 תאים חד-גרעיניים באלבומין בסרום PBS / 1% בקר (BSA) בצינור פוליסטירן (15 מ"ל) ודגורים עם הנוגדן הספציפי למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על פי Becker-Kojić et al.13.
- צנטריפוגו את התאים ב 300 x גרם בטמפרטורת החדר ולהחליף PBS / BSA עם מדיום Dulbecco של Iscove בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS).
- לגדל את התאים בצינורות פוליסטירן 15 מ"ל באינקובטור 5% CO2 ב 37 ° C במשך 8-10 ימים כמתואר Becker-Kojić et al.13. ביום 5 (D5), הוסף 1-2 מ"ל של מדיום Iscove בתוספת 10% FBS לכל צינור 15 מ"ל.
3. מיון של תאים חדשים שנוצרו dedifferentiated
- תרחיף תאים בתרבית צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב 300 x גרם ושואף עם פיפטה סטרילית את supernatant שנוצר על פי Becker-Kojić et al.13.
- גלולת השהיה המתקבלת על ידי צנטריפוגה ב-90 מיקרוליטר של חיץ PBS קר (PBS pH 7.2, 0.5% BSA ו-2 mM EDTA) ומוסיפים 10 μL של CD45 חרוזים מגנטיים חיוביים בגודל ננומטרי ודגרים על קרח למשך 15 דקות.
- שטפו את מתלה התא עם 2 מ"ל של חיץ PBS, צנטריפוגו אותו ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר והוסיפו 500 μL של חיץ PBS לתאים והשהו מחדש ביסודיות.
- פיפטה 500 μL של חיץ PBS מקורר מראש לתוך העמוד כדי לשטוף ולמקם אותו בשדה המגנטי באמצעות מעמד מגנטי.
- שטפו את התאים שהונחו על העמודה, פעמיים עם 500 μL של חיץ PBS ואספו זרימה המכילה תאים שליליים CD45 בתווך של Iscove בתוספת 10% FBS.
- השתמש בתא ספירה כדי לקבוע את מספר התאים שתוכנתו מחדש.
4. הכנת כיסויי זכוכית לדור הפטוציטים האנושיים
- יש להפריד את כיסויי הזכוכית (14 מ"מ) ולדגור עליהם בחומר ניקוי לא יוני למשך 10 דקות. שטפו את כיסויי הזכוכית במים נטולי יונים, עד שלא יישארו בועות, ודגרו עליהם ב-1M HCl למשך 30 דקות (מעובד מ-Marchenko et al.14).
- יש לשטוף את כיסויי הזכוכית במים נטולי יונים, לפחות 3 פעמים ולייבש אותם למשך הלילה בטמפרטורת החדר. זכוכית מיובשת Autoclave מכסה במיכל מתאים.
5. ציפוי לוחות תרבית תאים עם biolaminin עבור התמיינות כבד 2D של BD-PSCs
- הניחו את כיסויי הזכוכית האוטומטיים עם זוג פינצטות סטריליות ב-4 צלחות באר והדליקו את אורות ה-UV למשך 30 דקות כדי להבטיח תנאים סטריליים.
- הפשירו אליציטוטים של ביולמינין והוסיפו 120 μL של 5 מיקרוגרם / מ"ל ביולמינין לכל החלקת כיסוי זכוכית. השאירו את כיסויי הזכוכית המצופים למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
- הסר את עודף של biolaminin ולהוסיף 200 μL של מדיום התמיינות hepatocyte כמתואר להלן.
6. הכנת מדיה הבחנה hepatocyte
- ייצור 500 מ"ל של תחליפי סרום נוקאאוט הפטובלסטים (KSR)/דימתיל סולפוקסיד (DMSO) בינוני המורכב מ-76.4% נוקאאוט DMEM (KO-DMEM), 20% KSR, 0.5% L-גלוטמין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 0.1% β-מרקפטואתנול, 1% DMSO ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (Pen/Strep).
- הכינו 500 מ"ל של מדיום הבשלת הפטוציטים המכיל 1% L-גלוטמין, 10 מיקרומטר הידרוקורטיזון 21-המיסוקצינאט נתרן מלח (HCC) ו-1% עט/סטרפ.
- Aliquot בינוני מהמלאי ולהוסיף גורם גדילה הפטוציטים טרי (HGF) ו oncostatin M (OSM) בריכוזים סופיים של 10 ng / mL ו / או 20 ng / mL עבור כל שינוי בינוני.
הערה: Oncostatin M הוא ציטוקין השייך לקבוצת הציטוקינים interleukin 6, חשוב להמטופויזיס כמו גם להתפתחות הכבד.
7. גידול תאי כבד ממוינים מ- BD-PSCs
- שים 3 x 105 תאי BD-PSCS לתוך כל באר של צלחת 4 באר מצופה biolaminin.
- מניחים את לוחות 4 בארות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2. תרבית את התאים במשך 5 ימים בתווך הפטובלסטים KSR/DMSO התומך בהתמיינות אנדודרמלית ושנה את המדיום כל יומיים.
- עברו למדיום הבשלת הפטוציטים ביום 5 ותרבו את התאים למשך 7-10 ימים נוספים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. שנה את המדיום כל 48 שעות.
8.3D התמיינות כבדית ספרואידית
- ספירת תאים באמצעות תא ספירה.
- צנטריפוגה BD-dedifferentiated תא השעיה ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר supernatant והשהה מחדש תאים ללא התמיינות BD בתווך KSR/DMSO ב- 2 x 106 תאים/מ"ל.
- העבירו את התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי להבטיח תרחיף חד-תאי ולהסיר פסולת נוספת.
- ספרו תאים באמצעות תא ספירה והכינו נפח מספיק לכל צפיפות זריעה של תא על מנת לחלק את הנפח הנדרש לכל באר. הכינו שיפוע עם זריעה עליונה של 1 x 106 תאים לצפיפות זריעה נמוכה של 4000 תאים.
- יש להוציא 100 μL של KSR/DMSO בינוני ב-96 לוחות חיבור נמוכים היטב ולהוסיף 100 μL של דילול זריעת תאים.
- מניחים צלחת חיבור נמוכה באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2 ו תרבית אותם במשך 5 ימים.
- שנה 50% מהתווך מימים 3-4 לאחר הזריעה כאשר הספרואידים קומפקטיים מספיק.
- ביום 5, לשנות את המדיום כדי hepatocyte התבגרות המדיום ואת תרבית התאים במשך 7-10 ימים נוספים להבשלה נוספת. החליפו את המדיום כל יומיים.
9. ניתוח אימונופלואורסנציה של תרביות תאי כבד דו-ממדיות שנוצרו לאחרונה
- תרבית את התאים בשיטת ההתמיינות שתוארה לעיל במשך 4, 8, 15 ו-24 ימים ותוציא מדיה.
- לדגור על תאים עם קיבוע שחומם מראש המורכב מ-4% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 10 דקות. השליכו את הקיבוע ושטפו את התאים 2x עם PBS למשך 5 דקות כל אחד. הוסף מיד תמיסת טריטון X-100 0.1% וחדיר את התאים למשך 5 דקות. יש לשטוף פעמיים עם PBS.
- הוסף תמיסת חסימה העשויה PBS ו- 5% BSA והנח על צלחת נדנדה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- דילול נוגדנים ראשוניים במאגר דילול 1% BSA/PBS כדלקמן: אלבומין (ALB) 1:50, חלבון עוברי אלפא-1 (AFP) 1:250, ציטוקרטין 18 (CK18) 1:50, פקטור גרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) 1:1000 וטרנסתירטין (TTR) 1:50. השתמש 50 μL של דילול נוגדנים לכל באר.
- לדגור על התאים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן השליכו את תמיסת הנוגדנים, שטפו את התאים במשך 5 דקות וחזרו על שלב השטיפה 3x.
- הכינו את הנוגדנים המשניים הבאים במאגר דילול: ארנב נגד עוף IgG (אדום טקסס) 1:1000, עיזים נגד עכבר IgG (488) 1:1000, ועז נגד ארנב (488) 1:500. השתמש 50 μL של דילול נוגדנים לכל באר לדגור את התאים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- שטפו את התאים 3x עם PBS במשך 5 דקות כל אחד והרכיבו את הכיסויים עם מדיית הרכבה המכילה DAPI לניתוח מיקרוסקופי.
10. צביעה חיה של ספרואידים חדשים שנוצרו בכבד
- יש להשליך בזהירות את אמצעי התרבית מבלי לגעת בכדורים, להוסיף PBS טרי עם תמיסת 0.1% טריטון X-100, ולדגור במשך 5 דקות כדי לחדור לתאים.
- שטפו את הספרואידים עם המדיום על ידי פיפטינג איטי במשך 5 דקות, חזרו על הפעולה 2x.
- לדגור על הספרואידים עם הנוגדנים העיקריים ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) ו-CYP3A4 (1:200) שהוכנו ב-PBS עם 1% BSA למשך שעה אחת באינקובטור CO2 של 5% ב-37°C. השתמש 50 μL של דילול נוגדנים לכל באר.
- בזהירות להסיר את תמיסת נוגדנים עודף לשטוף את spheroids עם בינוני 3x.
- הכינו את הנוגדנים המשניים המתאימים IgG נגד עכבר (Cy3), IgG נגד עכבר עיזים (488), וארנב נגד עוף IgG (אדום טקסס) בדילול של 1:1000 ו-1:500 נגד ארנב עיזים (488) ב-PBS ב-1% BSA. השתמש 50 μL של דילול נוגדנים לכל באר לדגור במשך 20 דקות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2.
- בזהירות לשטוף 3x עם בינוני ולהשאיר את הצלחת במשך 30 דקות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2 לפני ביצוע מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
11. בדיקת ספרואידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי
- הפעל את מקור האור הפלואורסצנטי 10 דקות לפני השימוש, הפעל את המחשב ופתח את תוכנת ההדמיה.
- השתמש במטרה עם הגדלה 4x, לחץ על כפתור 4x בסרגל הכלים כדי לבחור את סרגל קנה המידה הנכון, ולאחר מכן הנח את צלחת 96 באר על הצלחת במרכז הבמה.
- הפעל את מקור תאורת ה- LED, השתמש במסנן brightfield ומקם את הצלחת לבאר המעניינת באמצעות ידית הכוונון של שלב ציר x-y.
- שנה לנתיב תאורת המצלמה, לחץ על הלחצן Live in תוכנת הדמיה כדי להמחיש את התמונה על המסך, ולוודא שהספרואיד ממורכז באמצעות ידיות ציר ה-x ולהתמקד באמצעות ידית המיקוד הגס/עדין.
הערה: צורת הספרואידים נשארת קבועה לאחר מריחת כתמים חיים. - בחרו בשיטת Brightfield Observation בסרגל הכלים, העבירו את הגדרות החשיפה למצב אוטומטי ולחצו על הלחצן Snapshot בלוח הבקרה של המצלמה כדי לצלם תמונה. לאחר מכן שמור את התמונה כקובץ .vsi באמצעות השם המתאים בתיקיה המעניינת.
- הנח את לוח סיכוך תאורת הסביבה כדי לכבות את אור ה- LED, שנה למסנן עבור עירור B, בחר שיטת תצפית 488 בסרגל הכלים, פתח תריס, צלם תמונה על ידי לחיצה על לחצן תצלום בזק, סגור תריס ולאחר מכן שמור קובץ כמתואר לעיל.
- חזור על כך עם מסנן לעירור G באמצעות שיטת התצפית המתאימה (אדום טקסס או CY3). לאחר מכן חזור על כל ההליך עבור כל באר של עניין.
- להחזיר את הצלחת לאינקובטור 5% CO2 ב 37 ° C ולתרבת אותו כמתואר לעיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הבחנו בהצלחה BD-PSCs אנושיים לתאי אב אנדודרם / כבד והפטוציטים על ידי יישום פרוטוקול דו-שלבי. שינויים מורפולוגיים במהלך תהליך התמיינות הכבד מוצגים באיור 1. BD-PSCs מתמיינים להפטוציטים שעוברים שלושה שלבים שונים. השלב הראשון מייצג את ההתמיינות לתאים אנדודרמליים L4, השני, התמיינות לתאי אב כבדיים (הפטובלסט) L8, המציגים מורפולוגיה מצולעת טיפוסית, והשלישי, הבשלה להפטוציטים L15-L24.
ניתוח אימונופלואורסנציה בוצע כדי לאשר את התמיינות הכבד של BD-PSCs כפי שמוצג באיור 2. ביטוי חזק של אנדודרם / סמן אב כבד אנושי, כמו אלפא-חלבון עוברי (AFP), חלבון פלזמה מרכזי בסרום עוברי שריכוזו נמוך מאוד באורגניזמים בוגרים ולכן נחשב סמן לקודמן15 של הפטוציטים וטרנסתירטין (TTR), חלבון קושר הורמוני בלוטת התריס העיקרי המעורב בהובלת תירוקסין מזרם הדם למוח16 נמצאים בתאים בשלב הראשון של תהליך התמיינות הכבד ב L4 עד L8. עם זאת, הביטוי שלהם פוחת ב L15, בעוד ביטוי של אלבומין (ALB), חלבון פלזמה הנפוץ ביותר המיוצר בעיקר על ידי הכבד קריטי לחלוטין עבור התמיינות הכבד, כמו גם פקטור גרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF-4α), גורם שעתוק hepatocytes המעורב ביטוי של גנים ספציפיים לכבד17 מופיע לראשונה ב-L4, עולה לאורך זמן ההתמיינות L4-L15 ומגיע לביטוי חזק ויציב בזמן ההתבגרות L15-L24.
ציטוקרטין 18 (CK18) הוא חלבון ציטו-שלד, אחד המרכיבים העיקריים של חוט הביניים המתבטא בכבד18. התוצאות מראות כי, כצפוי, ביטוי CK18 נמצא בקורלציה עם הפטוציטים בוגרים (L15-L24), והוא אינו מתבטא בתאי אב של הפטוציטים.
הפרוטוקול המוגדר היטב להתמיינות הפטוציטים בתרביות דו-ממדיות מאפשר הנדסה של תרביות תלת-ממדיות בכבד החל מ-BD-PSCs.
אנו מראים כאן כי צבירה ספונטנית של תאים אלה בלוחות התקשרות נמוכים המכילים תווך השראה/הבשלה של הפטוציטים מתחילה היווצרות ספרואידים. מסלול הגדילה לווה בתאי הדמיה ב-L2, L4 ו-L7. (איור 3A) קיים מתאם עקבי בין נפח הספרואיד לבין מספר התאים המשתנה, כפי שמוצג באיור 3B.
הכבד הוא איבר שבו רוב התרופות בגוף האדם לקבל מטבוליזם. ציטוכרום P450 היא משפחת אנזימים (מונואוקסיגנאזות) שהם בעלי חשיבות מכרעת בתהליכים של מטבוליזם של תרופות ותאי, ניקוי רעלים מקסנוביוטיקה והומאוסטזיס. כדי להעריך את הפעילות התפקודית הפוטנציאלית של ספרואידים בכבד שמקורם ב-BD-PSCs, ניתחנו את הביטוי של אנזימים לחילוף חומרים של תרופות כמו CYP3A4 ו-CYP2E1, חברים במשפחות CYP3 ו-CYP219.
רוב התרופות המשמשות כיום כולל קודאין, ציקלוספורין A, אריתרומיצין, אצטמינופן ודיאזפם, כמו גם סטרואידים ומסרטנים רבים, עוברים מטבוליזם עקב פעילותו של אנזים CY3A420. CYP2E1 מעורב בחילוף החומרים של מצעים אנדוגניים כמו אתילן גליקול, בנזן, פחמן טטרכלוריד, ובמיוחד התרכובת המוטגנית החשובה ביותר כמו ניטרוזאמין21.
הספרואידים שנוצרים ומובחנים בהתאם לפרוטוקול ב-D14, חיים מוכתמים בנוגדנים לשני האנזימים האלה, חושפים את הפעילות התפקודית הפוטנציאלית בכבד של ספרואידים שמקורם ב-BD-PSCs (איור 4).
איור 1: התמיינות של BD-PSCs לתאים דמויי כבד. מיקרוגרפים מייצגים של שינויים מורפולוגיים לאורך התמיינות הכבד של BD-PSCs המראים מורפולוגיה אנדודרמלית L4, או צורה מצולעת L8 מגיעה לבסוף למצב הבשלה ב L15 עד L24. פסי קנה מידה: שורה עליונה 50 מיקרומטר, שורה תחתונה 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניתוח אימונופלואורסנציה של התמיינות מחדש של BD-PSCs לכיוון תאי כבד. אנדודרם / hepatocytes, אב וסמנים ספציפיים hepatocytes באים לידי ביטוי במהלך התמיינות הכבד של BD-PSCs בתרביות דו-ממדיות. בימים L4 עד L8, מיקרוגרפים מראים ירידה בביטוי של אנדודרם / אב הכבד AFP ו TTR בעוד הביטוי שלהם נעלם מ L8-L24. ביטוי סמני הפטוציטים ALB ו-HNFα מופיע ב-L4 ומתגבר במהלך ההתבגרות, בעוד שהביטוי של CK18 הופיע לראשונה ב-L15, והגיע למקסימום ב-L24. פסי קנה מידה עבור גרפים L4-L15: 50 מיקרומטר ועבור L24: 20 מיקרומטר. הבקרה מוצגת בתרשים משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: היווצרות ספרואידים תלת-ממדיים על התמיינות בכבד של BD-PSCs. (A) מספרי תאים משתנים של BD-PSCs החל מ-1 x 106 עד 4000 תאים נזרעו ללוחות התקשרות נמוכים, וההתמיינות בוצעה בהתאם להליך הדו-שלבי כאמור בפרוטוקול. הדור של ספרואידים תלת ממדיים של כבד אנושי צולם בנקודות זמן שונות, מוצגות תמונות ניגודיות פאזה מייצגות בכל פעם במהלך תקופת הזמן של התרבית. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. (B) קטרים של לפחות 4 כדורי כבד לכל גודל נמדדו ב-L4 באמצעות תוכנת הדמיה במיקרוסקופ וחושבו נפחים. קווי שגיאה מציגים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: סמנים תפקודיים של הפטוציטים באים לידי ביטוי בכדורי כבד שמקורם ב-BD-PSCs. BD-PSCs נבדלו להפטוציטים. ניתוח אימונופלואורסצנטי ישיר בוצע על תאים חיים ב- L14 באמצעות נוגדנים ל- ALB, AFP, CK18 ו- CYP2E1 ו- CYP3A4, בני משפחת הציטוכרום P450. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: בקרה שלילית לניתוח אימונופלואורסנציה של התמיינות מחדש של BD-PSCs כלפי תאי כבד. אנדודרם / hepatocytes, אב וסמנים ספציפיים hepatocytes באים לידי ביטוי במהלך התמיינות הכבד של BD-PSCs בתרביות דו-ממדיות. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הכבד הוא איבר מרכזי בגוף האדם עם פונקציות ביולוגיות חיוניות רבות, כגון ניקוי רעלים של מטבוליטים. בשל אי ספיקת כבד חמורה כמו שחמת הכבד ו / או דלקת כבד ויראלית, ישנם כמעט 2 מיליון מקרי מוות בשנה ברחבי העולם. השתלות כבד מדורגות במקום השני בהשתלות איברים מוצקים ברחבי העולם, אך רק כ-10% מהצורך הנוכחי מסופק22.
הפטוציטים אנושיים ראשוניים (PHH) משמשים לעתים קרובות לחקר רעילות הכבד. תאים אלה יכולים להישמר בתרבית לזמן קצר תוך שמירה על תפקודיהם הספציפיים. כמו כן, מספר התאים הזמינים מתורם יחיד מוגבל, בנוסף, תאים אלה לא ניתן להרחיב בתרבית ולכן, המחסור בתורם PHH נותר המכשול העיקרי למחקרי רעילות כבד. PSCs מייצגים מקור התחדשות של רקמות אנושיות וניתן להשתמש בהם ליצירת תרביות כבד תלת-ממדיות11.
מערכות תרבית תלת-ממדיות של הכבד מראות יתרונות מרובים בהשוואה לדו-ממד. זמן התמיינות קצר יותר וחיקוי מדויק של תהליכי in vivo מאפשרים מחקרים מדויקים יותר על רעילות הנגרמת על ידי תרופות, חיזוי טוב יותר של חבות כבד, והם חסכוניים יותר23. תרביות ספרואידים בכבד, בשל התכונה האוטולוגית שלהם, יכולות להוות יתרון גדול על פני הפטוציטים האנושיים הראשוניים (PHH), תוך עקיפת החסרונות הקשורים לשימוש בהם, ועשויות להפוך לתקן זהב ליישום בבדיקת רעילות תרופות ויש להן יישום עתידי פוטנציאלי ברפואה רגנרטיבית.
הוכחנו כאן כי BD-PSCs המופקים מדם היקפי במצב יציב יכולים להתמיין בהצלחה לאבות אנדודרמליים/הפטוציטים/הפטוציטים בוגרים עם הפרשת אלבומין יציבה ויציבות פנוטיפית המבטאת סמני הפטוציטים. יתר על כן, תרביות כדוריות הפטוציטים האנושיות המהונדסות מדגימות את הפעילות התפקודית הפוטנציאלית על ידי ביטוי האנזימים השייכים לציטוכרום P450, כמו CYP3A4 ו- CYP2E1.
השלב החשוב ביותר בפרוטוקול הוא להשיג איכות טובה ומספר MNCs אנושיים טריים לתהליך התכנות מחדש. השימוש ב- MNCs קפואים גורם למספר מופחת של תאים שתוכנתו מחדש.
הנדסנו ספרואידים של כבד אנושי באמצעות תרביות PBMNCs מופעלות עם ובלי יישום מיון אימונומגנטי המפריד תאים מתוכנתים מחדש מתאי דם בוגרים. ההבדל הקל בשימוש בשתי שיטות אלה מסתמך על הצפיפות הגבוהה יותר של מבנה תלת-ממדי בעת שימוש בתאים מטוהרים שתוכנתו מחדש. הביטוי של סמני הפטוציטים נשאר עקבי בשני ההכנות לתרבית תאים.
בשל הזמינות המוגבלת של PHH, השיטה עשויה לייצג את החלופה הקרובה ביותר מבחינה ביולוגית להפטוציטים טריים אוטולוגיים לחקר תפקוד הכבד במבחנה , כמו מטבוליזם קסנוביוטי ורעילות כבד, התערבות פונדקאי-פתוגן, וביולוגיה של התא באופן כללי. האפשרות להשתמש ב- BD-PSCs ברפואה רגנרטיבית תוך היותם אוטולוגיים ולא טרטוגניים היא הנושא של מחקרים נוספים במעבדה שלנו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברת המקבילה מצהירה כי היא בעלת פטנט הקשור לחלבון מקושר GPI אנושי חדש. היא ייסדה ועובדת עם ACA CELL Biotech GmbH. המחברים האחרים מצהירים שאין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
המחברים אסירי תודה במיוחד על הסיוע הטכני שניתן על ידי אוקסנה וג'ון גרינאקר. עבודה זו נתמכה על ידי ACA CELL Biotech GmbH היידלברג, גרמניה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
References
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620 (2019).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, Suppl 1 5-15 (2022).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
- Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , Academic Press. Chapter 13 251-268 (2020).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
- Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
- Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
- Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
- Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).
- Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).
- Crandall, B. F.
- Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
- Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
- Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
- Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).
- Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
- Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S.
- Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).
