Summary
طورت هذه الدراسة طريقة غير جراحية وفي الوقت الفعلي لتقييم توزيع ليجند الموت المبرمج 1 في الجسم كله ، بناء على التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني لمضاد D-dodecapeptide [68Ga]. هذه التقنية لها مزايا على الكيمياء المناعية التقليدية وتحسن كفاءة تحديد المرضى المناسبين الذين سيستفيدون من علاج حصار نقاط التفتيش المناعية.
Abstract
أحدث تطوير علاج حصار نقاط التفتيش المناعية على أساس بروتين موت الخلايا المبرمج 1 (PD-1) / رابط الموت المبرمج 1 (PD-L1) ثورة في علاجات السرطان في السنوات الأخيرة. ومع ذلك ، فإن جزءا صغيرا فقط من المرضى يستجيبون لمثبطات PD-1 / PD-L1 ، بسبب التعبير غير المتجانس ل PD-L1 في الخلايا السرطانية. يمثل عدم التجانس هذا تحديا في الكشف الدقيق عن الخلايا السرطانية من خلال نهج الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) الشائع الاستخدام. يستدعي هذا الوضع طرقا أفضل لتقسيم المرضى الذين سيستفيدون من علاج حصار نقاط التفتيش المناعية ، لتحسين فعالية العلاج. يتيح التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) التصور في الوقت الفعلي لتعبير PD-L1 لكامل الجسم بطريقة غير جراحية. لذلك ، هناك حاجة لتطوير مقتفيات مشعة للكشف عن توزيع PD-L1 في الأورام من خلال التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني.
بالمقارنة مع نظيراتها L ، فإن الببتيدات dextrorotary (D) لها خصائص مثل المقاومة المحللة للبروتين ونصف عمر الأيض المطول بشكل ملحوظ. صممت هذه الدراسة طريقة جديدة للكشف عن تعبير PD-L1 بناء على التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني ل 68ببتيد D-peptide مستهدف PD-L1 ، وهو مضاد D-dodecapeptide (DPA) ، في الفئران الحاملة للورم. أظهرت النتائج أن [68Ga] DPA يمكن أن يرتبط على وجه التحديد بأورام PD-L1 المفرطة في الجسم الحي ، وأظهر استقرارا مواتيا بالإضافة إلى قدرة تصوير ممتازة ، مما يشير إلى أن [68Ga] DPA-PET هو نهج واعد لتقييم حالة PD-L1 في الأورام.
Introduction
كان اكتشاف بروتينات نقاط التفتيش المناعية طفرة في علاج الأورام ، وأدى إلى تقدم كبير في تطوير علاج حصار نقاط التفتيش المناعية1. بروتين موت الخلايا المبرمج 1 (PD-1) وبروتين الموت المبرمج 1 (PD-L1) هما هدفان محتملان للأدوية مع العديد من الأجسام المضادة المعتمدة من قبل إدارة الغذاء والدواء (FDA). يتم التعبير عن PD-1 بواسطة الخلايا المناعية المتسللة إلى الورم ، مثل خلايا CD4 + و CD8 + T والخلايا التائية التنظيمية. PD-L1 هي واحدة من روابط PD-1 ، والتي يتم التعبير عنها بشكل مفرط في مجموعة متنوعة من الخلايا السرطانية 2,3. يؤدي التفاعل بين PD-1 و PD-L1 إلى تعطيل PD-1 ، وبالتالي قمع الاستجابة المناعية المضادة للأورام4. تشير هذه النتائج إلى أن تثبيط PD-L1 يمكن أن يحسن التأثير القاتل للخلايا المناعية ويزيل الخلايا السرطانية5. حاليا ، الكيمياء الهيستولوجية المناعية الكروموجينية (IHC) هي النهج الأكثر استخداما لتحديد المرضى الذين من المرجح أن يستجيبوا للعلاج المناعي عند نقاط التفتيش 6,7. ومع ذلك ، نظرا للتعبير غير المتجانس ل PD-L1 في الخلايا السرطانية ، لا يمكن لنتائج IHC من الخزعات توفير معلومات دقيقة حول تعبير PD-L1 في المرضى8. أفادت الدراسات السابقة أن 20٪ -40٪ فقط من المرضى يحصلون على فوائد طويلة الأجل من علاج حصار نقاط التفتيش المناعية1،9،10. لذلك ، هناك حاجة ملحة لتطوير طريقة جديدة للتحايل على النتائج السلبية الكاذبة الناجمة عن التعبير غير المتجانس لبروتينات نقاط التفتيش المناعية هذه.
تتيح تقنية التصوير الجزيئي ، مثل التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) ، التصور في الوقت الفعلي للجسم كله بطريقة غير جراحية ، وبالتالي يمكن أن تتفوق على طريقة IHC التقليدية11،12،13. الأجسام المضادة ذات العلامات الإشعاعية والببتيدات والجزيئات الصغيرة هي مقتفيات واعدة لمراقبة تعبير PD-L1 في مرضى السرطان14،15،16،17،18،19،20،21،22،23،24،25. وافقت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على ثلاثة أجسام مضادة أحادية النسيلة علاجية PD-L1: أفيلوماب ، أتيزوليزوماب ، ودورفالوماب26. تم توثيق متتبعات التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني المناعي القائمة على هذه الأجسام المضادة جيدا27،28،29،30،31،32. كشفت التجارب السريرية في المراحل المبكرة عن قيمة محدودة للتطبيق السريري ، بسبب الحرائك الدوائية غير المواتية30. بالمقارنة مع الأجسام المضادة ، تظهر الببتيدات خلوصا أسرع للدم والأعضاء من الأعضاء السليمة ، ويمكن تعديلها كيميائيا بسهولة33. تم الإبلاغ عن ببتيدات متعددة ذات صلات عالية ل PD-1 / PD-L12 ؛ WL12 هو ببتيد تم الإبلاغ عنه يظهر ارتباطا محددا ب PD-L134. تم الإبلاغ عن أن المتتبعات ذات العلامات الإشعاعية ، [64Cu] WL12 و [68Ga] WL12 و [18F] FPyWL12 ، تظهر قدرة عالية على استهداف الورم في الجسم الحي ، مما يسمح بحصاد صور عالية الجودة لتعبير PD-L1 في الأورام26،35،36،37. علاوة على ذلك ، أظهر أول تقييم بشري ل WL12 المسمى إشعاعيا أن [68Ga] WL12 (مخلب بواسطة NOTA) لديه إمكانات آمنة وفعالة لتصوير الورم السريري38. نظرا لاحتوائه على نسبة عالية من الكارهة للماء والامتصاص العالي للكبد السليم ، فإن WL12 له استخدام سريري محدود. كما أظهرت ببتيدات الملصقات الإشعاعية الأخرى ، مثل TPP1 و SETSKSF ، والتي ترتبط على وجه التحديد ب PD-L1 ، استقرارا وخصوصية محتملين لتصور تعبير PD-L1 لكامل الجسم39,40. ومع ذلك ، فإن الببتيدات غير المعدلة تتحلل بسهولة بواسطة البروتياز ، ويتم استقلابها بسرعة عن طريق الكلى. تم استخدام الببتيدات Dextrorotary (D) على نطاق واسع كوسطاء فعالين ، بسبب ضعف استقرار الببتيدات اليسرى (L)41،42،43. الببتيدات D شديدة المقاومة للتحلل البروتيني ولها نصف عمر أيضي طويل بشكل ملحوظ. بالمقارنة مع نظيراتها L ، تظهر الببتيدات D في الغالب قدرات ربط محددة44،45،46.
صممت هذه الدراسة طريقة جديدة للكشف عن تعبير PD-L1 ، استنادا إلى تصوير PET لببتيد D المستهدف ب 68Ga ، مضاد D-dodecapeptide (DPA) ، في نموذج فأر حامل للورم47. تمت دراسة استقرار [68Ga] DPA لأول مرة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ومصل الفأر ، وبعد ذلك تم اختبار تقارب الارتباط ل [68Ga] DPA في أورام PD-L1 المفرطة التعبير. بعد ذلك ، تم إجراء التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني في نماذج xenograft للورم الأرومي الدبقي لتأكيد ما إذا كان [68Ga] DPA هو متتبع PET المثالي لمراقبة تعبير PD-L1 في الأورام. لا يوفر الجمع بين التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني و DPA نهجا جديدا للتغلب على التحديات المرتبطة بالتعبير غير المتجانس ل PD-L1 فحسب ، بل يضع أيضا الأساس لتطوير المقتفيات الإشعاعية القائمة على الببتيد D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على إجراءات التجارب على من قبل لجنة أخلاقيات بجامعة نانجينغ الطبية أو المعاهد الوطنية لعلوم وتكنولوجيا الكم. تم إجراء تجارب الفئران بدقة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للجنة رعاية واستخدام المختبر.
1. تخليق الببتيد
- تضخم 100 ملغ من راتنج 4-ميثيل بنزهيديلامين (MBHA) (سعة تحميل 0.37 مليمول / جم) في 1 مل من N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) لمدة 30 دقيقة تحت فقاعات N2 الخفيفة.
- قم بإعداد مخزن احتياطي جديد يتكون من الأحماض الأمينية المحمية من Fmoc (5.0 مكافئ) ، HCTU (4.9 مكافئ) ، و DIPEA (10.0 مكافئ) في 1 مل من NMP ، وأضفه إلى الراتنج (100 مجم). السماح لتفاعل اقتران للمضي قدما لمدة 1.5-2 ساعة.
- قم بإعداد مخزن مؤقت لإزالة الحماية يتكون من 50٪ (حجم / حجم) مورفولين في NMP. اغسل الراتنج (100 مجم) 2 × 30 دقيقة مع 1 مل من المخزن المؤقت لإزالة الحماية في كل غسلة لإزالة مجموعة Fmoc على مجموعة الأمين. اغسل الراتنج بثنائي كلورو الميثان (DCM ؛ 1 مل) لمدة دقيقة واحدة ، وقم بإزالة DCM ، وأعد غسل الراتنج باستخدام NMP (1 مل) لمدة دقيقة أخرى. بعد ذلك ، قم بإزالة NMP وأعد غسل الراتنج باستخدام DCM لمدة 1 دقيقة.
ملاحظة: تتم جميع إجراءات الغسيل تحت فقاعات N2 خفيفة. تتكرر الإجراءات المذكورة أعلاه حتى آخر حمض أميني. - لإضافة 1،4،7،10-رباعي أزاسيكلودوديكان-1،4،7،10-حمض رباعي الخليك (DOTA) إلى الببتيد ، قم بتنشيط DOTA مسبقا باستخدام N- (3-dimethylaminopropyl) -N-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC · حمض الهيدروكلوريك) و N-hydroxysuccinimide (NHS). احتضان مخزون احتياطي DOTA / EDC · HCl / NHS عند نسبة مولية تبلغ 1: 1: 1 في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لمدة 3 ساعات ، مع تركيز DOTA النهائي 1 M. بعد ذلك ، أضف مخزن المخزون المؤقت (1 مل) إلى الراتنج (100 مجم) ، واترك التفاعل يستمر لمدة ساعتين مع فقاعات N2 لطيفة.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام 1،4،7-triazacyclononane-1،4،7-triacetic acid (NOTA) كمخلب لتعقيد 68Ga. يمكن استخدام نفس الإجراءات لاقتران NOTA. - اشطف الراتنج جيدا من الأعلى باستخدام DCM وقم بتطبيق فراغ لإزالة محلول التفاعل المتبقي في وقت واحد. اشطف الراتنج 3x باستخدام DCM (1.5 مل) ، ثم اشطفه باستخدام MeOH (1.5 مل) لتقليص الراتنج. ضع الراتنج تحت النيتروجين طوال الليل ، أو تحت فراغ عال لمدة 4 ساعات على الأقل ، حتى يجف الراتنج.
- ضع راتنج الببتيد المجفف DPA في حاوية بولي بروبيلين سعة 2 مل مع غطاء لولبي. أضف كوكتيل الانقسام المناسب (95 / 2.5 / 2.5 TFA / TIS / H2O في الحجم ؛ 1 مل / 100 مجم راتنج) وأغلق الحاوية بإحكام باستخدام غطاء لولبي. حرك التفاعل برفق على شاكر مداري في غطاء دخان عند 20-25 درجة مئوية لمدة ساعتين.
تنبيه: تحضير حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) في غطاء دخان يرتدي ملابس واقية ، بسبب طبيعته شديدة التآكل. - قم بإزالة معظم TFA عن طريق التبخر تحت النيتروجين في غطاء الدخان. ترسيب الببتيدات بإضافة ثنائي إيثيل الأثير (~ 1.5 مل / 100 ملغ من الراتنج).
- دوامة الخليط لسحن الببتيدات وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة (10000 × جم ، 5 دقائق). صب بعناية المذيب من الحاوية. كرر الخطوات من 1.7 إلى 1.8.
- جفف البقايا في الهواء في الحاوية المفتوحة لمدة 10 دقائق. أضف 50٪ (حجم / حجم) أسيتونيتريل مائي ، ودوامة لمدة 1-2 ثانية لإذابة المنتجات (1 مل / 100 مجم من الراتنج).
- قم بإزالة الراتنج عن طريق تصفية الخليط ، ثم اغسل الراتنج 2x باستخدام 0.2 مل من 50٪ (حجم / حجم) أسيتونيتريل مائي. امزج الترشيحات لتنقية كروماتوغرافيا السائل (HPLC) عالية الأداء. استخدم شروط HPLC التالية. العمود: YMC-Triat-C18 (القطر الداخلي 4.6 مم [i.d.] ، 150 مم ، 5 مم) ؛ تدرج المذيبات: مذيب ماء منزوع الأيونات ؛ مذيب B-acetonitrile (0.1٪ TFA) ؛ وقت التدفق: 20 دقيقة ، مع الأسيتونيتريل من 10٪ إلى 90٪ ؛ معدل التدفق: 1 مل / دقيقة.
- قم بتجميد مواد HPLC المجمعة طوال الليل عند -80 درجة مئوية وجففها بالتجميد (-50 درجة مئوية و <1 باسكال). لوضع العلامات الإشعاعية ، قم بإذابة الببتيد الصلب في محلول أسيتات الصوديوم (100 mM ، pH 5.0) بتركيز نهائي قدره 1 مجم / مل كمخزن مؤقت.
2. 68Ga وضع العلامات الإشعاعية
تم إنشاء NOTE 68Ga داخليا في مستشفى نانجينغ الأول (نانجينغ ، الصين) باستخدام مولد 68Ge / 68Ga.
- ماصة 5 ميكرولتر من مخزن المخزون في حاوية بولي بروبيلين سعة 1.5 مل مع غطاء لولبي. أضف 200 ميجابايت [68Ga]GaCl3 (400 ميكرولتر) إلى الحاوية.
- دوامة الخليط لمدة 5 ثوان. قم بقياس الأس الهيدروجيني باستخدام شرائط اختبار الأس الهيدروجيني. اضبط الرقم الهيدروجيني على 4-4.5 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم (0.1 م).
ملاحظة: الرقم الهيدروجيني المناسب أمر بالغ الأهمية للتعقيد بين 68Ga و DOTA. - احتضان الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق. إخضاع خليط التفاعل ل HPLC الراديوي لتحليل إنتاجية الملصقات الإشعاعية في ظل الظروف التالية: العمود: YMC-Triat-C18 (معرف 4.6 مم ، 150 مم ، 5 مم) ؛ تدرج المذيبات: مذيب ماء منزوع الأيونات ؛ مذيب B-acetonitrile (0.1٪ TFA) ؛ وقت التدفق: 20 دقيقة ، مع الأسيتونيتريل من 10٪ إلى 90٪ ؛ معدل التدفق: 1 مل / دقيقة.
ملاحظة: يمكن استخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة الراديوية (TLC) كنهج بديل لفحص عائد الملصقات الإشعاعية. المخزن المؤقت المقترح لشطف TLC هو 0.1 M Na3C6H5O7 ، الرقم الهيدروجيني 4.
3. اختبار استقرار التتبع
- اختبار استقرار التتبع في PBS
- أضف [68Ga]DPA (10 ميكرولتر ، 3.7 ميجابايت ، في NaOAc) إلى PBS (990 ميكرولتر). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 و 2 و 4 ساعات مع تحريض طفيف.
- اجمع 200 ميكرولتر من المحلول في كل نقطة زمنية. قم بحقنه في الراديو-HPLC للتحليل.
- استقرار التتبع في مصل الماوس
- أضف [68Ga] DPA (10 ميكرولتر ، ~ 3.7 ميجابايت ، في NaOAc) إلى مصل الماوس (90 ميكرولتر ، طازج). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 و 2 و 4 ساعات مع تحريض طفيف.
- اجمع 20 ميكرولتر من المحلول في كل نقطة زمنية. أضف MeCN والماء (100 ميكرولتر ، 1: 1 ، v / v).
- طرد مركزي الخليط لمدة 10 دقائق (5000 × جم ، 25 درجة مئوية). تحليل طاف باستخدام الراديو-HPLC.
4. تحليل تعبير PD-L1 عن طريق قياس التدفق الخلوي
- تحضير وسط الاستزراع عن طريق استكمال وسط RPMI-1640 بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (حجم / حجم) و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين (مجلد / مجلد). إعادة تعليق خلايا U87MG في وسط الاستزراع ، والبذور في 12 لوحة بئر بكثافة 105 خلايا / بئر. ضع الخلايا في حاضنة (5٪ CO2 ، 37 درجة مئوية) ، واستزرع لمدة 24 ساعة على الأقل دون إزعاج.
- اغسل الخلايا ب 0.5 مل من PBS وأضف 250 ميكرولتر من التربسين-EDTA (0.25٪). ضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة (5٪ CO2 ، 37 درجة مئوية) لمدة دقيقتين.
- أضف 1 مل من وسط الثقافة لوقف تفكك الخلية. أضف وسطا إلى الخلايا لفصلها عن الأطباق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل وجمعها في أنابيب سعة 1.5 مل. أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق (100 × غرام).
- قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق (100 × جم). كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
- قم بتخفيف الجسم المضاد PD-L1 المترافق بالفلوريسئين إيزوثيوسيانات (FITC) مع 3٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) إلى 20 نانومول / لتر. أضف إلى الخلايا واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق (100 × غرام) ، تليها الغسيل مع برنامج تلفزيوني بارد مرتين. تحليل الخلايا الإيجابية PD-L1 باستخدام مقياس التدفق الخلوي وبرنامج التحليل.
5. الكيمياء المناعية
- قم بزرع خلايا U87MG في أطباق زراعة الخلايا ذات القاع الزجاجي (35 مم) بكثافة 2.5 × 105 خلايا لكل بئر. عند الوصول إلى التقاء 60٪ ، قم بنضح وسط الثقافة وإضافة 1 مل من PBS. يهز بلطف عدة مرات ونضح. نفذ خطوة الغسيل 3x.
- أضف 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد إلى الأطباق. ضع الخلايا في درجة حرارة الغرفة وثبتها لمدة 30 دقيقة.
- اغسل الخلايا 3x باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 1 مل من 3٪ BSA (بالوزن / المجلد ، في PBS) واحظر الخلايا الثابتة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة 3٪ BSA واحتضان الخلايا مباشرة بالجسم المضاد الأولي المضاد PD-L1 (mAb ، 1: 100 ، مخفف في 3٪ BSA) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: بعد سد الخلايا باستخدام BSA ، لا تغسل باستخدام برنامج تلفزيوني. - اغسل الخلايا 3x باستخدام 3٪ عازلة BSA. احتضان الخلايا بجسم مضاد ثانوي IgG Fc مترافق ضد الإنسان (1: 500 ، مخفف في PBS) لمدة ساعة واحدة.
- اغسل الخلايا 3x باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 0.5 مل من DAPI (1 ميكروغرام / مل) إلى الخلايا واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. اغسل الخلايا الملطخة 3x باستخدام برنامج تلفزيوني ، ولاحظ باستخدام مجهر مضان متحد البؤر.
6. تجربة الامتصاص والتثبيط الخلوي
- تجربة الامتصاص الخلوي
- استزرع خلايا U87MG في 12 لوحة بئر حتى يتم الوصول إلى التقاء 80٪. إزالة الوسط وغسل الخلايا مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني.
- خفف [68Ga] DPA في وسط جديد إلى تركيز 74 كيلو بكريل / مل. أضف 0.5 مل من المخزن المؤقت المخفف [68Ga] DPA إلى كل بئر.
- احتضان الخلايا ب [68Ga] DPA عند 37 درجة مئوية لفترات مختلفة (10 و 30 و 40 و 120 دقيقة). نضح الوسيط باستخدام ماصة. اغسل الخلايا باستخدام PBS (0.5 مل) ثلاث مرات.
- أضف محلول هيدروكسيد الصوديوم (0.5 م ، 300 ميكرولتر لكل بئر) لتحلل الخلايا. بعد 30 ثانية ، اجمع الخلايا اللزجة المحللة في أنابيب سعة 1.5 مل.
- اغسل الطبق ب 0.4 مل من برنامج تلفزيوني مرتين. اجمع محلول الغسيل في الأنبوب أعلاه سعة 1.5 مل.
- بدء تشغيل الكمبيوتر المدمج في عداد جاما التلقائي ؛ ضع الأنابيب في الرف المدمج. بعد تحميل جميع العينات على الناقل ، اضغط على زر START. يتم حساب النتائج في البرنامج الداخلي. تسجل القراءة الأعداد المرتبطة بالاضمحلال في الدقيقة (CPM) لكل أنبوب.
- مقايسة الربط التنافسي
- استزرع خلايا U87MG في 12 لوحة بئر حتى يتم الوصول إلى التقاء 80٪. إزالة الوسط وغسل الخلايا مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني.
- خفف [68Ga] DPA في وسط جديد إلى تركيز 74 كيلو بكريل / مل. قم بإذابة كمية مناسبة من مركبات BMS202 في 10٪ DMSO لإنتاج تركيز 10 mM (400 μL).
- تمييع 4 ميكرولتر من 10 mM BMS202 في 396 ميكرولتر من PBS للحصول على تركيز 100 ميكرومتر. كرر هذه الخطوة للحصول على تركيزات مختلفة من BMS202 (1 ميكرومتر ، 10 نانومتر ، 100 بميلي متر ، و 1 ميكرومتر).
- أضف 0.5 مل من المخزن المؤقت المخفف [68Ga] DPA إلى كل بئر (0.37 ميجابايت لكل بئر). أضف 5 ميكرولتر من محاليل BMS202 لكل بئر (ثلاثة آبار لكل تركيز). احتضان الخلايا في حاضنة الخلايا على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة.
- نضح الوسيط باستخدام ماصة. اغسل الخلايا ب 3 × 0.5 مل من برنامج تلفزيوني.
- أضف محلول هيدروكسيد الصوديوم (0.5 م ، 300 ميكرولتر لكل بئر) لتحلل الخلايا. بعد 30 ثانية ، اجمع الخلايا اللزجة المحللة في أنابيب سعة 1.5 مل. اغسل الطبق ب 2 × 0.4 مل من برنامج تلفزيوني.
- اجمع محلول الغسيل في الأنبوب أعلاه سعة 1.5 مل. ضع الأنابيب في الرف المدمج في عداد جاما التلقائي.
- اتبع نفس الإجراءات الواردة في الخطوة 6.1.6.
7. التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني
ملاحظة: قم بإجراء تصوير PET للحيوانات الصغيرة ، باستخدام ماسح ضوئي PET صغير يوفر 159 قسما محوريا عرضيا متباعدا بمقدار 0.796 مم (من المركز إلى المركز) ، مع مجال رؤية أفقي يبلغ 10 سم ومجال رؤية محوري يبلغ 12.7 سم. يتم تنظيم جميع البيانات التي تم جمعها في وضع القائمة في sinograms ثلاثية الأبعاد. ثم يتم إعادة تجميع فورييه في سينوغرامات ثنائية الأبعاد (الإطار × دقيقة: 4 × 1 ، 8 × 2 ، 8 × 5).
- استخدم ذكور الفئران العارية BALB / C البالغة من العمر 5-8 أسابيع في هذه الدراسة. اجمع خلايا U87MG باتباع الخطوات 4.1-4.4 ونضح الخلايا في حقنة سعة 0.5 مل. حقن الخلايا تحت الجلد في الفئران (1 × 106 خلايا لكل ورم ، ورمان لكل فأر). مراقبة نمو الورم بعد الحقن حتى حجم الورم هو 100-300 مم3.
- تخدير الفئران باستخدام 1٪ -2٪ (v / v) isoflurane (1 مل / دقيقة). قم بتشغيل جهاز التسخين واحتفظ بسرير PET عند 37 درجة مئوية.
- ضع الفئران المخدرة في الموضع الصحيح على سرير في آلة PET. ضع مرهم العيون على كلتا العينين لمنع الجفاف.
تنبيه: احتفظ بالفئران في وضعية الانبطاح لتجنب الموت أثناء المسح. أثناء عملية التصوير بأكملها، يتم تطبيق تدفق الأيزوفلوران (1.0 مل/دقيقة) عبر الأنف باستخدام أنبوب مثبت مسبقا. - اضبط موضع سرير عبر لوحة التحكم. حقن المقتفيات (10-17 ميجابايت / 100-200 ميكرولتر) عن طريق الوريد من خلال قسطرة الوريد الخلفي المثبتة مسبقا.
- إنشاء سير عمل مسح ضوئي في كمبيوتر مضيف باستخدام البرنامج المشار إليه (انظر جدول المواد) إنشاء مجلد دراسة وتعيين بروتوكول الاستحواذ وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. إجراء عمليات مسح ديناميكية (60 دقيقة لكل ماوس) على جميع الفئران في وضع قائمة 3D.
- حدد بروتوكول الرسم البياني وبروتوكول إعادة البناء باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. استخدم مرشح Hanning مع قطع Nyquist من 0.5 دورة / بكسل لإعادة بناء الصور الديناميكية PET (25-30 دقيقة و 55-60 دقيقة) من خلال الإسقاط الخلفي المصفى. قم بإنشاء صور إسقاط أقصى كثافة (MIP) لجميع الفئران.
- دمج البروتوكولات في سير عمل وتشغيل سير العمل. قم بتحليل الصور ثلاثية الأبعاد الناتجة باستخدام البرنامج ، باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
ملاحظة: استخدم برنامج المحاكاة لتحديد وحدات التخزين ذات الأهمية. يتم تصحيح النشاط الإشعاعي إلى وقت الحقن ويتم تقديمه كنسبة مئوية من إجمالي جرعة الحقن / لكل غرام من الأنسجة (٪ ID / g).
8. التوزيع الحيوي خارج الجسم الحي
- تطبيق [68Ga]DPA (1.85 ميجابايت كريل/100 ميكرولتر) للفئران العارية الحاملة ل U87MG BALB/C من خلال حقن وريد الذيل. تخدير الفئران باستخدام 1٪ -2٪ (v / v) isoflurane (1 مل / دقيقة) ، ثم التضحية بثلاثة فئران عن طريق خلع عنق الرحم بعد الحقن لمدة 5 و 30 و 60 و 120 دقيقة.
ملاحظة: يجب تدريب الأفراد الذين يظهرون هذا الإجراء على المهارات التقنية لخلع عنق الرحم لضمان فقدان الوعي بسرعة. سيضمن ذلك إجراء جميع إجراءات القتل الرحيم في هذه التجربة بشكل إنساني. - بعد تأكيد الموت ، افتح جدار الصدر للفئران. ثم افتح القلب. استخدام حقنة 1 مل لسحب الدم. ضغط الدم من المحقنة في أنبوب المقايسة المناعية الإشعاعية (RIA) (قطره 13 مم) لعداد جاما.
- استئصال الأعضاء والأورام الرئيسية ووضعها في أنابيب RIA (قطرها 13 مم) لعداد جاما. تشمل الأعضاء الرئيسية الدم الكلي والقلب والغدة الصعترية والكبد والطحال والعظام والمعدة والكلى والعضلات والعقدة الليمفاوية المعوية والأمعاء الدقيقة والبنكرياس والخصية والدماغ والرئتين. تزن جميع الأعضاء.
- قم بقياس النشاط الإشعاعي داخل الأعضاء التي تم جمعها باستخدام عداد autogamma وتصحيح القيم. احسب النسبة المئوية للجرعة المحقونة لكل جرام من الأنسجة الرطبة (٪ ID / g).
9. الكيمياء الهيستولوجية المناعية
- جمع أنسجة الورم الدبقي وغسلها 3x مع برنامج تلفزيوني. ضع المناديل الطازجة في 4٪ بارافورمالدهيد وثبت طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- قم بتضمين الأنسجة الثابتة في البارافين وقسمها بسمك 10 ميكرومتر. ضع الأقسام في حاضنة (60 درجة مئوية) واحتضانها لمدة 2 ساعة. قم بإزالة الشمع وترطيب الأقسام عن طريق الحضانة لمدة 10 دقائق لكل منها في ما يلي: زيلين (مرتين) ، كحول مطلق ، 95٪ كحول ، 90٪ كحول ، 80٪ كحول ، 75٪ كحول.
- ضع المقاطع في 0.01 متر سترات الصوديوم وقم بتسخينها إلى 92-95 درجة مئوية. الحفاظ على درجة الحرارة لمدة 40 دقيقة لتحقيق استرجاع المستضد.
- أضف 200 ميكرولتر من محلول H2O2 (3٪) إلى الأقسام وقم بتعطيل إندوبيروكسيديز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. سد المواقع غير المحددة عن طريق العلاج بنسبة 3٪ BSA لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان الأقسام في الجسم المضاد الأولي المضاد ل PD-L1 (mAb ، 1: 100 ، مخفف في 3٪ BSA) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: بعد الحظر باستخدام BSA ، لا تغسل باستخدام برنامج تلفزيوني. - اغسل الأقسام 3x باستخدام برنامج تلفزيوني. احتضان الأقسام بجسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب يسمى HRP (1: 500 ، مخفف في PBS) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
- اغسل الخلايا 3x باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 200 ميكرولتر من محلول العمل 3،3-ديامينوبنزيدين (DAB) (المحلول أ: المحلول ب: المحلول ج = 1: 1: 18) إلى الأقسام واحتضانها لمدة 5 دقائق في الظلام.
- اغسل الأقسام 3x باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 500 ميكرولتر من محلول الهيماتوكسيلين (100٪) ، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الأقسام بالماء لمدة 30 ثانية. ضع الأقسام في محلول التمايز (75٪ كحول: HCL = 99: 1) لمدة 30 ثانية. اغسل الأقسام باستخدام الماء لمدة 1 دقيقة.
- قم بتجفيف العينات عن طريق الحضانة بالتتابع بنسبة 75٪ كحول ، و 80٪ كحول ، و 90٪ كحول ، و 95٪ كحول ، وكحول مطلق ، وزيلين (مرتين) (10 دقائق لكل منهما). قم بتركيب جميع الأقسام باستخدام راتنج محايد وراقبها تحت المجهر الضوئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
[68Ga] DPA وضع العلامات الإشعاعية والاستقرار
نموذج الببتيد ، DPA ، هو مضاد PD-L1 فعال. تم الحصول على DOTA-DPA بنقاوة >95٪ وعائد 68٪. لوحظت كتلة DOTA-DPA تجريبيا عند 1,073.3 ([M + 2H] 2+). 68يعتبر الغاليوم نويدات مشعة مناسبة لتسمية الببتيدات للتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني ، وبالتالي تم اختياره لهذه الدراسة. إلى التسمية الإشعاعية DPA مع 68Ga (عمر النصف: 68 دقيقة) ، تم تصنيع DOTA-PEG3-DPA (الشكل 1A). تم استخدام DOTA كمخلب لوضع العلامات الإشعاعية 68Ga. لفضاء DOTA و DPA ، تم استخدام PEG3 كرابط. أظهر [68Ga]-DOTA-PEG3-DPA (المشار إليه باسم [68Ga] DPA في النص التالي) إنتاجية كيميائية إشعاعية عالية (>95٪) ونقاء كيميائي إشعاعي (>95٪) (الجدول 1). كما تم إجراء اختبار استقرار التتبع باستخدام HPLC ، وأظهرت النتائج أن [68Ga] DPA كان لديه استقرار كبير في كل من PBS ومصل الفأر. لم يتم الكشف عن تحلل 68Ga أو التحلل المائي للببتيد بعد حضانة لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية (الشكل 1B).
التعبير عن PD-L1 في خلايا U87MG
أظهرت دراسة سابقة أن زيادة التعبير عن PD-L1 يرتبط بضعف بقاء المريض في أورام الورم الأرومي الدبقي ، مما يشير إلى أن PD-L1 قد يكون علامة حيوية تنبؤية ملحوظة وهدفا علاجيا في الورم الأرومي الدبقي48. لذلك ، تم استخدام خط خلايا الورم الأرومي الدبقي البشري ، U87MG ، لإنشاء نموذج ورم لتحديد فعالية [68Ga] DPA في PET / CT لتصوير الورم PD-L1. أشارت نتائج قياس التدفق الخلوي إلى أن ما يقرب من 60٪ من خلايا U87MG كانت إيجابية PD-L1 (الشكل 2A). علاوة على ذلك ، أكد التلوين المناعي التعبير القوي ل PD-L1 في خلايا U87MG (الشكل 2B). معا ، أظهرت هذه البيانات أن خط خلية U87MG كان مناسبا لهذه الدراسة.
الامتصاص الخلوي وخصوصية [68Ga] DPA
قدم امتصاص [68Ga] DPA بواسطة خلايا U87MG نمطا يعتمد على الوقت. عندما تم استخدام مثبط PD-L1 ، BMS202 ، كعامل مانع ، تم تقليل جزء الربط وامتصاص [68Ga] DPA بشكل كبير (الشكل 3 أ). فحص اختبار الربط التنافسي كذلك تقارب الارتباط (Ki) ل BMS202 بخلايا U87MG. كان تقارب الارتباط المقدر 43.8 ± 8.6 نانومول / لتر ل BMS202 عندما تم استخدام [68Ga] DPA كمنافس (الشكل 3 ب).
[68Ga] تصوير DPA PET لنماذج الورم
تم إجراء التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني ل [68Ga] DPA في الفئران العارية الحاملة للورم BALB / C. [68جا] تم إعطاء DPA عن طريق الحقن في الوريد حتى نما ورم U87MG إلى 100 مم3. كشفت صور التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني لكامل الجسم عن تراكم مرتفع [68Ga] DPA في الورم بعد 30 و 60 دقيقة من الحقن ، وأظهرت أعلى تراكم في الكلى والمثانة (الشكل 4 أ). لتأكيد ما إذا كان [68Ga] DPA المتراكم على وجه التحديد في الأورام الإيجابية PD-L1 ، تم استخدام نموذج فأر آخر يحمل خط خلية PanNET Bon-1 كعنصر تحكم سلبي. أظهرت تجربة موازية القليل من تراكم [68Ga] DPA في أورام Bon-1 بعد 60 دقيقة من الحقن (الشكل 4B).
لتوضيح هذا الاختلاف ، تم إجراء تلطيخ كيميائي مناعي لتحليل تعبير PD-L1 في أنسجة الورم. كشفت النتائج أن خلايا U87MG قدمت تعبيرا كبيرا عن PD-L1 (الشكل 5A ، C) ، ولكن ليس ورم Bon-1 (الشكل 5B ، C). كانت هذه البيانات متسقة مع نتائج PET. لذلك ، من الممكن أن تؤدي حالات نمو الخلايا السرطانية المختلفة إلى تعبير PD-L1 مختلف (على سبيل المثال ، نخر الأنسجة). للتحقق من ذلك ، تم إجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E). كما هو متوقع ، لوحظ مورفولوجيا خلية مماثلة بين نسيجي الورم (الشكل 5D).
التوزيع الحيوي خارج الجسم الحي ل [68Ga] DPA في أورام U87MG
كما أجريت دراسة التوزيع الحيوي خارج الجسم الحي باستخدام الفئران الحاملة ل U87MG (الجدول 2). أظهرت النتائج خلوصا سريعا في الدم ومعظم الأعضاء التي تم تحليلها ، بما في ذلك القلب والكبد والرئة والعضلات. تراكمت الكلى أعلى قدر من النشاط الإشعاعي وأظهرت معدل تصفية 0.12٪ ID / (g∙min) من 5 دقائق إلى 120 دقيقة. أظهر الورم امتصاصا لثاني أعلى امتصاص للتتبع في جميع النقاط الزمنية. بالإضافة إلى ذلك ، من 5 دقائق إلى 60 دقيقة بعد الحقن ، قدم الورم معدل إزالة تتبع أقل بنسبة 0.027٪ ID / (g∙min). بالنسبة للدم ، كان معدل التصفية 0.069٪ ID / (g∙min) ، بينما بالنسبة للعضلات ، كان معدل التصفية 0.037٪ ID / (g∙min).
الشكل 1: [68Ga] DPA وضع العلامات الإشعاعية والاستقرار. (أ) التركيب الكيميائي ل [68Ga] DPA والتمثيل التخطيطي لارتباطه بالخلايا السرطانية التي تعبر عن PD-L1. (ب) منحنيات HPLC تظهر النشاط الإشعاعي ل [68Ga] DPA بعد الحضانة باستخدام PBS أو مصل الفأر لمدة 0.5 و 2 و 4 ساعات. تم تعديل هذا الرقم من Hu et al.47. الاختصارات: DPA = مضاد دوديكاببتيد ؛ PD-L1 = ليجند الموت المبرمج 1 ؛ PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ HPLC = كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التعبير عن PD-L1 في خط الخلية U87MG. (أ) تم قياس تعبير PD-L1 في خط الخلية U87MG من خلال تحليل قياس التدفق الخلوي. (ب) تم قياس التعبير عن PD-L1 في خلايا U87MG بواسطة مقايسة تلطيخ التألق المناعي. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من Hu et al.47. الاختصارات: PD-L1 = الموت المبرمج يجند 1 ؛ SSC = مبعثر جانبي ؛ FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: امتصاص الخلايا وتثبيط [68Ga] DPA. (أ) امتصاص خلايا U87MG عند حضنها ب [68Ga] DPA (0.74 MBq / mL) أو [68Ga] DPA (0.74 MBq / mL) + BMS202 (100 μmol / L) لفترات مختلفة. (ب) الربط التنافسي ل [68Ga] DPA (0.74 MBq / mL) لخلايا U87MG بعد الحضانة باستخدام BMS202. تظهر قيمة Ki في اللوحة. تم تعديل هذا الرقم من Hu et al.47. الاختصارات: DPA = مضاد دوديكاببتيد ؛ ٪ AD = الجرعة المعطاة (فيما يتعلق بالجزء الملزم). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تصوير التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني ل [68Ga] DPA في أورام U87MG المفرطة في التعبير PD-L1. (أ ، ب) صور PET-CT تظهر توزيع [68Ga] DPA في الفئران الحاملة ل U87MG (A) والفئران الحاملة ل Bon-1 (التحكم السلبي ، B) بعد الحقن في الوريد (~ 18.5 ميجابايت) لمدة 30 دقيقة و 60 دقيقة. يتم عرض الإسقاط التمثيلي لشدة الحد الأقصى (MIP) (اللوحة العلوية) وصور PET-CT المستعرضة (اللوحة السفلية). تتميز مواضع الورم بدوائر بيضاء متقطعة. تم تعديل هذا الرقم من Hu et al.47. الاختصارات: DPA = مضاد دوديكاببتيد ؛ PD-L1 = ليجند الموت المبرمج 1 ؛ PET-CT = التصوير المقطعي المحوسب بالإصدار البوزيتروني ؛ MIP = إسقاط شدة الحد الأقصى ؛ p.i. = بعد الحقن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التحليل الكيميائي المناعي للأورام المعالجة ب [68Ga] DPA. (أ، ب) صور كيميائية مناعية كاملة المقطع ل PD-L1 في (A) U87MG و (B) أورام Bon-1. (ج) صور مكبرة للمناطق المحددة في A و B. (د) تلطيخ H&E لورم U87MG و Bon-1. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر (C ، D). تم تعديل هذا الرقم من Hu et al.47. الاختصارات: DPA = مضاد دوديكاببتيد ؛ PD-L1 = ليجند الموت المبرمج 1 ؛ H&E = الهيماتوكسيلين ويوزين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| أدوات التتبع | [68جا] د ب أ |
| العائد الكيميائي الإشعاعي (٪) | >95 |
| النشاط المولي (GBq μmol-1) | 37 ± 8 |
| النقاء الكيميائي الإشعاعيأ (٪) | >95 |
الجدول 1: وضع العلامات الإشعاعية ومراقبة الجودة ل [68Ga] DPA. العائد الكيميائي الإشعاعي والنشاط المولي والنقاء الكيميائي الإشعاعي ل [68Ga] DPA. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SD (n = 7). تم تعديل هذا الجدول من Hu et al.47. اختصار: DPA = مضاد دوديكاببتيد. أتم تحليل النقاء الكيميائي الإشعاعي ل [68Ga] DPA بواسطة HPLC في الطور العكسي في ظل ظروف محسنة: 1) العمود: YMC-Triat-C18 (4.6 مم معرف ، 150 مم ، 5 مم) ؛ 2) تدرج المذيبات: المذيبات A- الماء منزوع الأيونات ؛ مذيب B-acetonitrile (0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك) ؛ وقت التدفق: 20 دقيقة ، مع الأسيتونيتريل من 10٪ إلى 90٪ ؛ معدل تدفق 1 مل / دقيقة.
| [68جا] د ب أ | ||||||||
| 5 دقائق | 30 دقيقة | 60 دقيقة | 120 دقيقة | |||||
| دم | 3.89 | ±0.43 | 1.55 | ±1.07 | 0.11 | ±0.02 | 0.05 | ±0.01 |
| قلب | 1.19 | ±0.39 | 0.52 | ±0.33 | 0.06 | ±0.02 | 0.05 | ±0.02 |
| كبد | 1.06 | ±0.26 | 0.59 | ±0.43 | 0.19 | ±0.02 | 0.16 | ±0.04 |
| طحال | 0.98 | ±0.14 | 0.68 | ±0.67 | 0.14 | ±0.06 | 0.09 | ±0.03 |
| رئة | 1.64 | ±0.42 | 1.03 | ±0.9 | 0.13 | ±0.05 | 0.09 | ±0.02 |
| كلية | 19.23 | ±1.95 | 16.13 | ±1.51 | 11.5 | ±0.44 | 5.2 | ±0.31 |
| معدة | 1.54 | ±0.1 | 0.61 | ±0.35 | 0.08 | ±0.01 | 0.08 | ±0.03 |
| معوي | 0.72 | ±0.27 | 0.47 | ±0.35 | 0.08 | ±0.02 | 0.06 | ±0.03 |
| بنكرياس | 1.88 | ±0.28 | 0.77 | ±0.75 | 0.16 | ±0.03 | 0.13 | ±0.03 |
| عضل | 2.21 | ±0.27 | 0.71 | ±0.37 | 0.18 | ±0.02 | 0.14 | ±0.04 |
| عظم | 2.18 | ±0.11 | 0.85 | ±0.51 | 0.26 | ±0.09 | 0.14 | ±0.06 |
| دماغ | 0.19 | ±0.04 | 0.11 | ±0.08 | 0.03 | ±0.01 | 0.02 | ±0.01 |
| ورم | 4.5 | ±0.32 | 3.77 | ±0.27 | 2.99 | ±0.03 | 0.89 | ±0.19 |
| دهن | 2.09 | ±0.49 | 0.81 | ±0.12 | 0.27 | ±0.07 | 0.1 | ±0.07 |
الجدول 2: التوزيع الحيوي ل [68Ga] DPA في الفئران الحاملة للورم U87MG بعد تناوله لفترات مختلفة (n = 3 لكل نقطة زمنية). تم تعديل هذا الجدول من Hu et al.47. اختصار: DPA = مضاد دوديكاببتيد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتضمن الخطوات الحاسمة الموضحة في هذه الطريقة وضع العلامات الفعالة من 68Ga إلى DPA واختيار نافذة زمنية مناسبة لتصوير التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني ، والتي يجب أن تتطابق تماما مع النمط الديناميكي الدوائي ل DPA في الورم.
على عكس IHC ، يتيح التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني الكشف في الوقت الفعلي عن تعبير PD-L1 لكامل الجسم بطريقة غير جراحية ، مما يسمح بتصور كل منطقة إيجابية في ورم غير متجانس 6,7. تم اختيار الببتيدات كروابط لتجنب عيوب الأجسام المضادة والجزيئات الصغيرة. عادة ما يكون للأجسام المضادة ذات الأوزان الجزيئية الكبيرة نصف عمر طويل منتشر ، مما يسبب سمية أعلى للأعضاء السليمة. عادة ما تكون إزالة الجزيئات الصغيرة سريعة جدا لتحقيق الاحتفاظ بالورم المطلوب. يتراوح الوزن الجزيئي للببتيدات بين وزن الأجسام المضادة والجزيئات الصغيرة. وهذا يمكن المقتفيات الإشعاعية القائمة على الببتيد من تحقيق كل من الاحتفاظ بالورم على المدى الطويل واختراق الأنسجة الجيد مع الحد الأدنى من السمية13،49،50،51،52،53. الأهم من ذلك ، أن فائدة D-peptide DPA ، بدلا من الببتيدات L التي يتم الإبلاغ عنها بشكل شائع ، تمنح [68Ga] DPA نصف عمر استقلابي طويل بشكل ملحوظ. علاوة على ذلك ، فإن DPA مشحون إيجابيا ومحبة للماء في الجسم الحي ، وبالتالي يتمتع بقابلية عالية للذوبان ويمكنه تجنب الاستهداف غير المحدد في الدم ، مما يسهل توليد صور PET بجودة تصوير عالية.
والجدير بالذكر أن وضع العلامات الإشعاعية الناجحة 68Ga يتطلب درجة حموضة محددة ولا يوجد تداخل من أيونات المعادن الانتقالية ، مثل كاتيونات النحاس (II) والحديد (III). في بعض الحالات ، يؤدي تلوث النحاس2+ إلى انخفاض العائد الكيميائي الإشعاعي. لذلك ، من الأهمية بمكان التأكد من أن جميع الحاويات وأطراف الماصة غير ملوثة. بالإضافة إلى ذلك ، في هذه الطريقة ، تم استخدام U87MG لتلقيح الورم. على الرغم من أن تعبير PD-L1 في الطعوم الخارجية U87MG تم التحقق منه في الدراسات السابقة ، إلا أن تعبيره يختلف عبر الفردية. لذلك ، اختلف الامتصاص المطلق للمقتفي في أورام U87MG عبر الفئران الفردية. لضمان امتصاص المقتفي الفعال في الأورام ، يجب اختيار ذات حجم الورم المناسب (500 مم3 < الحجم < 100 مم3) لمسح التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني.
أحد قيود [68Ga] DPA هو أن تقارب ربط DPA ب PD-L1 منخفض نسبيا مقارنة بالعديد من الببتيدات الأخرى التي تستهدف PD-L1 ، مثل WL12 ، مما يجعلها غير مناسبة للأورام ذات تعبير PD-L1 المنخفض نسبيا26,47. سيؤدي إجراء مزيد من التعديلات على الببتيد D إلى تحسين قدرته المحددة على الربط. بالإضافة إلى ذلك ، لتعزيز تأثير التصوير ل [68Ga] DPA ، يمكن تحسين صياغة استراتيجية الحقن ، على سبيل المثال ، عن طريق الحقن المتزامن ل DPA غير المسمى قبل [68Ga] DPA لمنع مواقع الربط غير المحددة54،55،56.
في الختام ، طورت هذه الدراسة طريقة غير جراحية وفي الوقت الفعلي لتتبع توزيع PD-L1 في الجسم الكامل للحيوانات الحية باستخدام [68Ga] DPA كمتتبع إشعاعي. كشفت النتائج عن تقارب ارتباط محدد مرتفع نسبيا في الجسم الحي ، واستقرار موات ، وقدرة تصوير ممتازة تبلغ [68Ga] DPA ، مما يشير إلى أن [68Ga] DPA-PET هو نهج واعد لتصور أورام PD-L1 المفرطة في التعبير. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تطبيق هذه التقنية على علاج الأورام الإيجابية PD-L1 عند وضع علامات على DPA مع النويدات المشعة الأخرى ، مثل 177Lu و 225Ac. لذلك ، فإن تقنية وضع العلامات الإشعاعية DPA لا تتغلب فقط على قيود التشخيص المعتمد على IHC ، ولكنها توفر أيضا خيارا جديدا للعلاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لم يتم الإعلان عن أي مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من قبل صندوق معهد البحوث المركزي غير الربحي التابع للأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (رقم 2022-RC350-04) وصندوق CAMS للابتكار للعلوم الطبية (أرقام 2021-I2M-1-026 و 2022-I2M-1-026-1 و 02120101 و 02130101 و 2022-I2M-2-002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) | Merck | 60239-18-1 | 68Ga chelation |
| 3,3-diaminobenzidine (DAB) Kit | Sigma-Aldrich | D7304-1SET | Immunohistochemistry |
| anti-PD-L1 monoclonal antibody | Wuhan Proteintech | 17952-1-ap | Immunohistochemistry: primary antibody |
| BMS202 | Selleck | 1675203-84-5 | Competitive binding assay: inhibitor |
| BSA | Merck | V900933 | Immunofluorescent : blocking |
| DAPI | Merck | D9542 | Immunofluorescent: staining of nucleus |
| Dichloromethane (DCM) | Merck | 34856 | Solvent |
| DIPEA | Merck | 3439 | Peptide coupling |
| EDC·HCl | Merck | E6383 | Activation of DOTA |
| FBS | Gibco | 10099 | Cell culture: supplement |
| FITC-conjugated anti-human IgG Fc Antibody | Biolegend | 409310 | Immunofluorescent: secondary antibody |
| FITC-conjugated anti PD-L1 antibody | Biolegend | 393606 | Flow cytometry: direct antibody |
| HCTU | Energy Chemical | E070004-25g | Peptide coupling |
| HRP labeled goat anti-rabbit antibody | Servicebio | GB23303 | Immunohistochemistry: secondary antibody |
| Hydroxysuccinimide (NHS) | Merck | 130672 | Activation of DOTA |
| MeCN | Merck | PHR1551 | Solvent |
| Morpholine | Merck | 8.06127 | Fmoc- deprotection |
| NMP | Merck | 8.06072 | Solevent |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Fixation of tissues |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture: buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 10378016 | Cell culture: supplement |
| RIA tube | PolyLab | P10301A | As tissue sample container |
| RPMI-1640 medium | Gibco | 11875093 | Cell culture: basic medium |
| Sodium acetate | Merck | 1.06264 | Salt for buffer |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell culture: dissociation agent |
| U87MG cell line | Procell Life Science & Technology Co | CL-0238 | Cell model |
| Equipment | |||
| 68Ge/68Ga generator | Isotope Technologies Munich, ITM | Not applicable | Generation of [68Ga] |
| Autogamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | Detection of radioactivity |
| Confocal fluorescent microscopy | Keyence | Observation of immunofluorescent results | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson, BD | LSRII | Monitoring the PD-L1 positive cells |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | SHIMAZU | LC-20AT | Purification of DPA peptide |
| PET scanner | Siemens Medical Solutions | Inveon MultiModality System | PET imaging |
| Optical microscopy | Nikon | Eclipse E100 | Observation of immunohistochemistry results |
| Solid phase peptide synthesizer | Promega Vac-Man Laboratory Vacuum Manifold | LOT#11101 | Synthesis of DPA-DOTA peptide |
| Software | |||
| ASIPro | Siemens Medical Solutions | Not applicable | Analysis of PET-CT results |
| FlowJo | Becton Dickinson, BD | FlowJo 7.6.1 | Analysis of the flow cytometer results |
| Inveon Acquisition Workplace (IAW) | Siemens Medical Solutions | Not applicable | Management of PET mechine |
| Prism | Graphpad | Prism 8.0 | Analysis of the data |
References
- Doroshow, D. B., et al. PD-L1 as a biomarker of response to immune-checkpoint inhibitors. Natire Reviews Clinical Oncology. 18 (6), 345-362 (2021).
- Krutzek, F., Kopka, K., Stadlbauer, S. Development of radiotracers for imaging of the PD-1/PD-L1 axis. Pharmaceuticals. 15 (6), 747 (2022).
- Topalian, S. L., Drake, C. G., Pardoll, D. M. Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy. Cancer Cell. 27 (4), 450-461 (2015).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Xiao, Z., et al. PEIGel: A biocompatible and injectable scaffold with innate immune adjuvanticity for synergized local immunotherapy. Materials Today Bio. 15, 100297 (2022).
- Teng, M. W. L., Ngiow, S. F., Ribas, A., Smyth, M. J. Classifying cancers based on T-cell infiltration and PD-L1. Cancer Research. 75 (11), 2139-2145 (2015).
- Dolled-Filhart, M., et al. Development of a companion diagnostic for pembrolizumab in non-small cell lung cancer using immunohistochemistry for programmed death ligand-1. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 140 (11), 1243-1249 (2016).
- Meng, X. J., Huang, Z. Q., Teng, F. F., Xing, L. G., Yu, J. M. Predictive biomarkers in PD-1/PD-L1 checkpoint blockade immunotherapy. Cancer Treatment Reviews. 41 (10), 868-876 (2015).
- Hakozaki, T., Hosomi, Y., Kitadai, R., Kitagawa, S., Okuma, Y. Efficacy of immune checkpoint inhibitor monotherapy for patients with massive non-small-cell lung cancer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 146 (11), 2957-2966 (2020).
- Haslam, A., Prasad, V. Estimation of the percentage of US patients with cancer who are eligible for and respond to checkpoint inhibitor immunotherapy drugs. Jama Network Open. 2 (5), 192535 (2019).
- Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S.
- Zhang, L., et al. Recent developments on PET radiotracers for TSPO and their applications in neuroimaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (2), 373-393 (2021).
- Sun, J., et al. Imaging-guided targeted radionuclide tumor therapy: From concept to clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 190, 114538 (2022).
- Xu, M., et al. Preclinical study of a fully human Anti-PD-L1 antibody as a theranostic agent for cancer immunotherapy. Molecular Pharmaceutics. 15 (10), 4426-4433 (2018).
- Niemeijer, A. N., et al. Whole body PD-1 and PD-L1 positron emission tomography in patients with non-small-cell lung cancer. Nature Communications. 9 (1), 4664 (2018).
- Mayer, A. T., et al. Practical immuno-PET radiotracer design considerations for human immune checkpoint imaging. Journal of Nuclear Medicine. 58 (4), 538-546 (2017).
- Lv, G., et al. PET Imaging of tumor PD-L1 expression with a highly specific nonblocking single-domain antibody. Journal of Nuclear Medicine. 61 (1), 117-122 (2020).
- Li, D., et al. Immuno-PET imaging of 89Zr labeled anti-PD-L1 domain antibody. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1674-1681 (2018).
- Lesniak, W. G., et al. PD-L1 detection in tumors using [(64)Cu]Atezolizumab with PET. Bioconjugate Chemistry. 27 (64), 2103-2110 (2016).
- Kristensen, L. K., et al. CD4(+) and CD8a(+) PET imaging predicts response to novel PD-1 checkpoint inhibitor: studies of Sym021 in syngeneic mouse cancer models. Theranostics. 9 (26), 8221-8238 (2019).
- Christensen, C., Kristensen, L. K., Alfsen, M. Z., Nielsen, C. H., Kjaer, A. Quantitative PET imaging of PD-L1 expression in xenograft and syngeneic tumour models using a site-specifically labelled PD-L1 antibody. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 47 (5), 1302-1313 (2020).
- Bensch, F., et al. 89Zr-atezolizumab imaging as a non-invasive approach to assess clinical response to PD-L1 blockade in cancer. Nature Medicine. 24 (12), 1852-1858 (2018).
- Gonzalez Trotter, D. E., et al. In vivo imaging of the programmed death ligand 1 by 18F PET. Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1852-1857 (2017).
- Lv, G., et al. Promising potential of a 18F-labelled small-molecular radiotracer to evaluate PD-L1 expression in tumors by PET imaging. Bioorganic Chemistry. 115, 105294 (2021).
- Miao, Y., et al. One-step radiosynthesis and initial evaluation of a small molecule PET tracer for PD-L1 imaging. Bioorganic & Medicinal Chemical Letters. 30 (24), 127572 (2020).
- Kumar, D., et al. Peptide-based PET quantifies target engagement of PD-L1 therapeutics. The Journal of Clinical Investigation. 129 (2), 616-630 (2019).
- Powles, T., et al. MPDL3280A (anti-PD-L1) treatment leads to clinical activity in metastatic bladder cancer. Nature. 515 (7528), 558-562 (2014).
- Herbst, R. S., et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 515 (7528), 563-567 (2014).
- Marciscano, A. E., Gulley, J. L. Avelumab demonstrates promise in advanced NSCLC. Oncotarget. 8 (61), 102767-102768 (2017).
- Vaddepally, R. K., Kharel, P., Pandey, R., Garje, R., Chandra, A. B. Review of indications of FDA-approved immune checkpoint inhibitors per NCCN guidelines with the level of evidence. Cancers. 12 (3), 738 (2020).
- Antonia, S. J., et al. Durvalumab after chemoradiotherapy in stage III non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 377 (20), 1919-1929 (2017).
- Wang, D. Y., et al. Fatal toxic effects associated with immune checkpoint inhibitors: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 4 (12), 1721-1728 (2018).
- Sgouros, G., Bodei, L., McDevitt, M. R., Nedrow, J. R. Radiopharmaceutical therapy in cancer: clinical advances and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (9), 589-608 (2020).
- (US) M. M. M, et al. Macrocyclic inhibitors of the pd-1/pd-l1 and cd80(b7-1)/pd-l1 protein/protein interactions. United States patent. , US-2017260237-A1 (2014).
- Chatterjee, S., et al. Rapid PD-L1 detection in tumors with PET using a highly specific peptide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 258-263 (2017).
- De Silva, R. A., et al. Peptide-based 68Ga-PET radiotracer for imaging PD-L1 expression in cancer. Molecular Pharmaceutics. 15 (9), 3946-3952 (2018).
- Lesniak, W. G., et al. Development of [18F]FPy-WL12 as a PD-L1 specific PET imaging peptide. Molecular Imaging. 18, 1536012119852189 (2019).
- Zhou, X., et al. First-in-humans evaluation of a PD-L1-binding peptide PET radiotracer in non-small cell lung cancer patients. Journal of Nuclear Medicine. 63 (4), 536-542 (2022).
- Hu, K., et al. Developing native peptide-based radiotracers for PD-L1 PET imaging and improving imaging contrast by pegylation. Chemical Communications. 55 (29), 4162-4165 (2019).
- Liu, H., et al. A novel small cyclic peptide-based 68Ga-Radiotracer for positron emission tomography imaging of PD-L1 expression in tumors. Molecular Pharmaceutics. 19 (1), 138-147 (2022).
- Rabideau, A. E., Pentelute, B. L. A D-amino acid at the N-terminus of a protein abrogates its degradation by the N-end rule pathway. ACS Central Science. 1 (8), 423-430 (2015).
- Uppalapati, M., et al. A potent D-protein antagonist of VEGF-A is nonimmunogenic, metabolically stable, and longer-circulating in vivo. ACS Chemical Biology. 11 (4), 1058-1065 (2016).
- Garton, M., et al. Method to generate highly stable D-amino acid analogs of bioactive helical peptides using a mirror image of the entire PDB. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1505-1510 (2018).
- Jia, F. J., et al. D-amino acid substitution enhances the stability of antimicrobial peptide polybia-CP. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (10), 916-925 (2017).
- Carmona, G., Rodriguez, A., Juarez, D., Corzo, G., Villegas, E. Improved protease stability of the antimicrobial peptide Pin2 substituted with D-amino acids. Protein Journal. 32 (6), 456-466 (2013).
- Feng, Z., Xu, B. Inspiration from the mirror: D-amino acid containing peptides in biomedical approaches. Biomolecular Concepts. 7 (3), 179-187 (2016).
- Hu, K., et al. Whole-body PET tracking of a d-dodecapeptide and its radiotheranostic potential for PD-L1 overexpressing tumors. Acta Pharmaceutica Sinica. B. 12 (3), 1363-1376 (2022).
- Qiu, X. Y., et al. PD-L1 confers glioblastoma multiforme malignancy via Ras binding and Ras/Erk/EMT activation. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1754-1769 (2018).
- Hu, K., et al. Development of a stable peptide-based PET tracer for detecting CD133-expressing cancer cells. ACS Omega. 7 (1), 334-341 (2021).
- Jin, Z. -H., et al. Radiotheranostic agent 64Cu-cyclam-RAFT-c(-RGDfK-)4 for management of peritoneal metastasis in ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 26 (23), 6230-6241 (2020).
- Hu, K., et al. Harnessing the PD-L1 interface peptide for positron emission tomography imaging of the PD-1 immune checkpoint. RSC Chemical Biology. 1 (4), 214-224 (2020).
- Hu, K., et al. PET imaging of VEGFR with a novel 64Cu-labeled peptide. ACS Omega. 5 (15), 8508-8514 (2020).
- Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
- Zhao, J., et al. Concurrent injection of unlabeled antibodies allows positron emission tomography imaging of programmed cell death ligand 1 expression in an orthotopic pancreatic tumor model. ACS Omega. 5 (15), 8474-8482 (2020).
- Moroz, A., et al. A preclinical assessment of 89Zr-atezolizumab identifies a requirement for carrier added formulations not observed with 89Zr-C4. Bioconjugate Chemistry. 29 (10), 3476-3482 (2018).
- Nedrow, J. R., et al. Imaging of programmed cell death ligand 1: impact of protein concentration on distribution of anti-PD-L1 SPECT agents in an immunocompetent murine model of melanoma. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1560-1566 (2017).
