Summary
这项工作描述了在自修复可退火颗粒 - 细胞外基质复合材料中自由形式嵌入神经干细胞的协议。该协议能够以高保真度对互连的人类神经组织结构进行可编程模式化。
Abstract
在过去十年中，颗粒支持介质内细胞的嵌入式3D打印已成为软组织构建体自由形式生物制造的有力方法。然而，颗粒凝胶配方仅限于有限数量的生物材料，这些生物材料允许经济高效地产生大量水凝胶微粒。因此，颗粒凝胶支持培养基通常缺乏天然细胞外基质（ECM）中的细胞粘附和细胞指导功能。
为了解决这个问题，已经开发了一种用于生成自修复可退火颗粒 - 细胞外基质（SHAPE）复合材料的方法。SHAPE复合材料由颗粒相（微凝胶）和连续相（粘性ECM溶液）组成，它们共同允许可编程的高保真打印和可调节的生物功能细胞外环境。这项工作描述了如何利用开发的方法对人类神经结构进行精确的生物制造。
首先，制备作为SHAPE复合材料颗粒组分的藻酸盐微粒，并与基于胶原蛋白的连续组分结合。然后，将人神经干细胞打印在载体材料内部，然后对载体进行退火。打印的构建体可以维持数周，以使打印的细胞分化为神经元。同时，胶原蛋白连续相允许轴突生长和区域互连。最后，这项工作提供了有关如何进行活细胞荧光成像和免疫细胞化学以表征3D打印的人类神经构建体的信息。
Introduction
在 体外 模拟软组织的含有细胞的水凝胶结构的精确和可编程的3D打印提出了重大挑战。例如，基于软水凝胶的直接挤出的尝试本质上是有问题的，因为概括 体内 微环境所需的不良机械性能导致缺乏结构完整性，预定义特征变形或制造结构完全崩溃。此问题的常规解决方法是用更硬的生物相容性材料打印支撑支架，使最终结构保持其形状。然而，这种方法极大地限制了设计的可能性，并且需要对相邻油墨进行仔细的流变微调。
为了克服传统的逐层挤出3D打印的局限性，嵌入式3D打印近年来已成为软材料和组织制造的有力替代方案1，2，3，4，5，6。墨水不是在环境空气中挤出在表面上，而是直接通过支撑槽内的注射器针头沉积，支撑槽在静止时呈固体状，但在移动针尖周围可逆地流化，以允许精确沉积软细胞材料。当支撑物在针尾重新凝固时，沉积的材料保持原位。因此，嵌入式3D打印允许从软生物材料中高分辨率自由形式制造复杂的结构，并具有扩展的设计可能性7，8。
颗粒凝胶已被广泛探索为嵌入式3D打印的支撑浴材料，因为它们可以配制成在低屈服应力下表现出平滑，局部和可逆的固液转变9，10，11。虽然颗粒凝胶在高分辨率印刷中表现出优异的流变特性，但仅限于少数生物材料12。颗粒凝胶配方缺乏多样性，如果考虑到可用于散装水凝胶配方的广泛生物材料，这一点尤其明显，这是由于需要使用简单的化学方法经济高效地生成大量微凝胶造成的。由于颗粒凝胶载体的生物材料前景有限，因此由打印载体提供的细胞外微环境的调整在该领域提出了挑战。
最近，已经开发了一种用于生成嵌入式3D打印载体的模块化方法，称为自修复退火颗粒 - 细胞外基质（SHAPE）复合材料13。这种方法将颗粒凝胶的独特流变特性与块状水凝胶配方的生物功能多功能性相结合。所提出的SHAPE复合载体由填充的藻酸盐微粒（颗粒相，~70%体积分数）组成，增加的间隙空间充满了粘性胶原蛋白基ECM预凝胶溶液（连续相，~30%体积分数）。进一步表明，SHAPE支持物有助于人类神经干细胞（hNSCs）的高分辨率沉积，在支撑浴退火后，可以分化成神经元并保持数周以达到功能成熟。SHAPE支撑槽内的嵌入式3D打印克服了与传统神经组织生物制造技术相关的一些主要限制，同时提供了一个多功能平台。
这项工作详细介绍了在SHAPE支持内嵌入hNSCs的步骤，以及它们随后分化为功能性神经元的步骤（图1）。首先，在内部凝胶化过程中 通过剪切产生 藻酸盐微粒。这种方法可以轻松生成大量微粒，而无需专门的设备和细胞毒性试剂。此外，海藻酸盐是一种广泛可用且经济的材料来源，用于形成适用于各种细胞类型的生物相容性水凝胶底物。生成的藻酸盐微粒与胶原溶液结合，形成SHAPE复合支撑材料。然后，收集hNSCs并作为细胞生物墨水加载到注射器中进行3D打印。3D生物打印机用于基于挤出的嵌入式打印hNSCs在SHAPE复合材料内。3D打印的细胞被分化成神经元，以产生空间定义和功能性的人类神经结构。最后，该协议描述了如何使用活细胞成像和免疫细胞化学表征生成的组织构建体。此外，还提供了有关优化和故障排除的提示。值得注意的是，颗粒相和连续相的组分都可以与其他水凝胶配方交换，以适应不同的生物功能部分、机械性能和交联机制，以满足神经应用以外的其他细胞和组织类型的需求。
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Protocol
1. 缓冲液和试剂的制备
- 通过将以下补充剂加入带有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的DMEM / F12来制备细胞生长培养基：30mM葡萄糖，5μM HEPES，0.5%w / v富含脂质的牛血清蛋白，40μM L-丙氨酸，40μM L-天冬酰胺一水合物，40μM L-天冬氨酸，40μM L-谷氨酸，40μM L-脯氨酸，1%N 2补充剂，1%青霉素 - 链霉素和表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）各20ng / L。在层流气流 （LAF） 工作台中执行这些步骤。
- 在超纯水中制备1%w / v海藻酸盐溶液，在60°C下剧烈搅拌4小时。 在LAF工作台上用0.45μm孔径过滤器无菌过滤溶解的热藻酸盐溶液。将其储存在4°C。
注意：如果藻酸盐溶液的温度低于60°C，则无法通过过滤器。 - 在超纯水中制备 37 g/L NaHCO3 溶液。使用NaOH将溶液的pH值调节至9.5，并在LAF工作台中进行过滤灭菌。将溶液储存在4°C。
2. 成型复合材料制备
- 海藻酸盐微粒生成
- 在无菌烧杯中制备 2 mg/mL CaCO3 溶液的超纯水中。将其与藻酸盐溶液1：1混合，并使用磁力搅拌器在室温下搅拌1小时。
- 以1：500的比例加入乙酸，并以650rpm搅拌过夜。
注意：海藻酸盐溶液将立即开始凝胶化。确保使用与所用玻璃器皿直径长度相同的搅拌磁铁，以确保成型凝胶的最佳、均匀搅拌。第二天，在凝胶过程中通过搅拌 产生的 溶液将呈现粘稠（图2A）。 - 通过将凝胶海藻酸盐溶液以15，000rpm均匀化10分钟，将凝胶海藻酸盐溶液机械地破碎成微粒，并将均质器置于LAF工作台中（图2B）。
- 在室温下以18，500× g 离心微粒20分钟（图2C）。
- 小心地将上清液丢弃在LAF工作台内，将颗粒重悬于含有2mM NaOH和1%P / S的DMEM中，并在4°C下孵育过夜（图2D）。
注意：悬架的颜色应恢复为红色。如果悬浮液保持黄色，则滴加NaOH，并混合直至变为红色（图2E）。 - 以 15，000 rpm 的速度均质颗粒 3 分钟，并在室温下以 18，500 × g 离心 10 分钟。
- 观察沉淀（图2F），并小心除去上清液。
注意：紧密包装的藻酸盐微粒的颗粒可以储存在4°C直到进一步使用。如果藻酸盐溶液没有经过过滤灭菌，微粒应在1周内用完。
- 形状复合配方
- 打印前一天，将藻酸盐微粒颗粒重悬于含有4%HEPES（1M储备液）和4%NaHCO3 溶液的两倍体积的生长培养基中，并在室温下孵育过夜。
- 在室温下以18，500× g 离心微凝胶悬液10分钟，并弃去上清液。
- 在LAF工作台中和胶原蛋白与藻酸盐微粒混合。稀释胶原蛋白储备溶液以达到 1 mg/mL 的最终浓度，并通过加入 4% HEPES 和 4% NaHCO3 将其中和。例如，对于 3 mL 的 SHAPE 复合材料，将 2 mL 海藻酸盐微粒与 1 mL 中和胶原蛋白（0.12 mL HEPES、0.12 mL NaHCO3、0.16 mL 生长培养基和 0.6 mL 胶原蛋白）混合。
注意：所有与胶原蛋白混合的材料都需要在冰上处理，以避免胶原蛋白聚合。一旦胶原蛋白被中和，聚合就会慢慢开始。 - 通过将藻酸盐微粒颗粒与稀释和中和的胶原蛋白以 2：1 的比例混合来生成 SHAPE 复合材料。通过在LAF工作台上缓慢上下移液，彻底混合凝胶。
注意：不要涡旋，因为这会在支撑材料中引入气泡。 - 在LAF工作台中，将生成的复合材料转移到冷却的微孔板或任何合适的打印容器中，并在30分钟内使用（图3E，F）。
3. hNSC培养和生物墨水制备
- 在生长培养基中的基底膜提取物包被的T75烧瓶中培养细胞。解冻后至少传代细胞两次，然后再将它们用于3D打印实验。
- 打印前，使用0.025%胰蛋白酶溶液在37°C下酶解离细胞5分钟，用生长培养基中和胰蛋白酶，并在室温下以400× g 离心细胞悬液5分钟。离心后，吸出上清液，并将沉淀重悬于2-3mL生长培养基中。
- 进行细胞计数，以400 × g离心细胞，并将沉淀重悬于补充有0.1%黄原胶（以防止细胞沉降）的生长培养基中，终浓度为9×106 个细胞/ mL。
- 使用 21 G 钝金属针将 100 μL 紧密包装的藻酸盐微粒加载到注射器中（图 3A）。
注意：用海藻酸盐微粒创建塞子有两个目的：它有助于在印刷过程中保持挤出稳定性，并允许完全挤出装载的多孔墨水（无死体积）。 - 使用相同的针头，将制备的细胞悬液装入注射器中（图3B）。
注意：在注射器装载步骤中要格外小心，不要引入任何气泡。气泡会导致打印过程中不稳定。 - 用27 G钝金属针代替装载针，该针将用于打印（图3C）。
4. 嵌入式3D打印
- 使用参考软件设计要打印的结构（请参阅 材料表）。
注意： 确保将打印结构的初始高度调整到 SHAPE 复合支撑的深度范围内。设计建议可在 图4A （螺旋和木桩设计）中找到。 - 通过单击生成生成 G 代码。
- 将装有细胞的玻璃注射器插入基于挤出的生物打印机上的容积式挤出头中（图3D）。
- 通过单击“针头长度测量”来测量装有细胞的玻璃注射器的 针头长度。
- 将装有SHAPE复合材料的微孔板或容器放在打印机上。
注意：将细胞板或容器保持在4°C直至打印，以防止载体过早交联。 - 通过单击 SHM（表面高度测量）测量加载SHAPE凝胶的同一微孔板或容器内空孔的表面高度。
注意：或者，通过用针测量孔的高度来手动确定表面高度。 - 将挤出速率设置为 3.6 μL/分钟，将进料速率设置为 0.3 mm/s。
注意：确保在打印前测试挤出。细胞沉降会导致喷嘴堵塞，可以通过在实际嵌入印刷之前预先挤出少量体积或向容量注射器添加回缩体积来避免。在某些情况下，当针头插入或退出SHAPE凝胶时，进给速率需要保持在 0.5 mm / s以下 ，以避免墨水的拖曳。 - 将 G 代码加载到打印机的用户界面中。
注意：每次对设计结构进行更改时，都需要生成新的G代码。 - 通过单击 “运行 ”启动打印过程（图3G）。
- 打印后立即将SHAPE凝胶在37°C的细胞培养箱中放置30分钟进行退火。
- 在退火的SHAPE凝胶载体上轻轻添加生长培养基。
- 第二天，用配制如下的分化培养基替换生长培养基：DMEM / F12与L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽与30mM葡萄糖，5μMHEPES，0.5%w / v富含脂质的牛血清蛋白，40μM L-丙氨酸，40μML-天冬酰胺一水合物，40μM L-天冬氨酸，40μM L-谷氨酸，40μML-脯氨酸，1%N2补充剂，1%青霉素链霉素，100μM二丁酰环磷酸腺苷（二丁酰-cAMP）， 和 2 ng/mL 神经胶质细胞系衍生的神经营养因子 （GDNF）。
注意：确保在更换培养基期间不要损坏水凝胶。倾斜盘子，轻轻取出旧介质。将新鲜培养基滴加到含有凝胶的孔壁上，而不是直接添加到凝胶顶部。不要使用吸气器去除介质。 - 每2天刷新一次分化培养基，直到实验终点。
5. 活细胞荧光成像
- 从凝胶中除去多余的培养基。
- 向支持凝胶的体积中加入等体积的20μM钙黄绿素AM（在储备溶液的分化培养基中稀释）。
- 在37°C孵育40分钟。
- 取出钙黄绿素AM溶液，并加入适量的新鲜分化培养基。
- 将板转移到显微镜上进行成像。
6. 免疫细胞化学
- 从凝胶中除去多余的培养基。
- 使用小刮刀将凝胶转移到含有DPBS的较大容器中。
- 用DPBS洗涤三次，每次20分钟，然后将盘子转移到通风橱中。
- 取出DPBS，加入足够的4%甲醛溶液以覆盖凝胶，并在室温下孵育1小时。
- 用DPBS洗涤三次，每次20分钟。
- 在DPBS中制备由5%驴血清，0.25%洗涤剂和0.02%叠氮化钠组成的封闭溶液。
注意：准备覆盖凝胶所需体积的三倍;稍后将用作一抗和二抗溶液的基础。 - 用DPBS洗涤后，将封闭溶液加入凝胶中，并在室温下孵育6小时以防止非特异性结合。轻轻摇晃盘子。
- 通过将TUBB3抗体以1：1，000的比例稀释在封闭溶液中来制备一抗溶液。
- 从凝胶中取出封闭溶液，加入一抗溶液，并在4°C孵育48小时。 轻轻摇晃盘子。
- 用DPBS洗涤三次，每次20分钟。
- 通过在封闭溶液中稀释4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1：1，000）和二抗（1：200）来制备二抗溶液。
- 用DPBS洗涤后，将凝胶在4°C下在二抗溶液中孵育24小时。 轻轻摇晃盘子。
- 用DPBS洗涤三次，每次20分钟，并在4°C下储存直至成像。
- 成像前，用刮刀将染色凝胶转移到具有薄成像底部的培养皿或孔板上。
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Representative Results
海藻酸盐微 凝胶制备在 内部凝胶过程中通过剪切稀化然后进行机械碎裂，得到尺寸多分散且形状呈片状的藻酸盐微凝胶，如图 2G所示。这些不规则颗粒的直径范围从小于1μm到大约40μm。当紧密包装时，微粒形成透明的块状材料，仅比相应的细胞培养基略微不透明（图2F）。载体材料的透明度是该平台的一个重要方面，因为它允许在培养期间可视化印刷结构，以及用活细胞 染料和免疫 细胞化学标记的构建体的高分辨率共聚焦显微镜。当浸泡在缓冲细胞培养基中时，所得pH调节凝胶应呈红色，表示生理条件（图2F）。中和藻酸盐微粒的pH值很重要，原因有两个。酸性微粒会直接伤害细胞。此外，酸性环境会阻止SHAPE复合载体的成功退火，因为它会干扰胶原蛋白聚合。
使用上述参数打印hNSC墨水会产生直径为~200μm的细胞细丝（图4A）。在一个平面上打印和在彼此重叠上打印结构时，都会保留编程的几何形状。在多层印刷的情况下，印刷结构保持完整，最小层间距离为200μm13。在油墨制备和挤出过程中，细胞的活力不应受到显着影响。打印的链富含具有圆形形态的活细胞（图4B，左）。打印后的第二天可能会出现打印股上的间隙，即使制造的结构在打印后没有立即显示任何变形。这很可能是支撑物混合不均匀的结果。由于细胞不与藻酸盐微粒相互作用，它们从富含藻酸盐的区域迁移到富含胶原蛋白和细胞的区域，从而导致打印链断裂。此外，SHAPE支架应该是无气泡的，因为气穴会干扰印刷保真度。
hNSCs的成功分化应在打印后30天产生富含神经元的结构，细胞表现出具有小细胞体和长细过程的神经元形态（图4B，右）。此外，如果打印了密集的图案，例如矩形细胞片，则在分化过程中不应形成任何可见的间隙或聚集体，而是应保持连续的细胞层完整（图4C）。在该协议中，描述了3D打印样品的荧光免疫细胞化学程序。TUBB3（一种细胞质神经元标志物）染色允许直接可视化生成的神经元网络。分化印刷品的荧光显微镜应揭示富含TUBB3的结构并保持几何形状（图4D，左）。在分化过程中，细胞不会从打印的链中迁移出来，这可以通过用DAPI染色细胞核来观察到（图4D，中间）。结果，在打印几何形状的边界内观察到神经元体，轴突突起发出数百微米到结构周围的SHAPE支撑中。对周围体积的轴突探索表明，SHAPE支持提供了允许轴突寻路的生物功能线索。更成熟的神经元标志物或亚型特异性标志物可用于免疫细胞化学，以进一步表征生成的神经元群。此外，可以使用RT-qPCR或电生理学13表征打印的神经元构建体。然而，这两种方法都需要使用胶原酶去除胶原蛋白，因为水凝胶层会阻碍RNA提取和用微量移液器物理进入细胞。
图 1：SHAPE 嵌入式打印方法的概念图。将胶原蛋白溶液与藻酸盐微粒混合以形成SHAPE复合材料;SHAPE复合材料用作hNSC嵌入式3D打印的支撑材料，hNSCs在退火载体内分化为神经元。SHAPE复合材料的生物功能特性允许神经元扩展投影，并用其轴突投影填充支撑的空白部分。这个数字是从Kajtez等人13修改而来的。缩写：SHAPE =自愈退火颗粒-细胞外基质;hNSC = 人类神经干细胞。请点击此处查看此图的大图。
图2：海藻酸盐微粒的制备 。 （A）凝胶化过夜后的海藻酸盐溶液。（B）均质产生的藻酸盐微粒。（C）离心后的颗粒沉淀。（D）在pH调节之前和pH调节之后重悬于DMEM（E）中的沉淀。（F）将培养基中孵育过夜并离心后的微粒。（G）制备的藻酸盐微粒的明场图像。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图3：3D打印过程的准备。 （A）将浆塞（~100μL）装入注射器，然后（B）加载细胞生物墨水（此处补充彩色珠子以用于可视化目的）。（C）用于装墨的锥形塑料针尖（21 G）替换为27 G钝金属针尖。（D）将注射器插入3D打印头。（中、女）将SHAPE复合材料移液到48孔板的孔中。带有SHAPE复合材料的管子在不处理时保持在冰上。（G）将打印针尖插入SHAPE支架，并开始打印计算机设计定义的路径（此处描绘螺旋的打印）。缩写：SHAPE =自愈退火颗粒-细胞外基质。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：SHAPE 复合支架内的 3D 打印神经构建体 。 （A）载体水凝胶内打印的hNSC的明场图像。展示螺旋（左）和木桩（右）结构设计。（B）打印后第二天（左）和神经元分化后（右）的3D打印结构的活细胞成像。（C）用刮刀从培养孔中取出的3D打印方形结构显示出结构完整性。（D）免疫标记神经元标记（TUBB3）和复染细胞核（DAPI）的相同方形构建体的荧光共聚焦图像，确认3D打印构建体中hNSCs的成功分化。比例尺 = 500 μm（A，右）;100微米（B，D）。图中的 图C 和 D 是从Kajtez等人13修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
SHAPE复合材料方法为配制用于蜂窝油墨嵌入式3D打印的可退火和生物功能支撑浴提供了一种通用途径。虽然该协议提供了神经构建体3D打印的示例，但SHAPE工具箱可以很容易地适应与其他细胞来源的生物制造，以精确设计一系列目标组织类型。打印方法还将允许对多种细胞类型进行精确图案化，以研究它们的相互作用或设计具有细胞区室（例如神经元和神经胶质细胞）定义空间排列的组织。与传统的颗粒凝胶相比，SHAPE复合材料含有扩展的间隙空间（本协议中提出的配方的~30%体积分数）。颗粒组分用作流变改性剂，为复合材料提供高分辨率嵌入式印刷的有利材料特性。这通过改变连续组分的配方，同时保持相同的颗粒组分，为合理设计细胞微环境开辟了一条途径。例如，可以将其他功能性ECM分子引入支持浴（例如，透明质酸，层粘连蛋白，纤连蛋白），或者可以利用不同的交联机制（例如，酶，基于光）13。此外，颗粒组分中的藻酸盐可以用来自不同水凝胶材料（例如明胶8，聚乙二醇14，15，琼脂糖16）的微粒代替，或者根据不同组织工程或疾病建模应用的需要制成不同的尺寸和形状。颗粒相和连续相之间的比例可以根据单个3D打印项目的需要进行调整，但是将连续相增加到30%以上可能会影响打印保真度和分辨率。
在微凝胶生产步骤中，至关重要的是，加入乙酸后海藻酸盐溶液的搅拌在整个胶凝溶液的体积内是有效的。如果搅拌速度太低或磁力搅拌器太小，搅拌可能无法到达溶液的上层，这将变成大量的交联本体水凝胶，而下层将被剪切。不一致剪切的海藻酸盐水凝胶的均质化将导致产生藻酸盐微粒，这对于3D打印应用来说是次优的。此外，藻酸盐微粒需要与胶原蛋白溶液彻底混合，因为非均匀混合物将导致缺乏胶原蛋白的支撑材料斑块;这些贴片不会被退火，因此缺乏细胞相互作用特征。也可能有缺乏藻酸盐微粒的补丁，因此不支持打印。因此，不均匀混合的印刷支撑将无法支持高保真印刷，并且会在结构上受到损害，因为它不会在整个体积中退火。还应避免气泡，不是因为它们可能对细胞有害，而是因为气穴会在打印过程中引起变形并干扰构建体的成像。气泡的两个常见来源是涡旋（冷载体中的微气泡在37°C载体退火期间膨胀）和剧烈移液。
这项工作中的SHAPE复合载体不是作为印刷后去除的牺牲材料，而是作为干细胞分化和神经元生长和功能成熟的长期生物功能支持。与印后未退火的颗粒凝胶相比，退火SHAPE复合材料的结构稳定性和透明度在固定和免疫标记过程中为精细的神经元特征提供了保护环境，因此，该材料通过抗原的可视化 促进了 形态学表征。荧光报告基因还可用于跟踪细胞形态随时间的变化，以及监测退火打印载体内的细胞增殖和迁移。此外，钙成像方法可用于提供有关自发细胞活动的信息（例如，神经元中动作电位的放电甚至同步神经元网络活动）。然而，由于细胞周围的水凝胶层减慢了扩散并阻止了细胞微环境的瞬时调制，因此工程细胞构建体的化学刺激（例如，使用KCl的神经元刺激）可能很困难。光遗传学刺激为控制细胞活性提供了更好的选择，因为SHAPE水凝胶不会阻碍对细胞的光学访问。
氧敏珠可以掺入生物墨水或支撑材料中（通过在 复合制备过程中直接印刷或分散），以允许以高灵敏度实时映射印刷结构内部和周围的氧张力水平的空间和时间映射13。这种基于磷光寿命测量的无创3D氧映射方法为改善氧合的工程组织结构提供了一条途径，并且可能还改善了营养供应。氧合不良可能导致打印结构内形成坏死区域，干扰干细胞分化，并影响神经元代谢。氧映射提供了一个读数，基于该读数可以改变3D打印设计，以促进整个结构的均匀氧合，微调氧水平以匹配生理条件，或产生氧梯度。
工程通道也可以通过印刷牺牲油墨（例如明胶）在可退火印刷支架内合并，该墨水在冷支架浴内固化，但在 37°C 下可以轻松抽真空4，13。需要通道向具有高细胞密度或尺寸的组织结构提供营养和氧气，这些结构超出了基于设计的氧张力操纵方法的能力。此外，可以利用血管样通道来创建小分子的梯度，这些梯度驱动细胞身份的模式化，调节细胞活性或引导趋化性。
总之，SHAPE复合材料内部的嵌入式3D打印提供了一个模块化材料平台，该平台易于适应，并且具有机械敏感组织功能建模的多功能潜力。此处介绍的协议详细说明了生成支持材料和以高保真度打印细胞墨水所需的必要步骤和基本原则。该方法利用了负担得起的材料和可访问的设备，同时为个性化方法提供了空间，以满足个别研究人员的需求和应用。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
该研究主要由玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里初始培训网络和第676408号赠款协议下的BrainMatTrain欧盟地平线2020计划（编号H2020-MSCA-ITN-2015）资助。C.R.和J.U.L.感谢灵北基金会（R250-2017-1425）和丹麦独立研究基金（8048-00050）的支持。我们非常感谢OpenMIND 101047177 HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01项目的资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Gastight Syringe 1001 TLL | Hamilton | 81320 | |
| 3DDiscovery 3D bioprinter | RegenHU | ||
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| AlbuMAX | ThermoFisher | 11020021 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | Goat anti-Mouse |
| Blunt Needle, Sterican (21 G) | Braun | 9180109 | |
| Blunt Needle (27 G) | Cellink | NZ5270505001 | |
| BioCAD software | SolidWorks | ||
| Calcein AM | ThermoFisher | 65-0853-39 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C5929 | |
| Dibutyryl-cAMP sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL) | R&D Systems | 3440-100-01 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | ThermoFisher | 10565018 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190094 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF | R&D Systems | 3718-FB | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 100496 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1569601 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES Buffer (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | 5129 | |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| Magnetic stirrer RET basic | IKA | 3622000 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| S25N-10G dispersing tool | IKA | 4447100 | |
| Sodium Alginate (80-120 cP) | FUJIFILM Wako | 194-13321 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer | IKA | 3720000 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin/EDTA Solution | ThermoFisher | R001100 | |
| TUBB3 antibody | BioLegend | 801213 | Mouse |
| Xanthan gum | Sigma-Aldrich | G1253 |
References
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