Summary
Dette arbeidet beskriver en protokoll for friform innebygd 3D-utskrift av nevrale stamceller i selvhelbredende glødbare partikkel-ekstracellulære matrikskompositter. Protokollen muliggjør programmerbar mønstre av sammenkoblede menneskelige nevrale vevskonstruksjoner med høy troskap.
Abstract
Den innebygde 3D-utskriften av celler inne i et granulært støttemedium har dukket opp det siste tiåret som en kraftig tilnærming for freeform biofabrication av bløtvevskonstruksjoner. Imidlertid har granulære gelformuleringer vært begrenset til et begrenset antall biomaterialer som muliggjør kostnadseffektiv generering av store mengder hydrogelmikropartikler. Derfor har granulære gelstøttemedier generelt manglet de celleklebende og celleinstruktive funksjonene som finnes i den opprinnelige ekstracellulære matrisen (ECM).
For å løse dette er det utviklet en metodikk for generering av selvhelbredende glødbare partikkel-ekstracellulære matrisekompositter (SHAPE). SHAPE-kompositter består av en granulær fase (mikrogeler) og en kontinuerlig fase (tyktflytende ECM-løsning) som sammen muliggjør både programmerbar hi-fi-utskrift og et justerbart biofunksjonelt ekstracellulært miljø. Dette arbeidet beskriver hvordan den utviklede metodikken kan utnyttes for presis biofabrikasjon av menneskelige nevrale konstruksjoner.
Først blir alginatmikropartikler, som tjener som den granulære komponenten i SHAPE-komposittene, fremstilt og kombinert med en kollagenbasert kontinuerlig komponent. Deretter skrives menneskelige nevrale stamceller inn i støttematerialet, etterfulgt av glødning av støtten. De trykte konstruksjonene kan opprettholdes i flere uker for å tillate differensiering av de trykte cellene i nevroner. Samtidig tillater kollagen kontinuerlig fase for aksonal utvekst og sammenkobling av regioner. Til slutt gir dette arbeidet informasjon om hvordan man utfører levende cellefluorescensavbildning og immunocytokjemi for å karakterisere de 3D-printede menneskelige nevrale konstruksjonene.
Introduction
Den presise og programmerbare 3D-utskriften av cellebelastede hydrogelkonstruksjoner som etterligner bløtvev in vitro , utgjør en stor utfordring. For eksempel er forsøk basert på direkte ekstrudering av myke hydrogeler iboende problematiske, da de dårlige mekaniske egenskapene som kreves for å rekapitulere in vivo-mikromiljøet fører til mangel på strukturell integritet, deformasjoner av de forhåndsdefinerte egenskapene eller fullstendig sammenbrudd av de fabrikkerte strukturer. En vanlig løsning på dette problemet er å skrive ut et støttestillas fra et stivere biokompatibelt materiale som gjør at den endelige konstruksjonen kan opprettholde formen. Imidlertid begrenser denne tilnærmingen i stor grad designmulighetene og krever nøye reologisk finjustering av de tilstøtende blekkene.
For å overvinne begrensningene i den tradisjonelle lag-for-lag ekstruderingsbaserte 3D-utskriften, har innebygd 3D-utskrift dukket opp de siste årene som et kraftig alternativ for mykt materiale og vevfabrikasjon 1,2,3,4,5,6. I stedet for å ekstrudere blekket i omgivelsesluft på toppen av en overflate, blir blekket direkte avsatt gjennom en sprøytenål inne i et støttebad som er solid-lignende i ro, men reversibelt fluidiserer rundt den bevegelige nålespissen for å tillate presis avsetning av mykt cellebelastet materiale. Det deponerte materialet holdes på plass ettersom støtten størkner i kjølvannet av nålen. Som sådan tillater innebygd 3D-utskrift høyoppløselig friformfabrikasjon av intrikate strukturer fra myke biomaterialer med utvidede designmuligheter 7,8.
Granulære geler har blitt grundig utforsket som støttebadematerialer for innebygd 3D-utskrift, siden de kan formuleres for å vise jevne, lokaliserte og reversible faststoff-til-væske-overganger ved lave flytespenninger 9,10,11. Mens de viser gode reologiske egenskaper for høyoppløselig utskrift, har granulære geler blitt begrenset til en håndfull biomaterialer12. Mangelen på mangfold i granulære gelformuleringer, noe som er spesielt tydelig hvis man vurderer det brede spekteret av biomaterialer som er tilgjengelige for bulkhydrogelformuleringer, skyldes behovet for kostnadseffektiv generering av et stort antall mikrogeler ved bruk av enkle kjemikalier. På grunn av det begrensede biomateriallandskapet av granulære gelstøtter, utgjør innstillingen av det ekstracellulære mikromiljøet fra utskriftsstøtten en utfordring i feltet.
Nylig har en modulær tilnærming blitt utviklet for generering av innebygde 3D-utskriftsstøtter, kalt selvhelbredende glødbar partikkel-ekstracellulær matrise (SHAPE) kompositter13. Denne tilnærmingen kombinerer de distinkte reologiske egenskapene til granulære geler med den biofunksjonelle allsidigheten til bulkhydrogelformuleringer. Den presenterte SHAPE-komposittstøtten består av pakkede alginatmikropartikler (granulær fase, ~ 70% volumfraksjon) med et økt interstitielt rom fylt med en viskøs kollagenbasert ECM-pregelløsning (kontinuerlig fase, ~ 30% volumfraksjon). Det har videre vist seg at SHAPE-støtten muliggjør høyoppløselig avsetning av humane nevrale stamceller (hNSC) som, etter glødning av støttebadet, kan differensieres til nevroner og opprettholdes i flere uker for å nå funksjonell modning. Innebygd 3D-utskrift inne i SHAPE-støttebadet overvinner noen av de største begrensningene knyttet til konvensjonelle teknikker for biofabrikasjon av nevrale vev, samtidig som det gir en allsidig plattform.
Dette arbeidet beskriver trinnene for innebygd 3D-utskrift av hNSCs inne i SHAPE-støtten og deres påfølgende differensiering til funksjonelle nevroner (figur 1). Først genereres alginatmikropartikler via skjæring under intern gelering. Denne tilnærmingen tillater enkel generering av store mengder mikropartikler uten behov for spesialutstyr og cytotoksiske reagenser. Videre er alginat en allment tilgjengelig og økonomisk materialkilde for dannelse av biokompatible hydrogelsubstrater for et mangfoldig utvalg av celletyper. De genererte alginatmikropartiklene kombineres med en kollagenløsning for å danne SHAPE komposittstøttemateriale. Deretter høstes hNSC-ene og lastes inn i en sprøyte som et cellulært bioblekk for 3D-utskrift. En 3D-bioprinter brukes til ekstruderingsbasert innebygd utskrift av hNSC-er inne i SHAPE-kompositten. De 3D-printede cellene er differensiert i nevroner for å gi opphav til romlig definerte og funksjonelle menneskelige nevrale konstruksjoner. Til slutt beskriver protokollen hvordan de genererte vevskonstruksjonene kan karakteriseres ved hjelp av levende celleavbildning og immunocytokjemi. I tillegg gis tips for optimalisering og feilsøking. Spesielt kan både komponentene i de granulære og kontinuerlige fasene byttes ut med andre hydrogelformuleringer for å imøtekomme forskjellige biofunksjonelle deler, mekaniske egenskaper og tverrbindingsmekanismer, som kreves av andre celle- og vevstyper utover nevrale applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av buffere og reagenser
- Forbered cellevekstmedium ved å legge til følgende tilskudd til DMEM / F12 med L-alanyl-L-glutamindipeptid: 30 mM glukose, 5 μM HEPES, 0,5% w / v lipidrikt bovint serumalbumin, 40 μM L-alanin, 40 μM L-asparaginmonohydrat, 40 μM L-asparaginsyre, 40 μM L-glutaminsyre, 40 μM L-prolin, 1% N2-supplement, 1% penicillin-streptomycin og 20 ng / L hver av epidermal vekstfaktor (EGF) og fibroblastvekstfaktor (FGF). Utfør disse trinnene i en laminær luftstrømbenk (LAF).
- Tilbered 1 % w/v alginatoppløsning i ultrarent vann ved å røre kraftig i 4 timer ved 60 °C. Sterilt filter den oppløste, varme alginatløsningen med et 0,45 μm porefilter i en LAF-benk. Oppbevares ved 4 °C.
MERK: Hvis temperaturen på alginatoppløsningen er under 60 °C, vil det ikke være mulig å passere den gjennom filteret. - Klargjør en 37 g/l NaHCO3-oppløsning i ultrarent vann. Juster pH i løsningen til 9,5 ved hjelp av NaOH, og filtrersteriliser i en LAF-benk. Oppbevar oppløsningen ved 4 °C.
2. Klargjøring av komposittmateriale i SHAPE
- Generering av alginatmikropartikler
- Tilbered en 2 mg/ml CaCO3 oppløsning i ultrarent vann i et sterilt beger. Bland det 1:1 med alginatoppløsningen, og rør i 1 time ved romtemperatur ved hjelp av en magnetomrører.
- Tilsett eddiksyre i forholdet 1:500, og la det røres over natten ved 650 o / min.
MERK: Alginatoppløsningen vil begynne å gelere umiddelbart. Sørg for å bruke en omrøringsmagnet med samme lengde som diameteren på glasset som brukes for å sikre optimal, homogen omrøring av formingsgelen. Neste dag vil løsningen som genereres via omrøring under gelering vises tyktflytende (figur 2A). - Fragmenter den gelerte alginatløsningen mekanisk i mikropartikler ved å homogenisere den ved 15 000 o / min i 10 minutter med en homogenisator plassert i en LAF-benk (figur 2B).
- Sentrifuger mikropartiklene ved 18 500 × g i 20 minutter (figur 2C) ved romtemperatur.
- Kast forsiktig supernatanten inne i LAF-benken, resuspender partiklene i DMEM inneholdende 2 mM NaOH og 1 % P/S, og inkuber over natten ved 4 °C (figur 2D).
MERK: Fargen på suspensjonen skal gå tilbake til rød. Hvis suspensjonen forblir gul, tilsett NaOH dråpevis og bland til den blir rød (figur 2E). - Homogeniser partiklene ved 15 000 o / min i 3 minutter, og sentrifuge ved 18 500 × g i 10 minutter ved romtemperatur.
- Observer pelleten (figur 2F), og fjern supernatanten forsiktig.
MERK: Pelleten av tettpakkede alginatmikropartikler kan lagres ved 4 °C inntil videre bruk. Hvis alginatoppløsningen ikke ble filtersterilisert, bør mikropartiklene brukes opp innen 1 uke.
- SHAPE sammensatt formulering
- Dagen før trykking, resuspender alginatmikropartikkelpelleten i to ganger volumet av vekstmedium inneholdende 4% HEPES (1 M stam) og 4% NaHCO3-løsning i en LAF-benk, og inkuber den over natten ved romtemperatur.
- Sentrifuger mikrogelsuspensjonen ved 18 500 × g i 10 minutter ved romtemperatur, og kast supernatanten.
- Nøytraliser kollagenet som skal blandes med alginatmikropartiklene i en LAF-benk. Fortynn kollagenoppløsningen for å nå en endelig konsentrasjon på 1 mg/ml, og nøytraliser den ved å tilsette 4 % HEPES og 4 % NaHCO3. For eksempel, for 3 ml SHAPE-kompositt, bland 2 ml alginatmikropartikler med 1 ml nøytralisert kollagen (0,12 ml HEPES, 0,12 ml NaHCO3, 0,16 ml vekstmedium og 0,6 ml kollagen).
MERK: Alle materialene som blandes med kollagen må håndteres på is for å unngå kollagenpolymerisering. Så snart kollagenet er nøytralisert, vil polymerisasjonen sakte starte. - Generer SHAPE-kompositten ved å blande alginatmikropartikkelpelleten med det fortynnede og nøytraliserte kollagenet i forholdet 2:1. Bland geleen grundig ved å pipettere sakte opp og ned på is i en LAF-benk.
MERK: Ikke virvel, da dette vil introdusere bobler i støttematerialet. - I en LAF-benk overfører du det genererte komposittmaterialet til en avkjølt mikrobrønnplate eller en egnet utskriftsbeholder, og brukes innen 30 minutter (figur 3E, F).
3. hNSC kultur og bioblekk forberedelse
- Dyrk: cellene i en kjellermembran ekstraktbelagt T75-kolbe i vekstmedium. Pass cellene minst to ganger etter tining før du bruker dem til et 3D-utskriftseksperiment.
- Før utskrift, dissocier cellene enzymatisk ved hjelp av en 0,025% trypsinløsning i 5 minutter ved 37 ° C, nøytraliser trypsinet med vekstmedium og sentrifuge cellesuspensjonen ved 400 × g i 5 minutter ved romtemperatur. Etter sentrifugeringen aspirerer supernatanten og resuspenderer pelleten i 2-3 ml vekstmedium.
- Utfør en celletelling, sentrifuge cellene ved 400 × g, og resuspender pelleten i vekstmedium supplert med 0,1% xantangummi (for å forhindre at cellene sedimenterer) ved en endelig konsentrasjon på 9 × 106 celler / ml.
- Bruk en 21 G stump metallkanyle til å legge 100 mikroliter tettpakkede alginatmikropartikler i en sprøyte (figur 3A).
MERK: Å lage en plugg med alginatmikropartiklene tjener to formål: det bidrar til å opprettholde ekstruderingsstabiliteten under utskrift og muliggjør fullstendig ekstrudering av lastet celleblekk (ikke dødt volum). - Bruk den samme kanylen til å legge den klargjorte cellesuspensjonen i sprøyten (figur 3B).
MERK: Vær ekstra forsiktig så du ikke introduserer luftbobler under sprøytelastetrinnene. Luftbobler vil forårsake ustabilitet under utskrift. - Sett tilbake startkanylen med en 27 G butt metallkanyle som skal brukes til utskrift (figur 3C).
4. Innebygd 3D-utskrift
- Utform en struktur for utskrift ved hjelp av programvaren det refereres til (se materialfortegnelsen).
MERK: Sørg for å justere den opprinnelige høyden på den utskrevne strukturen til innenfor dybden av SHAPE sammensatt støtte. Designforslag finner du i figur 4A (spiral- og trestabledesign). - Generer en G-kode ved å klikke på Generer.
- Sett den cellebelastede glasssprøyten inn i et volumetrisk ekstruderingshode på en ekstruderingsbasert bioprinter (figur 3D).
- Mål nålelengden på den cellebelastede glasssprøyten ved å klikke på Nållengdemåling.
- Plasser mikrobrønnplaten eller beholderen som er lastet med SHAPE-kompositten, på skriveren.
MERK: Hold celleplaten eller beholderen på 4 °C til du skriver ut for å forhindre for tidlig tverrbinding av støtten. - Mål overflatehøyden på en tom brønn i samme mikrobrønnplate eller beholder som SHAPE-gelen er lastet i, ved å klikke på SHM (overflatehøydemåling).
MERK: Alternativt kan du bestemme overflatehøyden manuelt ved å måle høyden på brønnen med nålen. - Sett ekstruderingshastigheten til 3,6 μL/min og matehastigheten til 0,3 mm/s.
MERK: Sørg for å teste ekstruderingen før utskrift. Cellesedimentering kan forårsake tilstopping av dysen og kan unngås ved å preekstrudere et lite volum før den faktiske innebygde utskriften eller ved å legge til et tilbaketrekkingsvolum til den volumetriske sprøyten. I noen tilfeller må matehastigheten holdes under 0,5 mm/s når nålen stikkes inn i eller ut av SHAPE-gelen for å unngå at blekket dras. - Legg G-koden i brukergrensesnittet til skriveren.
MERK: En ny G-kode må genereres hver gang det gjøres endringer i den designede strukturen. - Start utskriftsprosedyren ved å klikke på Kjør (figur 3G).
- Umiddelbart etter utskrift, plasser SHAPE-gelen ved 37 °C i en cellekulturinkubator i 30 minutter for glødning.
- Tilsett vekstmedium forsiktig på toppen av den glødde SHAPE-gelstøtten.
- Neste dag, erstatt vekstmediet med differensieringsmedium formulert som følger: DMEM / F12 med L-alanyl-L-glutamindipeptid med 30 mM glukose, 5 μM HEPES, 0,5% w / v lipidrikt bovint serumalbumin, 40 μM L-alanin, 40 μM L-asparaginmonohydrat, 40 μM L-asparaginsyre, 40 μM L-glutaminsyre, 40 μM L-prolin, 1% N2-supplement, 1% penicillin-streptomycin, 100 μM dibutyryl-syklisk adenosinmonofosfat (dibutyryl-cAMP), og 2 ng/ml gliacellelinjederivert nevrotrofisk faktor (GDNF).
MERK: Pass på at du ikke skader hydrogelen under middels endringer. Vipp platen, og fjern det gamle mediet forsiktig. Tilsett friskt medium dråpevis til veggen av brønnen som inneholder gelen i stedet for direkte på toppen av gelen. Ikke bruk en aspirator til å fjerne mediet. - Oppdater differensieringsmediet hver 2. dag til det eksperimentelle endepunktet.
5. Levende celle fluorescens avbildning
- Fjern overflødig medium fra gelen.
- Tilsett et likt volum på 20 μM Calcein AM (fortynnet i differensieringsmedium fra stamløsningen) til volumet av støttegelen.
- Inkuber i 40 minutter ved 37 °C.
- Fjern Calcein AM-løsningen, og tilsett et passende volum friskt differensieringsmedium.
- Overfør platen til mikroskopet for avbildning.
6. Immunocytokjemi
- Fjern overflødig medium fra gelen.
- Bruk en liten slikkepott til å overføre gelen til en større beholder som inneholder DPBS.
- Vask tre ganger i 20 minutter hver gang med DPBS, og overfør platen til en avtrekkshette.
- Fjern DPBS, tilsett nok 4% formaldehydoppløsning for å dekke gelen, og inkuber i 1 time ved romtemperatur.
- Vask tre ganger med DPBS i 20 min hver gang.
- Forbered blokkeringsløsning bestående av 5% eselserum, 0,25% vaskemiddel og 0,02% natriumazid i DPBS.
MERK: Forbered tre ganger volumet som trengs for å dekke gelen; Det vil bli brukt senere som grunnlag for primære og sekundære antistoffløsninger. - Etter vask med DPBS, tilsett blokkeringsløsningen til gelen, og inkuber i 6 timer ved romtemperatur for å forhindre uspesifikk binding. Rock tallerkenen forsiktig.
- Forbered den primære antistoffoppløsningen ved å fortynne TUBB3-antistoffet i blokkeringsoppløsning i forholdet 1:1,000.
- Fjern blokkeringsoppløsningen fra gelen, tilsett den primære antistoffoppløsningen og inkuber i 48 timer ved 4 °C. Rock tallerkenen forsiktig.
- Vask tre ganger med DPBS i 20 min hver gang.
- Klargjør den sekundære antistoffoppløsningen ved å fortynne 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 1:1,000) og det sekundære antistoffet (1:200) i blokkeringsoppløsning.
- Etter vask med DPBS, inkuber gelen i den sekundære antistoffoppløsningen i 24 timer ved 4 °C. Rock tallerkenen forsiktig.
- Vask tre ganger med DPBS i 20 minutter hver gang, og oppbevar ved 4 °C til avbildning.
- Før avbildning, overfør den fargede gelen med en slikkepott til en tallerken eller en brønnplate med en tynn bildebunn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alginatmikrogelfremstilling via skjærtynning under intern gelering etterfulgt av mekanisk fragmentering gir alginatmikrogeler som er polydispergert i størrelse og flaklignende i form som vist i figur 2G. Størrelsen på disse uregelmessige partiklene varierer fra mindre enn 1 μm til ca. 40 μm i diameter. Når de er tett pakket, danner mikropartiklene et gjennomsiktig bulkmateriale som bare er litt mer ugjennomsiktig enn det tilsvarende cellekulturmediet (figur 2F). Gjennomsiktigheten av støttematerialet er et viktig aspekt ved plattformen, da det muliggjør visualisering av de trykte strukturene i dyrkingsperioden, samt for høyoppløselig konfokalmikroskopi av konstruksjoner merket både med levende cellefarger og via immunocytokjemi. Når den er gjennomvåt i bufret cellekulturmedium, bør den resulterende pH-justerte gelen ha en rød farge, noe som indikerer fysiologiske forhold (figur 2F). Det er viktig å nøytralisere pH-verdien i alginatmikropartiklene av to grunner. Sure mikropartikler kan direkte skade cellene. Videre vil et surt miljø forhindre vellykket glødning av SHAPE-komposittstøtten, da det ville forstyrre kollagenpolymerisasjonen.
Utskrift av hNSC-blekk ved hjelp av parametrene beskrevet ovenfor gir et filament av celler som er ~ 200 μm i diameter (figur 4A). Den programmerte geometrien bevares både ved utskrift i ett plan og når man skriver ut strukturer oppå hverandre. Ved flerlagstrykk forblir de trykte strukturene intakte, med en minste lag-til-lag-avstand på 200 μm13. Levedyktigheten til celler bør ikke påvirkes betydelig under blekkforberedelse og ekstrudering. De trykte trådene er rike på levende celler som har en rund morfologi (figur 4B, til venstre). Hull i de trykte trådene kan vises dagen etter utskrift, selv om den fabrikkerte konstruksjonen ikke viser noen deformasjoner umiddelbart etter utskrift. Dette er mest sannsynlig et resultat av inhomogen blanding av støtten. Siden cellene ikke interagerer med alginatmikropartiklene, vandrer de bort fra de alginatrike områdene mot kollagen- og cellerike områder, og forårsaker dermed brudd i de trykte trådene. Videre bør SHAPE-støtten være boblefri, siden luftlommer kan forstyrre utskriftsgjengivelsen.
Vellykket differensiering av hNSC bør gi nevronrike strukturer 30 dager etter utskrift, med celler som viser nevronmorfologi med små cellelegemer og lange tynne prosesser (figur 4B, til høyre). Videre, hvis tette mønstre skrives ut, for eksempel et rektangulært ark med celler, bør det ikke være noen synlige hull eller aggregater som dannes under differensiering, men snarere et kontinuerlig lag av celler bør forbli intakt (figur 4C). I denne protokollen beskrives en prosedyre for fluorescensimmuncytokjemi av de 3D-printede prøvene. Farging for TUBB3, en cytoplasmatisk nevronmarkør, muliggjør direkte visualisering av de genererte nevrale nettverkene. Fluorescensmikroskopien av de differensierte trykkene skal avsløre strukturer rike på TUBB3 og med vedlikeholdt geometri (figur 4D, venstre). Under differensieringsprosessen migrerer ikke cellene ut av de trykte strengene, noe som kan observeres ved farging for cellekjerner med DAPI (figur 4D, midten). Som et resultat observeres nevronlegemer innenfor grensene til den trykte geometrien, med aksonale fremspring som utstråler hundrevis av mikrometer inn i SHAPE-støtten som omgir konstruksjonen. Den aksonale utforskningen av det omkringliggende volumet indikerer at SHAPE-støtten gir biofunksjonelle signaler som tillater aksonal stifinning. Mer modne nevronmarkører eller subtypespesifikke markører kan brukes i immuncytokjemi for ytterligere å karakterisere de genererte nevronpopulasjonene. Videre kan den trykte nevronkonstruksjonen karakteriseres ved hjelp av RT-qPCR eller elektrofysiologi13. Begge tilnærmingene vil imidlertid kreve fjerning av kollagen ved bruk av kollagenase, da hydrogellaget hindrer både RNA-ekstraksjon og fysisk tilgang til cellene med en mikropipette.
Figur 1: Konseptuell illustrasjon av den innebygde utskriftsmetoden i SHAPE. En kollagenløsning blandes med alginatmikropartikler for å danne SHAPE-kompositten; SHAPE-kompositten brukes som et støttemateriale for innebygd 3D-utskrift av hNSC, som er differensiert i nevroner inne i den glødde støtten. De biofunksjonelle egenskapene til SHAPE-kompositten tillater nevronene å utvide projeksjoner og fylle den tomme delen av støtten med sine aksonale fremspring. Denne figuren er modifisert fra Kajtez et al.13. Forkortelser: SHAPE = selvhelbredende glødbar partikkel-ekstracellulær matrise; hNSCs = humane nevrale stamceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fremstilling av alginatmikropartikler . (A) Alginatoppløsningen etter gelering over natten. (B) Alginatmikropartiklene som genereres ved homogenisering. (C) Partikkelpelleten etter sentrifugering. (D) Pelleten resuspenderes i DMEM (E) før pH-justeringen og etter pH-justeringen. (F) Mikropartiklene etter inkubasjon i medium over natten og sentrifugering. (G) Et lysfeltbilde av de fabrikkerte alginatmikropartiklene. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Forberedelse for 3D-utskriftsprosessen. (A) En slurryplugg (~100 μL) lastes inn i sprøyten etterfulgt av (B) lasting av cellulær bioblekk (her supplert med fargede perler for visualiseringsformål). (C) Den koniske plastspissen (21 G) som brukes til innlasting av blekk, erstattes med en 27 G butt metallkanylespiss. (D) Sprøyten settes inn i 3D-printhodet. (E,F) SHAPE-kompositten pipetteres inn i en brønn med en 48-brønns plate. Tuben med SHAPE-kompositten holdes på is når den ikke håndteres. (G) Trykknålespissen settes inn i SHAPE-støtten, og utskriften av banen definert av datamaskindesignet startes (her er utskriften av en spiral avbildet). Forkortelse: SHAPE = selvhelbredende glødbar partikkel-ekstracellulær matrise. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: 3D-printede nevrale konstruksjoner inne i SHAPE-komposittstøtten. (A) Brightfield-bilder av trykte hNSC-er inne i støttehydrogelen. Spiral (venstre) og trestabel (høyre) konstruerer design vises. (B) Levende celleavbildning av en 3D-printet konstruksjon dagen etter utskrift (venstre) og etter nevrondifferensiering (høyre). (C) En 3D-trykt firkantet konstruksjon fjernet fra en dyrkingsbrønn med en slikkepott viser strukturell integritet. (D) Fluorescenskonfokale bilder av den samme firkantede konstruksjonen immunmerket for en nevronmarkør (TUBB3) og med motfargede kjerner (DAPI) som bekrefter vellykket differensiering av hNSC-ene i de 3D-printede konstruksjonene. Skalastenger = 500 μm (A, høyre); 100 μm (B,D). Panel C og D i denne figuren er modifisert fra Kajtez et al.13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SHAPE-tilnærmingen med komposittmaterialer gir en allsidig måte å formulere glødbare og biofunksjonelle støttebad for innebygd 3D-utskrift av cellulært blekk. Selv om denne protokollen gir et eksempel på 3D-utskrift av nevrale konstruksjoner, kan SHAPE-verktøykassen lett tilpasses biofabrikasjon med andre cellekilder for nøyaktig prosjektering av en rekke målvevstyper. Utskriftsmetoden vil også tillate nøyaktig mønster av flere celletyper for å studere deres interaksjon eller å konstruere vev med et definert romlig arrangement av de cellulære rommene (f.eks. Nevroner og gliaceller). I motsetning til de tradisjonelle granulære gelene inneholder SHAPE-kompositten et utvidet interstitielt rom (~30 % volumfraksjon for formuleringen presentert i denne protokollen). Den granulære komponenten fungerer som en reologisk modifikator som gir kompositten gunstige materialegenskaper for høyoppløselig innebygd utskrift. Dette åpner en rute mot en rasjonell utforming av det cellulære mikromiljøet ved å endre formuleringen av den kontinuerlige komponenten samtidig som den samme granulære komponenten beholdes. For eksempel kan andre funksjonelle ECM-molekyler bli introdusert til støttebadet (f.eks. hyaluronsyre, lamininer, fibronektin), eller forskjellige kryssbindingsmekanismer kan utnyttes (f.eks. enzymatisk, lysbasert)13. Videre kan alginatet i den granulære komponenten erstattes med mikropartikler fra forskjellige hydrogelmaterialer (f.eks. gelatin8, polyetylenglykol14,15, agarose 16) eller fremstilles i forskjellige størrelser og former i tråd med behovene til forskjellige vevstekniske eller sykdomsmodelleringsapplikasjoner. Forholdet mellom den granulære og kontinuerlige fasen kan justeres i henhold til behovene til individuelle 3D-utskriftsprosjekter, men å øke den kontinuerlige fasen utover 30 % kan kompromittere utskriftskvaliteten og oppløsningen.
Under mikrogelproduksjonstrinnene er det avgjørende at omrøringen av alginatoppløsningen etter tilsetning av eddiksyre er effektiv gjennom hele volumet av geleringsoppløsningen. Hvis omrøringshastigheten er for lav eller magnetomrøreren er for liten, kan omrøringen ikke nå de øvre lagene av løsningen, noe som vil bli til et stort volum tverrbundet bulkhydrogel, mens de nedre lagene vil bli skåret. Homogeniseringen av en inkonsekvent avskåret alginathydrogel vil resultere i generering av alginatmikropartikler som er suboptimale for 3D-utskriftsapplikasjoner. Videre må alginatmikropartiklene blandes grundig med kollagenoppløsningen, siden en ikke-homogen blanding vil resultere i flekker av støttematerialet som mangler kollagen; Disse patchene ville ikke bli glødet og ville dermed mangle celle-interaktive funksjoner. Det kan også være flekker som mangler alginatmikropartikler og derfor ikke støtter utskrift. En inhomogent blandet utskriftsstøtte ville derfor ikke kunne støtte hi-fi-utskrift og ville være strukturelt kompromittert, da den ikke ville bli glødet gjennom hele volumet. Bobler bør også unngås, ikke fordi de kan være skadelige for cellene, men fordi luftlommer kan forårsake deformasjoner under utskrift og forstyrre avbildningen av konstruksjonene. To vanlige kilder til bobler er vortexing (mikrobobler i den kalde støtten som utvider seg under støtteglødningen ved 37 °C) og kraftig pipettering.
SHAPEs sammensatte støtte i dette arbeidet ble ikke formulert som et offermateriale som skulle fjernes etter utskrift, men snarere som en langsiktig biofunksjonell støtte for både stamcelledifferensiering og nevronvekst og funksjonell modning. Sammenlignet med granulære geler som ikke er glødet etter utskrift, gir den strukturelle stabiliteten og gjennomsiktigheten til det glødede SHAPE-komposittmaterialet et beskyttende miljø for delikate nevronegenskaper under fikserings- og immunmerkingsprosessen, og som sådan letter dette materialet morfologisk karakterisering via visualisering av antigener. Fluorescensreportere kan også brukes til å spore endringer i cellulær morfologi over tid, samt å overvåke cellulær proliferasjon og migrasjon innenfor den glødde utskriftsstøtten. Videre kan kalsiumavbildningsmetoder brukes til å gi informasjon om spontan cellulær aktivitet (f.eks. Avfyring av aksjonspotensialer i nevroner eller til og med synkron nevronnettverksaktivitet). Imidlertid kan kjemisk stimulering av de konstruerte cellulære konstruksjonene (f.eks. Neuronal stimulering ved bruk av KCl) være vanskelig på grunn av hydrogellaget som omgir cellene, noe som reduserer diffusjon og forhindrer øyeblikkelig modulering av det cellulære mikromiljøet. Optogenetisk stimulering gir et bedre alternativ for kontroll av cellulær aktivitet, da SHAPE-hydrogelene ikke hindrer optisk tilgang til cellene.
Oksygenfølsomme perler kan inkorporeres i bioblekket eller i støttematerialet (via direkte utskrift eller dispersjon under komposittpreparering) for å muliggjøre levende romlig og tidsmessig kartlegging av oksygenspenningsnivåene i og rundt de trykte konstruksjonene med høy følsomhet13. Denne ikke-invasive 3D-oksygenkartleggingsmetoden basert på fosforescenslevetidsmålinger gir en rute mot ingeniørvevskonstruksjoner med forbedret oksygenering, og sannsynligvis også forbedret næringstilførsel. Dårlig oksygenering kan føre til dannelse av nekrotiske regioner i de trykte konstruksjonene, forstyrre stamcelledifferensiering og påvirke nevronmetabolismen. Oksygenkartlegging gir en avlesning basert på hvilken 3D-utskriftsdesignet kan endres for å lette jevn oksygenering gjennom hele konstruksjonen, finjustering av oksygennivåene for å matche fysiologiske forhold eller generering av oksygengradienter.
Konstruerte kanaler kan også innlemmes i den glødbare utskriftsstøtten ved å trykke et offerblekk, for eksempel gelatin, som størkner inne i kaldstøttebadet, men lett kan evakueres ved 37 ° C 4,13. Kanaler vil være nødvendig for å levere næringsstoffer og oksygen til vevskonstruksjoner med høy celletetthet eller dimensjoner som overskrider mulighetene til en designbasert oksygenspenningsmanipulasjonstilnærming. I tillegg kan vaskulære kanaler utnyttes for å skape gradienter av små molekyler som driver mønsteret av cellulær identitet, modulerer cellulær aktivitet eller veileder kjemotaksis.
Oppsummert tilbyr innebygd 3D-utskrift inne i SHAPE-kompositten en modulær materialplattform som er lett å tilpasse og har allsidig potensial for funksjonell modellering av mekanisk følsomme vev. Protokollen som presenteres her, gir en detaljert forklaring på de nødvendige trinnene og grunnleggende prinsippene som trengs for å generere støttematerialet og skrive ut mobilblekket med høy kvalitet. Tilnærmingen utnytter rimelige materialer og tilgjengelig utstyr, samtidig som det gir rom for personlig tilpasning av tilnærmingen til individuelle forskeres behov og applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forskningen ble primært finansiert av BrainMatTrain European Union Horizon 2020 Programme (nr. H2020-MSCA-ITN-2015) under Marie Skłodowska- Curie Initial Training Network og Grant Agreement No. 676408. C.R. og J.U.L. takker Lundbeckstiftelsen (R250-2017-1425) og Danmarks uavhengige forskningsfond (8048-00050) for deres støtte. Vi takker for finansiering av HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01-prosjektet 101047177 OpenMIND.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Gastight Syringe 1001 TLL | Hamilton | 81320 | |
| 3DDiscovery 3D bioprinter | RegenHU | ||
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| AlbuMAX | ThermoFisher | 11020021 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | Goat anti-Mouse |
| Blunt Needle, Sterican (21 G) | Braun | 9180109 | |
| Blunt Needle (27 G) | Cellink | NZ5270505001 | |
| BioCAD software | SolidWorks | ||
| Calcein AM | ThermoFisher | 65-0853-39 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C5929 | |
| Dibutyryl-cAMP sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL) | R&D Systems | 3440-100-01 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | ThermoFisher | 10565018 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190094 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF | R&D Systems | 3718-FB | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 100496 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1569601 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES Buffer (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | 5129 | |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| Magnetic stirrer RET basic | IKA | 3622000 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| S25N-10G dispersing tool | IKA | 4447100 | |
| Sodium Alginate (80-120 cP) | FUJIFILM Wako | 194-13321 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer | IKA | 3720000 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin/EDTA Solution | ThermoFisher | R001100 | |
| TUBB3 antibody | BioLegend | 801213 | Mouse |
| Xanthan gum | Sigma-Aldrich | G1253 |
References
- Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional printing of 3D microvascular networks. Advanced Materials. 23 (24), H178-H183 (2011).
- Bhattacharjee, T., et al.
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
- Skylar-Scott, M. A., et al. Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellular density and embedded vascular channels. Science Advances. 5 (9), (2019).
- Highley, C. B., Rodell, C. B., Burdick, J. A. Direct 3D printing of shear-thinning hydrogels into self-healing hydrogels. Advanced Materials. 27 (34), 5075-5079 (2015).
- Romanazzo, S., et al. Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).
- Noor, N., et al. 3D printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts. Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- LeBlanc, K. J., et al. Stability of high speed 3D printing in liquid-like solids. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1796-1799 (2016).
- Prendergast, M. E., Burdick, J. A. Computational modeling and experimental characterization of extrusion printing into suspension baths. Advanced Healthcare Materials. 11 (7), 2101679 (2022).
- Shapira, A., Noor, N., Oved, H., Dvir, T. Transparent support media for high resolution 3D printing of volumetric cell-containing ECM structures. Biomedical Materials. 15 (4), 45018 (2020).
- McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. 3D printing in suspension baths: Keeping the promises of bioprinting afloat. Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).
- Kajtez, J., et al. Embedded 3D printing in self-healing annealable composites for precise patterning of functionally mature human neural constructs. Advanced Science. 9 (25), 2201392 (2022).
- Rommel, D., Vedaraman, S., Mork, M., de Laporte, L. Interlinked macroporous 3D scaffolds from microgel rods. Journal of Visualized Experiments. (184), e64010 (2022).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Mirdamadi, E., Muselimyan, N., Koti, P., Asfour, H., Sarvazyan, N. Agarose slurry as a support medium for bioprinting and culturing freestanding cell-laden hydrogel constructs. 3D Printing and Additive Manufacturing. 6 (3), 158-164 (2019).
