Summary
Dette arbejde beskriver en protokol til freeform embedded 3D-print af neurale stamceller inde i selvhelende annealable partikel-ekstracellulære matrixkompositter. Protokollen muliggør programmerbare mønstre af sammenkoblede humane neurale vævskonstruktioner med høj troskab.
Abstract
Den indlejrede 3D-udskrivning af celler inde i et granulært støttemedium er opstået i det sidste årti som en kraftfuld tilgang til fri form biofabrikation af blødt vævskonstruktioner. Imidlertid er granulære gelformuleringer blevet begrænset til et begrænset antal biomaterialer, der muliggør omkostningseffektiv generering af store mængder hydrogelmikropartikler. Derfor har granulære gelstøttemedier generelt manglet de celleklæbende og cellelærende funktioner, der findes i den native ekstracellulære matrix (ECM).
For at løse dette er der udviklet en metode til generering af selvhelende annealable partikel-ekstracellulær matrix (SHAPE) kompositter. SHAPE-kompositter består af en granulær fase (mikrogeler) og en kontinuerlig fase (viskøs ECM-opløsning), der tilsammen giver mulighed for både programmerbar hi-fi-udskrivning og et justerbart biofunktionelt ekstracellulært miljø. Dette arbejde beskriver, hvordan den udviklede metode kan anvendes til præcis biofabrikation af menneskelige neurale konstruktioner.
For det første fremstilles alginatmikropartikler, der tjener som den granulære komponent i SHAPE-kompositterne, og kombineres med en kollagenbaseret kontinuerlig komponent. Derefter udskrives humane neurale stamceller inde i støttematerialet efterfulgt af udglødning af støtten. De trykte konstruktioner kan opretholdes i uger for at muliggøre differentiering af de trykte celler i neuroner. Samtidig muliggør kollagens kontinuerlige fase aksonal udvækst og sammenkobling af regioner. Endelig giver dette arbejde information om, hvordan man udfører levende cellefluorescensbilleddannelse og immuncytokemi for at karakterisere de 3D-printede humane neurale konstruktioner.
Introduction
Den præcise og programmerbare 3D-udskrivning af cellebelastede hydrogelkonstruktioner, der efterligner blødt væv in vitro , udgør en stor udfordring. For eksempel er forsøg baseret på direkte ekstrudering af bløde hydrogeler i sagens natur problematiske, da de dårlige mekaniske egenskaber, der kræves for at rekapitulere in vivo-mikromiljøet , fører til mangel på strukturel integritet, deformationer af de foruddefinerede træk eller fuldstændig sammenbrud af de fremstillede strukturer. En konventionel løsning på dette problem er at udskrive et støttestillads fra et stivere biokompatibelt materiale, der gør det muligt for den endelige konstruktion at bevare sin form. Denne tilgang begrænser imidlertid i høj grad designmulighederne og kræver omhyggelig rheologisk finjustering af de tilstødende blæk.
For at overvinde begrænsningerne ved den traditionelle lag-for-lag-ekstruderingsbaserede 3D-udskrivning er indlejret 3D-udskrivning dukket op i de senere år som et stærkt alternativ til fremstilling af blødt materiale og væv 1,2,3,4,5,6. I stedet for at ekstrudere blækket i den omgivende luft oven på en overflade, deponeres blækket direkte gennem en sprøjtenål inde i et støttebad, der er faststoflignende i hvile, men reversibelt fluidiserer omkring den bevægelige nålespids for at muliggøre præcis aflejring af blødt cellebelastet materiale. Det aflejrede materiale holdes på plads, da støtten størkner i kølvandet på nålen. Som sådan giver indlejret 3D-udskrivning mulighed for højopløselig friformsfremstilling af indviklede strukturer fra bløde biomaterialer med udvidede designmuligheder 7,8.
Granulære geler er blevet grundigt undersøgt som støttebadematerialer til indlejret 3D-udskrivning, da de kan formuleres til at udvise glatte, lokaliserede og reversible fast-til-væske-overgange ved lave udbyttespændinger 9,10,11. Mens de viser fremragende rheologiske egenskaber til udskrivning i høj opløsning, er granulære geler begrænset til en håndfuld biomaterialer12. Manglen på mangfoldighed i granulære gelformuleringer, hvilket er særlig tydeligt, hvis man overvejer den brede vifte af biomaterialer, der er tilgængelige til bulkhydrogelformuleringer, skyldes behovet for omkostningseffektiv generering af et stort antal mikrogeler ved hjælp af enkle kemikalier. På grund af det begrænsede biomaterialelandskab af granulære gelstøtter udgør tuningen af det ekstracellulære mikromiljø, der leveres af udskrivningsstøtten, en udfordring i marken.
For nylig er der udviklet en modulær tilgang til generering af indlejrede 3D-printunderstøtninger, kaldet selvhelende udglødelige partikel-ekstracellulære matrix (SHAPE) kompositter13. Denne tilgang kombinerer de forskellige rheologiske egenskaber ved granulære geler med den biofunktionelle alsidighed af bulkhydrogelformuleringer. Den præsenterede SHAPE-kompositstøtte består af pakkede alginatmikropartikler (granulær fase, ~ 70% volumenfraktion) med et øget interstitiel rum fyldt med en viskøs kollagenbaseret ECM pregel-opløsning (kontinuerlig fase, ~ 30% volumenfraktion). Det har endvidere vist sig, at SHAPE-understøttelsen letter højopløsningsaflejring af humane neurale stamceller (hNSC'er), der efter udglødningen af støttebadet kan differentieres til neuroner og opretholdes i uger for at nå funktionel modning. Indlejret 3D-udskrivning inde i SHAPE-støttebadet overvinder nogle af de største begrænsninger i forbindelse med konventionelle teknikker til biofabrikation af neuralt væv, samtidig med at det giver en alsidig platform.
Dette arbejde beskriver trinene til den indlejrede 3D-udskrivning af hNSC'er inde i SHAPE-understøttelsen og deres efterfølgende differentiering i funktionelle neuroner (figur 1). For det første genereres alginatmikropartikler via klipning under intern gelering. Denne tilgang muliggør nem generering af store mængder mikropartikler uden behov for specialudstyr og cytotoksiske reagenser. Desuden er alginat en bredt tilgængelig og økonomisk materialekilde til dannelse af biokompatible hydrogelsubstrater til en bred vifte af celletyper. De genererede alginatmikropartikler kombineres med en kollagenopløsning for at danne SHAPE-kompositstøttematerialet. Derefter høstes hNSC'erne og lægges i en sprøjte som et cellulært bioblæk til 3D-udskrivning. En 3D-bioprinter bruges til ekstruderingsbaseret indlejret udskrivning af hNSC'er inde i SHAPE-kompositten. De 3D-printede celler differentieres til neuroner for at give anledning til rumligt definerede og funktionelle menneskelige neurale konstruktioner. Endelig beskriver protokollen, hvordan de genererede vævskonstruktioner kan karakteriseres ved hjælp af levende cellebilleddannelse og immuncytokemi. Derudover gives tip til optimering og fejlfinding. Især kunne både komponenterne i de granulære og kontinuerlige faser udveksles med andre hydrogelformuleringer for at imødekomme forskellige biofunktionelle dele, mekaniske egenskaber og tværbindingsmekanismer, som krævet af andre celle- og vævstyper ud over neurale applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af buffere og reagenser
- Forbered cellevækstmedium ved at tilføje følgende kosttilskud til DMEM / F12 med L-alanyl-L-glutamindipeptid: 30 mM glucose, 5 μM HEPES, 0,5% w / v lipidrig bovin serumalbumin, 40 μM L-alanin, 40 μM L-asparaginmonohydrat, 40 μM L-asparaginsyre, 40 μM L-glutaminsyre, 40 μM L-prolin, 1% N2 supplement, 1% penicillin-streptomycin og 20 ng / L hver af epidermal vækstfaktor (EGF) og fibroblastvækstfaktor (FGF). Udfør disse trin i en laminær luftstrømsbænk (LAF).
- Der fremstilles 1 % w/v alginatopløsning i ultrarent vand under kraftig omrøring i 4 timer ved 60 °C. Sterilfiltrer den opløste, varme alginatopløsning med et 0,45 μm porestort filter i en LAF-bænk. Opbevares ved 4 °C.
BEMÆRK: Hvis alginatopløsningens temperatur er under 60 °C, vil det ikke være muligt at føre den gennem filteret. - Forbered en 37 g/l NaHCO3-opløsning i ultrarent vand. Opløsningens pH justeres til 9,5 ved hjælp af NaOH, og filtersteriliseres i en LAF-bænk. Opbevar opløsningen ved 4 °C.
2. FORM forberedelse af kompositmateriale
- Alginatmikropartikelgenerering
- Der fremstilles en 2 mg/ml CaCO3 opløsning i ultrarent vand i et sterilt bægerglas. Bland det 1:1 med alginatopløsningen, og rør i 1 time ved stuetemperatur ved hjælp af en magnetisk omrører.
- Tilsæt eddikesyre i forholdet 1:500, og lad omrøring stå natten over ved 650 o / min.
BEMÆRK: Alginatopløsningen begynder at gelere med det samme. Sørg for at bruge en omrøringsmagnet med samme længde som diameteren på det glas, der bruges til at sikre optimal, homogen omrøring af formgelen. Den næste dag vises opløsningen, der genereres via omrøring under gelering, tyktflydende (figur 2A). - Den gelerede alginatopløsning fragmenteres mekanisk i mikropartikler ved at homogenisere den ved 15.000 omdr./min. i 10 minutter med en homogenisator anbragt i en LAF-bænk (figur 2B).
- Mikropartiklerne centrifugeres ved 18.500 × g i 20 minutter (figur 2C) ved stuetemperatur.
- Supernatanten kasseres forsigtigt inde i LAF-prøvebænken, partiklerne i DMEM, der indeholder 2 mM NaOH og 1 % P/S, resuspenderes, og inkuberes natten over ved 4 °C (figur 2D).
BEMÆRK: Affjedringens farve skal gå tilbage til rød. Hvis suspensionen forbliver gul, tilsættes NaOH dråbevis og blandes, indtil den bliver rød (figur 2E). - Partiklerne homogeniseres ved 15.000 o/min i 3 min., og centrifugeres ved 18.500 × g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Pelletten observeres (figur 2F), og supernatanten fjernes forsigtigt.
BEMÆRK: Pellet af tæt pakket alginatmikropartikler kan opbevares ved 4 °C indtil yderligere brug. Hvis alginatopløsningen ikke blev filtersteriliseret, skal mikropartiklerne opbruges inden for 1 uge.
- SHAPE sammensat formulering
- Dagen før udskrivning resuspenderes alginatmikropartikelpelleten i to gange volumenet vækstmedium indeholdende 4% HEPES (1 M stock) og 4% NaHCO3-opløsning i en LAF-bænk og inkuberes natten over ved stuetemperatur.
- Mikrogelsuspensionen centrifugeres ved 18.500 × g i 10 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten kasseres.
- Neutraliser kollagen, der skal blandes med alginatmikropartiklerne i en LAF-bænk. Fortynd kollagenstamopløsningen for at nå en endelig koncentration på 1 mg/ml, og neutralisere den ved at tilsætte 4% HEPES og 4% NaHCO3. For eksempel blandes 2 ml alginatmikropartikler med 1 ml neutraliseret kollagen (0,12 ml HEPES, 0,12 ml NaHCO 3, 0,16 ml vækstmedium og 0,6 ml kollagen) til3 ml SHAPE-komposit.
BEMÆRK: Alle materialer, der blandes med kollagen, skal håndteres på is for at undgå kollagenpolymerisation. Så snart kollagen er neutraliseret, starter polymerisationen langsomt. - Generer SHAPE-kompositten ved at blande alginatmikropartikelpelleten med det fortyndede og neutraliserede kollagen i forholdet 2: 1. Bland gelen grundigt ved at pipettere langsomt op og ned på is i en LAF-bænk.
BEMÆRK: Må ikke hvirvel, da dette vil indføre bobler i støttematerialet. - I en LAF-bænk overføres det genererede kompositmateriale til en afkølet mikrobrøndplade eller en hvilken som helst egnet trykbeholder, og brug inden for 30 minutter (figur 3E, F).
3. hNSC-kultur og bioblækforberedelse
- Dyrk cellerne i en kældermembranekstraktbelagt T75-kolbe i vækstmedium. Passage cellerne mindst to gange efter optøning, før du bruger dem til et 3D-printeksperiment.
- Før udskrivning dissocieres cellerne enzymatisk ved hjælp af en 0,025% trypsinopløsning i 5 minutter ved 37 °C, neutraliserer trypsinet med vækstmedium og centrifugeres cellesuspensionen ved 400 × g i 5 minutter ved stuetemperatur. Efter centrifugeringen aspireres supernatanten, og pelletsen resuspenderes i 2-3 ml vækstmedium.
- Udfør en celletælling, centrifuger cellerne ved 400 × g, og resuspender pellet i vækstmedium suppleret med 0,1% xanthangummi (for at forhindre cellerne i at sedimentere) i en slutkoncentration på 9 × 106 celler / ml.
- Brug en 21 G stump metalkanyle til at fylde 100 μL tæt pakkede alginatmikropartikler i en sprøjte (figur 3A).
BEMÆRK: Oprettelse af et stik med alginatmikropartiklerne tjener to formål: det hjælper med at opretholde ekstruderingsstabilitet under udskrivning og muliggør fuldstændig ekstrudering af det indlæste cellulære blæk (intet dødt volumen). - Brug den samme kanyle til at fylde den tilberedte cellesuspension i sprøjten (figur 3B).
BEMÆRK: Vær ekstra forsigtig med ikke at indføre luftbobler under sprøjtens påfyldningstrin. Luftbobler vil forårsage ustabilitet under udskrivning. - Udskift kanylen med en 27 G stump metalnål, som skal bruges til udskrivning (figur 3C).
4. Indlejret 3D-udskrivning
- Design en struktur til udskrivning ved hjælp af den refererede software (se materialetabellen).
BEMÆRK: Sørg for at justere den oprindelige højde på den trykte struktur inden for dybden af SHAPE-kompositstøtten. Designforslag findes i figur 4A (spiral- og træbunkedesign). - Generer en G-kode ved at klikke på Generer.
- Indsæt den cellebelastede glassprøjte i et volumetrisk ekstruderingshoved på en ekstruderingsbaseret bioprinter (figur 3D).
- Mål kanylelængden på den cellebelastede glassprøjte ved at klikke på Måling af kanylelængde.
- Placer mikrobrøndpladen eller beholderen, der er fyldt med SHAPE-kompositten, på printeren.
BEMÆRK: Opbevar cellepladen eller beholderen ved 4 °C indtil udskrivning for at forhindre for tidlig tværbinding af understøtningen. - Mål overfladehøjden af en tom brønd inden for den samme mikrobrøndplade eller beholder, som SHAPE-gelen er lagt i, ved at klikke på SHM (overfladehøjdemåling).
BEMÆRK: Alternativt kan du bestemme overfladehøjden manuelt ved at måle brøndens højde med nålen. - Indstil ekstruderingshastigheden til 3,6 μL/min og tilspændingen til 0,3 mm/s.
BEMÆRK: Sørg for at teste ekstruderingen før udskrivning. Cellesedimentering kan forårsage tilstopning af dysen og kan undgås ved at præekstrudere et lille volumen før den faktiske indlejrede udskrivning eller ved at tilføje et tilbagetrækningsvolumen til den volumetriske sprøjte. I nogle tilfælde skal tilførselshastigheden holdes under 0,5 mm/s , når nålen indsættes i eller ud af SHAPE-gelen for at undgå, at blækket trækkes. - Indlæs G-koden i printerens brugergrænseflade.
BEMÆRK: Der skal genereres en ny G-kode, hver gang der foretages ændringer i den designede struktur. - Start udskrivningsproceduren ved at klikke på Kør (figur 3G).
- Umiddelbart efter udskrivning anbringes SHAPE-gelen ved 37 °C i en cellekulturkuvøse i 30 minutter til udglødning.
- Tilsæt forsigtigt vækstmedium oven på den udglødede SHAPE gelstøtte.
- Den næste dag udskiftes vækstmediet med differentieringsmedium formuleret som følger: DMEM / F12 med L-alanyl-L-glutamindipeptid med 30 mM glucose, 5 μM HEPES, 0,5% w / v lipidrig bovin serumalbumin, 40 μM L-alanin, 40 μM L-asparaginmonohydrat, 40 μM L-asparaginsyre, 40 μM L-glutaminsyre, 40 μM L-prolin, 1% N2 supplement, 1% penicillin-streptomycin, 100 μM dibutyrylcyklisk adenosinmonophosphat (dibutyryl-cAMP), og 2 ng / ml gliacellelinjeafledt neurotrofisk faktor (GDNF).
BEMÆRK: Sørg for ikke at beskadige hydrogelen under medieændringerne. Vip pladen, og fjern det gamle medium forsigtigt. Tilsæt frisk medium dråbevis til væggen i brønden, der indeholder gelen, snarere end direkte oven på gelen. Brug ikke en aspirator til at fjerne mediet. - Differentieringsmediet opdateres hver 2. dag indtil det eksperimentelle endepunkt.
5. Billeddannelse af levende cellefluorescens
- Fjern overskydende medium fra gelen.
- Der tilsættes et tilsvarende volumen på 20 μM Calcein AM (fortyndet i differentieringsmedium fra stamopløsningen) til volumenet af støttegelen.
- Der inkuberes i 40 minutter ved 37 °C.
- Calcein AM-opløsningen fjernes, og der tilsættes en passende mængde frisk differentieringsmedium.
- Overfør pladen til mikroskopet til billeddannelse.
6. Immuncytokemi
- Fjern overskydende medium fra gelen.
- Brug en lille spatel til at overføre gelen til en større beholder indeholdende DPBS.
- Vask tre gange i 20 minutter hver gang med DPBS, og overfør pladen til en stinkhætte.
- Fjern DPBS, tilsæt nok 4% formaldehydopløsning til at dække gelen, og inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask tre gange med DPBS i 20 min hver gang.
- Forbered blokeringsopløsning bestående af 5% æselserum, 0,25% vaskemiddel og 0,02% natriumazid i DPBS.
BEMÆRK: Forbered tre gange det volumen, der er nødvendigt for at dække gelen; Det vil senere blive brugt som grundlag for de primære og sekundære antistofopløsninger. - Efter vask med DPBS tilsættes blokeringsopløsningen til gelen og inkuberes i 6 timer ved stuetemperatur for at forhindre uspecifik binding. Rock pladen forsigtigt.
- Forbered den primære antistofopløsning ved at fortynde TUBB3-antistoffet i blokerende opløsning i forholdet 1:1.000.
- Den blokerende opløsning fjernes fra gelen, den primære antistofopløsning tilsættes og inkuberes i 48 timer ved 4 °C. Rock pladen forsigtigt.
- Vask tre gange med DPBS i 20 min hver gang.
- Den sekundære antistofopløsning fremstilles ved fortynding af 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1:1,000) og det sekundære antistof (1:200) i blokerende opløsning.
- Efter vask med DPBS inkuberes gelen i den sekundære antistofopløsning i 24 timer ved 4 °C. Rock pladen forsigtigt.
- Vask tre gange med DPBS i 20 minutter hver gang, og opbevar ved 4 °C indtil billeddannelse.
- Før billeddannelse overføres den farvede gel med en spatel til en skål eller en brøndplade med en tynd billedbund.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alginatmikrogelpræparation via forskydningsudtynding under intern gelering efterfulgt af mekanisk fragmentering giver alginatmikrogeler, der er polydispergerede i størrelse og flagelignende i form som vist i figur 2G. Størrelsen af disse uregelmæssige partikler varierer fra mindre end 1 μm til ca. 40 μm i diameter. Når mikropartiklerne er tæt pakket, danner de et gennemsigtigt bulkmateriale, der kun er lidt mere uigennemsigtigt end det tilsvarende cellekulturmedium (figur 2F). Gennemsigtigheden af støttematerialet er et vigtigt aspekt af platformen, da det giver mulighed for visualisering af de trykte strukturer i dyrkningsperioden samt for konfokalmikroskopi i høj opløsning af konstruktioner mærket både med levende cellefarvestoffer og via immuncytokemi. Når den gennemblødes i bufret cellekulturmedium, skal den resulterende pH-justerede gel have en rød farve, hvilket indikerer fysiologiske tilstande (figur 2F). Det er vigtigt at neutralisere pH i alginatmikropartiklerne af to grunde. Sure mikropartikler kan direkte skade cellerne. Desuden vil et surt miljø forhindre en vellykket glødning af SHAPE-kompositstøtten, da det ville forstyrre kollagenpolymerisationen.
Udskrivning af hNSC-blækket ved hjælp af parametrene beskrevet ovenfor giver et filament af celler, der er ~ 200 μm i diameter (figur 4A). Den programmerede geometri bevares både ved udskrivning i et plan og ved udskrivning af strukturer oven på hinanden. I tilfælde af flerlagsudskrivning forbliver de trykte strukturer intakte med en mindste lag-til-lag-afstand på 200 μm13. Cellernes levedygtighed bør ikke påvirkes væsentligt under tilberedning og ekstrudering af blækket. De trykte tråde er rige på levende celler, der har en rund morfologi (figur 4B, venstre). Huller i de trykte tråde kan vises dagen efter udskrivning, selvom den fremstillede konstruktion ikke viser nogen deformationer umiddelbart efter udskrivning. Dette er sandsynligvis resultatet af inhomogen blanding af understøtningen. Da cellerne ikke interagerer med alginatmikropartiklerne, migrerer de væk fra de alginatrige områder mod de kollagen- og cellerige områder, hvilket forårsager brud i de trykte tråde. Desuden skal SHAPE-understøttelsen være boblefri, da luftlommer kan forstyrre udskrivningsnøjagtigheden.
Vellykket differentiering af hNSC'er bør give neuronrige strukturer 30 dage efter udskrivning, hvor celler udviser neuronal morfologi med små cellelegemer og lange tynde processer (figur 4B, højre). Hvis der udskrives tætte mønstre, såsom et rektangulært ark celler, bør der desuden ikke dannes synlige huller eller aggregater under differentiering, men snarere bør et kontinuerligt lag af celler forblive intakt (figur 4C). I denne protokol beskrives en procedure for fluorescensimmuncytokemi af de 3D-printede prøver. Farvning til TUBB3, en cytoplasmatisk neuronal markør, muliggør direkte visualisering af de genererede neuronale netværk. Fluorescensmikroskopien af de differentierede udskrifter skal afsløre strukturer, der er rige på TUBB3 og med vedligeholdt geometri (figur 4D, venstre). Under differentieringsprocessen migrerer cellerne ikke ud af de trykte tråde, som det kan observeres ved farvning for cellekerner med DAPI (figur 4D, midten). Som et resultat observeres neuronale legemer inden for grænserne af den trykte geometri med aksonale fremspring, der udstråler hundreder af mikrometer ind i SHAPE-støtten, der omgiver konstruktionen. Den aksonale udforskning af det omgivende volumen indikerer, at SHAPE-understøttelsen giver biofunktionelle signaler, der tillader aksonal stifinding. Mere modne neuronale markører eller subtype-specifikke markører kunne anvendes i immuncytokemi til yderligere at karakterisere de genererede neuronale populationer. Desuden kunne den trykte neuronale konstruktion karakteriseres ved hjælp af RT-qPCR eller elektrofysiologi13. Begge tilgange ville imidlertid kræve fjernelse af kollagen ved hjælp af collagenase, da hydrogellaget forhindrer både RNA-ekstraktion og fysisk adgang til cellerne med en mikropipette.
Figur 1: Konceptuel illustration af SHAPE-metoden til integreret udskrivning. En kollagenopløsning blandes med alginatmikropartikler til dannelse af SHAPE-kompositten; SHAPE-kompositten bruges som støttemateriale til indlejret 3D-udskrivning af hNSC'er, som differentieres til neuroner inde i den udglødede støtte. De biofunktionelle egenskaber af SHAPE-kompositten tillader neuronerne at udvide fremskrivninger og udfylde den tomme del af støtten med deres aksonale fremskrivninger. Dette tal er ændret fra Kajtez et al.13. Forkortelser: SHAPE = selvhelende udglødelig partikel-ekstracellulær matrix; hNSC'er = humane neurale stamceller. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fremstilling af alginatmikropartikler . (A) Alginatopløsningen efter gelering natten over. B) De alginatmikropartikler, der fremkommer ved homogenisering. C) Partikelpellet efter centrifugering. D) Pellet resuspenderet i DMEM (E) før pH-justeringen og efter pH-justeringen. F) Mikropartiklerne efter inkubation i medium natten over og centrifugering. (G) Et brightfield-billede af de fremstillede alginatmikropartikler. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Forberedelse til 3D-printprocessen. (A) En gylleprop (~100 μL) lægges i sprøjten efterfulgt af (B) påfyldning af cellebioblækket (her suppleret med farvede perler til visualiseringsformål). C) Den koniske plastspids (21 G), der anvendes til ilægning af blæk, erstattes med en 27 G stump metalnålespids. (D) Sprøjten indsættes i 3D-printhovedet. (E,F) SHAPE-kompositmaterialet pipetteres ind i en brønd på en 48-brønds plade. Røret med SHAPE-kompositmaterialet holdes på is, når det ikke håndteres. (G) Tryknålespidsen indsættes i SHAPE-understøtningen, og udskrivningen af den sti, der er defineret af computerdesignet, påbegyndes (her er udskrivningen af en spiral afbildet). Forkortelse: SHAPE = selvhelende udglødelig partikel-ekstracellulær matrix. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: 3D-printede neurale konstruktioner inde i den sammensatte SHAPE-understøttelse. (A) Brightfield-billeder af trykte hNSC'er inde i støttehydrogelen. Spiral (venstre) og træbunke (højre) konstruktioner design vises. (B) Live-celle-billeddannelse af en 3D-printet konstruktion dagen efter udskrivning (venstre) og efter neuronal differentiering (højre). (C) En 3D-printet firkantet konstruktion fjernet fra en dyrkningsbrønd med en spatel viser strukturel integritet. (D) Fluorescenskonfokale billeder af samme firkantede konstruktion immunmærket til en neuronal markør (TUBB3) og med modfarvede kerner (DAPI), der bekræfter den vellykkede differentiering af hNSC'erne inden for de 3D-printede konstruktioner. Skalastænger = 500 μm (A, højre); 100 μm (B,D). Panelerne C og D i denne figur er blevet ændret fra Kajtez et al.13. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SHAPE-kompositmaterialetilgangen giver en alsidig rute til formulering af udglødelige og biofunktionelle støttebade til indlejret 3D-udskrivning af cellulært blæk. Mens denne protokol giver et eksempel på 3D-udskrivning af neurale konstruktioner, kunne SHAPE-værktøjskassen let tilpasses biofabrikation med andre cellekilder til præcis konstruktion af en række målvævstyper. Udskrivningsmetoden vil også give mulighed for præcis mønster af flere celletyper for at studere deres interaktion eller for at konstruere væv med et defineret rumligt arrangement af de cellulære rum (f.eks. neuroner og gliaceller). I modsætning til de traditionelle granulerede geler indeholder SHAPE-kompositten et udvidet interstitiel rum (~30% volumenfraktion for formuleringen præsenteret i denne protokol). Den granulære komponent fungerer som en rheologisk modifikator, der giver kompositmaterialet gunstige materialeegenskaber til indlejret udskrivning med høj opløsning. Dette åbner en vej mod et rationelt design af det cellulære mikromiljø ved at ændre formuleringen af den kontinuerlige komponent, samtidig med at den samme granulære komponent bevares. For eksempel kan andre funktionelle ECM-molekyler introduceres til støttebadet (f.eks. Hyaluronsyre, lamininer, fibronectin), eller forskellige tværbindingsmekanismer kan udnyttes (f.eks. enzymatisk, lysbaseret)13. Desuden kan alginatet i den granulære komponent erstattes med mikropartikler fra forskellige hydrogelmaterialer (f.eks. Gelatine8, polyethylenglycol14,15, agarose 16) eller fremstilles i forskellige størrelser og former i overensstemmelse med behovene i forskellige vævstekniske eller sygdomsmodelleringsapplikationer. Forholdet mellem den granulære og kontinuerlige fase kan indstilles efter behovene i individuelle 3D-printprojekter, men at øge den kontinuerlige fase ud over 30% kan kompromittere printnøjagtigheden og opløsningen.
Under mikrogelproduktionstrinnene er det afgørende, at omrøringen af alginatopløsningen efter tilsætning af eddikesyre er effektiv i hele volumenet af geleringsopløsningen. Hvis omrøringshastigheden er for lav, eller magnetomrøreren er for lille, når omrøringen muligvis ikke de øverste lag af opløsningen, hvilket bliver til et stort volumen tværbundet bulkhydrogel, mens de nederste lag skæres. Homogeniseringen af en inkonsekvent klippet alginathydrogel vil resultere i dannelsen af alginatmikropartikler, der ikke er optimale til 3D-printapplikationer. Desuden skal alginatmikropartiklerne blandes grundigt med kollagenopløsningen, da en ikke-homogen blanding vil resultere i pletter af støttematerialet, der mangler kollagen; Disse patches ville ikke blive udglødet og ville derfor mangle celle-interaktive funktioner. Der kan også være patches, der mangler alginatmikropartikler og derfor ikke understøtter udskrivning. En inhomogent blandet trykunderstøttelse ville derfor ikke være i stand til at understøtte hi-fi-udskrivning og ville blive strukturelt kompromitteret, da den ikke ville blive udglødet i hele volumen. Bobler bør også undgås, ikke fordi de kan være skadelige for cellerne, men fordi luftlommer kan forårsage deformationer under udskrivning og forstyrre billeddannelsen af konstruktionerne. To almindelige kilder til bobler er hvirvelstrøm (mikrobobler i den kolde støtte, der udvider sig under støtteglødningen ved 37 °C) og kraftig pipettering.
SHAPE-kompositstøtten i dette arbejde blev ikke formuleret som et offermateriale, der skulle fjernes efter trykning, men snarere som en langsigtet biofunktionel støtte til både stamcelledifferentiering og neuronal vækst og funktionel modning. Sammenlignet med granulerede geler, der ikke udglødes efter trykning, giver den strukturelle stabilitet og gennemsigtighed af det udglødede SHAPE-kompositmateriale et beskyttende miljø for sarte neuronale træk under processen med fiksering og immunmærkning, og som sådan letter dette materiale morfologisk karakterisering via visualisering af antigener. Fluorescensreportere kan også bruges til at spore ændringer i cellulær morfologi over tid samt til at overvåge cellulær proliferation og migration inden for den udglødede udskrivningsunderstøttelse. Desuden kan calciumbilleddannelsesmetoder bruges til at give information om spontan cellulær aktivitet (f.eks. Affyring af handlingspotentialer i neuroner eller endda synkron neuronal netværksaktivitet). Imidlertid kan kemisk stimulering af de konstruerede cellulære konstruktioner (fx neuronal stimulering ved hjælp af KCl) være vanskelig på grund af hydrogellaget, der omgiver cellerne, hvilket bremser diffusion og forhindrer øjeblikkelig modulering af det cellulære mikromiljø. Optogenetisk stimulering giver en bedre mulighed for kontrol af cellulær aktivitet, da SHAPE-hydrogelerne ikke forhindrer optisk adgang til cellerne.
Oxygenfølsomme perler kan inkorporeres i bioblækket eller i støttematerialet (via direkte udskrivning eller spredning under kompositforberedelse) for at muliggøre levende rumlig og tidsmæssig kortlægning af iltspændingsniveauerne i og omkring de trykte konstruktioner med høj følsomhed13. Denne ikke-invasive 3D-iltkortlægningsmetode baseret på fosforescenslevetidsmålinger giver en rute mod tekniske vævskonstruktioner med forbedret iltning og sandsynligvis også forbedret næringsstofforsyning. Dårlig iltning kan føre til dannelse af nekrotiske regioner i de trykte konstruktioner, forstyrre stamcelledifferentiering og påvirke neuronal metabolisme. Oxygenkortlægning giver en aflæsning, baseret på hvilken 3D-printdesignet kan ændres for at lette ensartet iltning gennem hele konstruktionen, finjustering af iltniveauerne for at matche fysiologiske forhold eller generering af iltgradienter.
Konstruerede kanaler kunne også inkorporeres i den udglødelige trykstøtte ved at udskrive en offerblæk, såsom gelatine, der størkner inde i det kolde støttebad, men let kan evakueres ved 37 ° C 4,13. Kanaler ville være nødvendige for at levere næringsstoffer og ilt til vævskonstruktioner med høj celletæthed eller dimensioner, der overstiger mulighederne for en designbaseret iltspændingsmanipulationsmetode. Derudover kan vaskulære kanaler udnyttes til at skabe gradienter af små molekyler, der driver mønsteret af cellulær identitet, modulerer cellulær aktivitet eller styrer kemotaxis.
Sammenfattende tilbyder indlejret 3D-udskrivning inde i SHAPE-kompositten en modulær materialeplatform, der let kan tilpasses og har alsidigt potentiale til funktionel modellering af mekanisk følsomme væv. Protokollen, der præsenteres her, giver en detaljeret forklaring af de nødvendige trin og grundlæggende principper, der er nødvendige for at generere støttematerialet og udskrive det cellulære blæk med høj troskab. Tilgangen udnytter overkommelige materialer og tilgængeligt udstyr, samtidig med at der gives plads til personalisering af tilgangen til individuelle forskeres behov og applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forskningen blev primært finansieret af BrainMatTrain European Union Horizon 2020-programmet (nr. H2020-MSCA-ITN-2015) under Marie Skłodowska-Curie Initial Training Network og tilskudsaftale nr. 676408. C.R. og J.U.L. vil gerne takke Lundbeckfonden (R250-2017-1425) og Danmarks Frie Forskningsfond (8048-00050) for deres støtte. Vi takker for finansieringen af HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01-projektet 101047177 OpenMIND.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Gastight Syringe 1001 TLL | Hamilton | 81320 | |
| 3DDiscovery 3D bioprinter | RegenHU | ||
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| AlbuMAX | ThermoFisher | 11020021 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | Goat anti-Mouse |
| Blunt Needle, Sterican (21 G) | Braun | 9180109 | |
| Blunt Needle (27 G) | Cellink | NZ5270505001 | |
| BioCAD software | SolidWorks | ||
| Calcein AM | ThermoFisher | 65-0853-39 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C5929 | |
| Dibutyryl-cAMP sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL) | R&D Systems | 3440-100-01 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | ThermoFisher | 10565018 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190094 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF | R&D Systems | 3718-FB | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 100496 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1569601 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES Buffer (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | 5129 | |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| Magnetic stirrer RET basic | IKA | 3622000 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| S25N-10G dispersing tool | IKA | 4447100 | |
| Sodium Alginate (80-120 cP) | FUJIFILM Wako | 194-13321 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer | IKA | 3720000 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin/EDTA Solution | ThermoFisher | R001100 | |
| TUBB3 antibody | BioLegend | 801213 | Mouse |
| Xanthan gum | Sigma-Aldrich | G1253 |
References
- Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional printing of 3D microvascular networks. Advanced Materials. 23 (24), H178-H183 (2011).
- Bhattacharjee, T., et al.
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
- Skylar-Scott, M. A., et al. Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellular density and embedded vascular channels. Science Advances. 5 (9), (2019).
- Highley, C. B., Rodell, C. B., Burdick, J. A. Direct 3D printing of shear-thinning hydrogels into self-healing hydrogels. Advanced Materials. 27 (34), 5075-5079 (2015).
- Romanazzo, S., et al. Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).
- Noor, N., et al. 3D printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts. Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- LeBlanc, K. J., et al. Stability of high speed 3D printing in liquid-like solids. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1796-1799 (2016).
- Prendergast, M. E., Burdick, J. A. Computational modeling and experimental characterization of extrusion printing into suspension baths. Advanced Healthcare Materials. 11 (7), 2101679 (2022).
- Shapira, A., Noor, N., Oved, H., Dvir, T. Transparent support media for high resolution 3D printing of volumetric cell-containing ECM structures. Biomedical Materials. 15 (4), 45018 (2020).
- McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. 3D printing in suspension baths: Keeping the promises of bioprinting afloat. Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).
- Kajtez, J., et al. Embedded 3D printing in self-healing annealable composites for precise patterning of functionally mature human neural constructs. Advanced Science. 9 (25), 2201392 (2022).
- Rommel, D., Vedaraman, S., Mork, M., de Laporte, L. Interlinked macroporous 3D scaffolds from microgel rods. Journal of Visualized Experiments. (184), e64010 (2022).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Mirdamadi, E., Muselimyan, N., Koti, P., Asfour, H., Sarvazyan, N. Agarose slurry as a support medium for bioprinting and culturing freestanding cell-laden hydrogel constructs. 3D Printing and Additive Manufacturing. 6 (3), 158-164 (2019).
