Summary
mtDNAの合成と分布を検出および定量するためのマルチウェルプレートフォーマットおよび自動免疫蛍光イメージングを使用して、細胞内のミトコンドリアDNA(mtDNA)代謝のダイナミクスを研究する手順について説明します。これはさらに、mtDNA代謝に対するさまざまな阻害剤、細胞ストレス、および遺伝子サイレンシングの影響を調べるために使用できます。
Abstract
細胞プロセスの大部分はエネルギーの継続的な供給を必要とし、その最も一般的なキャリアはATP分子です。真核細胞は、酸化的リン酸化によってミトコンドリアでATPの大部分を産生します。ミトコンドリアは、複製されて次世代の細胞に受け継がれる独自のゲノムを持っているため、ユニークな細胞小器官です。核ゲノムとは対照的に、細胞内にはミトコンドリアゲノムの複数のコピーがあります。ミトコンドリアゲノムの複製、修復、および維持に関与するメカニズムの詳細な研究は、正常状態と疾患状態の両方でミトコンドリアおよび細胞全体の適切な機能を理解するために不可欠です。ここでは、 インビトロで 培養したヒト細胞におけるミトコンドリアDNA(mtDNA)の合成および分布のハイスループット定量を可能にする方法が提示される。このアプローチは、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)取り込みによって標識された活発に合成されたDNA分子の免疫蛍光検出と、抗DNA抗体によるすべてのmtDNA分子の同時検出に基づいています。さらに、ミトコンドリアは特定の色素または抗体で可視化されます。マルチウェル形式で細胞を培養し、自動蛍光顕微鏡を利用することで、mtDNAの動態やミトコンドリアの形態を様々な実験条件下で比較的短時間で研究することが容易になります。
Introduction
ほとんどの真核細胞にとって、ミトコンドリアは多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たすため、不可欠な細胞小器官です。何よりもまず、ミトコンドリアは細胞の主要なエネルギー供給者です1。ミトコンドリアは、細胞の恒常性(例えば、細胞内酸化還元2およびカルシウムバランス3)、細胞シグナル伝達4,5、アポトーシス6、異なる生化学的化合物の合成7,8、および自然免疫応答9の調節にも関与しています。ミトコンドリア機能障害は、様々な病的状態およびヒト疾患に関連している10。
ミトコンドリアの機能は、核ゲノムとミトコンドリアゲノムの2つの別々のゲノムにある遺伝情報に依存します。ミトコンドリアゲノムは核ゲノムに比べて少数の遺伝子をコードしていますが、mtDNAにコードされた遺伝子はすべて人間の生活に不可欠です。mtDNAを維持するために必要なミトコンドリアタンパク質機構は、nDNAによってコードされています。ミトコンドリアレプリソームの基本成分、およびいくつかのミトコンドリア生合成因子はすでに同定されています(以前の研究でレビュー11,12)。しかし、ミトコンドリアDNAの複製と維持のメカニズムはまだ理解されていません。nDNAとは対照的に、ミトコンドリアゲノムは複数のコピーで存在し、ミトコンドリア遺伝子発現を調節するための追加の層を提供します。オルガネラ内のmtDNAの分布と分離、これらのプロセスがどの程度調節されているか、もしそうなら、どのタンパク質が関与しているかについては、現在ほとんど知られていません13。分離パターンは、細胞に野生型と変異したmtDNAの混合集団が含まれている場合に重要です。それらの不均等な分布は、有害な量の変異mtDNAを有する細胞の生成をもたらし得る。
これまでのところ、mtDNAの維持に必要なタンパク質因子は、主に生化学的方法、バイオインフォマティクス分析、または疾患関連研究によって特定されてきました。この作業では、以前に識別を逃れた要因を特定する可能性が高いことを保証するために、別の戦略について説明します。この方法は、チミジンのヌクレオシド類似体である5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)による複製または修復中のmtDNAの標識に基づいています。BrdUは、DNA合成中に新生DNA鎖に容易に組み込まれ、一般に、核DNAの複製をモニタリングするために使用されます14。しかし、ここで開発された手順は、抗BrdU抗体の免疫蛍光を用いてmtDNAに取り込まれたBrdUを検出するために最適化されています。
このアプローチにより、 in vitroで培養したヒト細胞におけるmtDNA合成と分布のハイスループット定量が可能になります。比較的短時間でさまざまな実験条件下でテストを実施するには、ハイスループット戦略が必要です。したがって、プロトコールでは、細胞培養のためのマルチウェルフォーマットおよびイメージングのための自動蛍光顕微鏡法を利用することが提案されている。このプロトコルには、siRNAライブラリによるヒトHeLa細胞のトランスフェクションと、その後のBrdUによる新しく合成されたDNAの代謝標識を使用したmtDNA複製または修復のモニタリングが含まれます。このアプローチは、抗DNA抗体の助けを借りてDNAの免疫染色と組み合わされます。両方のパラメータは、定量的蛍光顕微鏡を用いて分析される。さらに、ミトコンドリアは特定の色素で視覚化されます。プロトコルの特異性を実証するために、mtDNAを含まない細胞(rho0細胞)、よく知られているmtDNA維持因子のサイレンシング時のHeLa細胞、およびmtDNA複製阻害剤で処理した後のHeLa細胞でBrdU染色をテストしました。mtDNAレベルも独立した方法、すなわちqPCRによって測定された。
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Protocol
1. siRNA混合物の調製
- 実験開始の1日前に、細胞(例えば、HeLa)を100mmディッシュ上に播種し、翌日に70%〜90%のコンフルエントに達するようにする。
注意: すべての操作は、層流チャンバー内の無菌条件下で実行する必要があります。 - Opti-MEM培地で140 nMの濃度に希釈したsiRNAを適量調製します( 材料表参照)。96ウェルプレートをリザーバーとして使用できます。
- 5 μLのsiRNA溶液(またはコントロールサンプルの場合はOpti-MEM培地)を黒色の384ウェル細胞培養マイクロプレートの各ウェルに追加します。
注:テストするsiRNAサンプルの数に応じて、電子ピペットまたはマルチチャンネルピペットを使用できます。 - 適量のRNAiMAXトランスフェクション試薬溶液( 材料表参照)をOpti-MEM培地で調製します。培地100 μLごとにRNAiMAXを1 μL添加します。
- 10 μLのトランスフェクション試薬溶液を384ウェルプレートの各ウェルに加えます。これを行う最も便利で最速の方法は、試薬ディスペンサーを使用することです。
- siRNAをトランスフェクション試薬とともに室温で30分間インキュベートします。
2. トランスフェクション用細胞の調製
- インキュベーション中(ステップ1.6)、吸引装置( 材料表を参照)を使用して培地を吸引し、細胞を3 mLのPBSで洗浄します。
- PBSで1:2に希釈したトリプシン1.5 mLを加え、細胞を37°Cで10分間インキュベートします。
- セルが剥離していないか確認してください。その場合は、10%FBSを含む3 mLのDMEM培地を追加します。細胞を完全に懸濁し、15 mLチューブに移します。少なくとも150 μLの懸濁液を取り、細胞計数チャンバー内の細胞をカウントします( 材料表を参照)。
- 10%FBS、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むDMEM培地に適切な濃度(HeLa株の場合は35,000 / mL)で細胞懸濁液を調製します。
3. 細胞トランスフェクション
- 試薬ディスペンサーを使用して、20 μLの細胞懸濁液を384ウェルプレートの各ウェルに加えます。これにより、ウェルあたり700個の細胞が播種されます。
- 細胞を室温で1時間インキュベートし、次いでインキュベーターに72時間(37°Cおよび5%CO2)置く。
4. BrdUの設立
- 10%FBSを含むDMEM培地中のBrdUの90 μM溶液( 材料表を参照)を調製します。
- siRNAトランスフェクションの56時間後(細胞固定の16時間前)に、10 μLの90 μM BrdU溶液を384ウェルプレートの各ウェルに加えます(最終的なBrdU濃度は20 μMです)。
注意: アクションはできるだけ早く実行する必要があります。したがって、試薬ディスペンサー、電子ピペット、またはマルチディスペンサーピペットを使用するのが最善です。BrdUを添加せずにコントロールウェルを準備することを忘れないでください。 - 細胞を16時間インキュベートします(37°Cおよび5%CO2)。
5.ミトコンドリアの標識
- 10%FBSを含むDMEM中のBrdUの20 μM溶液を調製し、それにミトコンドリア追跡色素溶液( 材料の表を参照)を1.1 μMの濃度で加えます。
- BrdU取り込み開始から15時間後(細胞固定の1時間前)に、10 μLのミトコンドリア追跡色素溶液( 材料表を参照)を384ウェルプレートの各ウェルに加えます(最終色素濃度は200 nMです)。
注意: 試薬ディスペンサー、電動ピペット、またはマルチディスペンサーピペットを使用してください。BrdUを添加せずに、ミトコンドリア追跡色素を添加してコントロールウェルを保持することを忘れないでください。 - 細胞を1時間インキュベートします(37°Cおよび5%CO2)。
6.細胞固定
注:すべての洗浄はマイクロプレートウォッシャーを使用して最も便利に実行されますが、試薬の添加は試薬ディスペンサーを使用して最も迅速に実行されます。
- マイクロプレートウォッシャー( 材料表を参照)を使用して、各ウェルを100 μLのPBSで2回すすぎます。2回目の洗浄後、25 μLのPBSをウェルに残します。
注:PBSをウェルに残しておくと、次のステップで液体を追加する際の細胞剥離の可能性が低くなります。すべての洗浄はPBSを残したまま完了します。したがって、次のステップで添加される溶液は、残りのPBSと等量で添加されるため、常に2倍の濃度で調製する必要があります。 - 0.4% Triton X-100およびHoechst 33342を含むPBS中の8%ホルムアルデヒド溶液25 μLを4 μg/mLの濃度で添加して細胞を固定します(個々の試薬の最終濃度はそれぞれ4%、0.2%、および2 μg/mLです)( 材料表を参照)。
- プレートを暗所で室温で30分間インキュベートします。
7. ブロッキング
- 各ウェルを100 μLのPBSで4回すすぎます。最後の洗浄後、25 μLのPBSをウェルに残します。
- PBS中の6%BSAを25 μL加えます(最終的なBSA濃度は3%)。
- プレートを暗所で室温で30分間インキュベートします。
8. 一次抗体の添加
- マイクロプレートウォッシャーを使用してBSAを吸引し、ウェルに10 μLの溶液を残します。
- PBS中の3%BSAで調製した一次抗体溶液10 μLを加えます。抗BrdUは0.8 μg/mL、抗DNAは0.4 μg/mL(抗体の最終濃度はそれぞれ0.4 μg/mLおよび0.2 μg/mL)を使用してください( 材料表参照)。
- プレートを暗所で4°Cで一晩インキュベートします。
9. 二次抗体の添加
- 各ウェルを100 μLのPBSで4回すすぎます。最後の洗浄後、ウェルに10 μLのPBSを残します。
- PBS中の6%BSAで調製した4 μg/mL二次抗体溶液10 μLを追加します(最終濃度は2 μg/mLです)。Alexa Fluor 488やAlexa Fluor 555などの蛍光色素に結合したアイソタイプ特異的抗体(抗マウスIgG1および抗マウスIgM)を使用します( 材料表を参照)。
- プレートを暗所で室温で1時間インキュベートします。
- 各ウェルを100 μLのPBSで4回すすぎます。最後の洗浄後、50 μLのPBSをウェルに残します。
- 粘着シーリングフィルム( 材料表を参照)でプレートをシールし、4°Cの暗所で保管します。 イメージングは2週間以内に行う必要があります。
10. イメージング
注意: イメージングは自動広視野顕微鏡で実行する必要があります。顕微鏡には、プレートの個々の領域を自動的に画像化するためのコントロールを備えたモーターステージを装備する必要があります。
- プレートのコーナー領域(ウェルA1、A24、P24、P1)と中央のオートフォーカス設定を確認します。
注意: イメージングには、可能な限り高い開口数を持つ20倍の短い作動距離対物レンズ( 材料表を参照)を使用することをお勧めします。 - ライブビューモードでイメージングソフトウェアによって生成された強度ヒストグラムに基づいて、結果の画像が過飽和にならないように、個々の蛍光チャネルに対して十分に長い露光時間を選択します。
- Z 軸でのイメージングに適した平面数を設定します。
注: 倍率 20 倍の視野は十分に大きいため、すべてのセルが同じ焦点面にあるわけではないため、すべてのセルを正しい焦点面で表示するには、Z セクションを実行する必要があります。通常、5つの飛行機で十分です。ディスク容量の可用性に応じて、個々の Z スタックまたは最大強度投影のみを保存できます。代表的な結果のセクションに示されている画像解析は、最大強度投影に基づいています。 - ウェルごとに表示する適切な数の視野を選択します。
注:合流点にもよりますが、1つの視野で約60〜300個の細胞を画像化できます。通常、コンフルエントが60%〜90%のHeLa細胞の場合、5つの視野をイメージングすることで、500細胞から1,000を超える細胞まで分析できます。 - イメージングするウェルを選択し、イメージングを開始します。
11. 定量画像解析
注:取得した画像の定量分析は、Cell Profiler15などのオープンソースソフトウェアを使用して実行できます。本研究では、ScanR 3.0.0ソフトウェアを使用して分析を実施しました( 材料表を参照)。
- すべての蛍光チャンネルからのすべての画像に対してバックグラウンド補正を実行して、分析を開始します。分析対象物のサイズに応じて、適切なフィルターサイズ(細胞核に80ピクセル、BrdUおよびmtDNAスポットに4ピクセル)を選択します。
- 細胞核に対応するチャネルのバックグラウンドに対する蛍光シグナルの強度の比に基づいてメインオブジェクトのマスクを作成することにより、画像のセグメント化を開始します。
- BrdUスポットとmtDNAスポットをそれぞれ表すサブオブジェクトのマスクを、所定の構造に適した蛍光チャネルを使用して作成します。
注: 各サブオブジェクトは、最も近いメイン オブジェクト(細胞核)に割り当てられます。 - 分析中に測定するパラメータを設定し、すべての蛍光チャンネルの各マスク内の個々のピクセルの強度を測定します。
注:特定の細胞核に割り当てられたサブオブジェクトの数と各サブオブジェクトの面積を計算する必要もあります。 - 取得したデータに基づいて計算する派生パラメータを定義します。BrdUまたはmtDNAチャネルの総蛍光強度を取得するには、特定の細胞核に割り当てられたすべてのサブオブジェクトの強度を合計します。平均蛍光強度を得るには、総蛍光強度を、所与の細胞核に割り当てられたサブオブジェクトの面積の合計で割る。
注:作成されたサブオブジェクト(BrdUまたはmtDNAスポット)が実際にミトコンドリアにあることを確認するには、ミトコンドリア追跡色素からの蛍光強度に基づいてそれらをゲートする必要があります。 - R 4.2.2統計ソフトウェア16と次のパッケージを使用して、ScanRソフトウェアで取得したデータのさらなる分析を実行します:dplyr 17、data.table 18、ggplot219、およびggpubr20。この手順は省略可能です。
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Representative Results
mtDNAの合成および分布のダイナミクスのハイスループット研究のための手順のスキームを 図1に示す。マルチウェルプレートフォーマットを使用することで、siRNAライブラリを使用した異なる遺伝子のサイレンシングなど、多くの異なる実験条件の同時解析が可能になります。BrdUで新たに合成されたDNA分子を標識するために使用される条件は、HeLa細胞のミトコンドリアにおけるBrdU標識DNAの検出を可能にします(図2A)が、他の細胞タイプのアッセイを設定するための開始条件としても使用できます。BrdUとのインキュベーション時間は、時間経過実験に基づいて個々の細胞株に対して選択する必要があります(補足図1)。本研究では、siRNAのスクリーニングには高効率でトランスフェクトできる細胞が必要であるため、HeLa細胞を使用しました。重要なことに、抗BrdU抗体で得られるシグナルは、BrdUで処理された細胞でのみ観察できるため、特異的です(図2)。抗BrdUおよび抗DNA標識の特異性は、ミトコンドリアDNA21 を欠くrho0細胞を用いてさらに確認された(補足図2)。予想通り、これらの細胞では、BrdU処理にかかわらず、抗BrdUまたは抗DNA抗体の両方についてミトコンドリアにおいてシグナルが検出されなかった(図2B)。抗BrdU抗体からの蛍光シグナルを定量すると、BrdUで処理されたrho0細胞はBrdU未処理細胞と同じ低レベルの蛍光を示したが、親株A549およびHeLaのシグナルは平均で50倍高かった(図2C)。
ここで紹介した手法の有用性をミトコンドリアDNAの合成・分布の研究に示そうとするため、HeLa細胞をmtDNA合成阻害剤である2′,3′-ジデオキシシチジン(ddC)で処理し22、mtDNA複製に必須とされる遺伝子の発現をsiRNAでサイレンシングする実験を行った(図3).細胞をddCで処理すると、BrdUの取り込みが完全に阻害されましたが、使用されたsiRNAはさまざまな効果がありました。トゥインクルヘリカーゼ(TWNK)23 のダウンレギュレーションは、BrdUの取り込みの最も強力な阻害につながりました。TFAMタンパク質24では弱い効果が観察されましたが、ミトコンドリアDNAポリメラーゼγ(POLG)25 のサイレンシングは、ネガティブコントロールsiRNAで処理した細胞と比較してBrdU取り込みの中程度の減少をもたらしました(図3A、B)。手順における抗DNA抗体の使用は、所与の実験条件下で細胞内のmtDNA分布のモニタリングを可能にする。TFAMのダウンレギュレーションは、mtDNA分布に劇的な変化をもたらしました。対照細胞と比較して検出されたmtDNAスポットは少なかったが、残ったものは非常に高い蛍光強度を有していた(図3A)。抗DNA抗体からの平均蛍光シグナルを定量化することは、試験した他の条件と比較してTFAMサイレンシング時に数倍の増加を示した(図3C)。
イメージング結果の特異性は、定量的リアルタイムPCR(qPCR)を用いてmtDNAおよび遺伝子発現レベルを測定することによって検証されました(図4)。この方法は、他の箇所26に詳細に記載されている。ddCによる治療は、mtDNAのレベルを非常に強く低下させました。TFAMおよびTWNKサイレンシングの場合、より弱い効果が観察されたが、POLG siRNAを有する細胞のトランスフェクションは、mtDNAコピー数に非常にわずかな影響を示した(図4A)。TFAMおよびTWNKの発現を定量すると、mRNAレベルでの発現が30%に低下したPOLGとは対照的に、それらの発現が対照レベルの~15%-20%に効率的に減少することが確認されました(図4B)。
図1:プロトコルステップの概略図。 顕微鏡画像のスケールバーは10μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:抗BrdU抗体によるmtDNAへのBrdUの取り込みの特異的検出。抗BrdU(緑)抗体および抗DNA(赤)抗体による免疫蛍光染色を行った(A)HeLaおよび(B)A549およびA549 rho0細胞のサンプル画像。細胞をBrdU溶液で処理するかまたは処理しなかった。核DNA(青)をヘキストで標識し、ミトコンドリア(シアン)をミトコンドリア追跡色素で可視化した。4つの蛍光チャンネルすべてのマージ画像が表示されます。スケールバーは10μmを表す。 (C)抗BrdU抗体からのシグナルを定量した結果。分析は、4つの独立した生物学的複製について実施されました。毎回、無作為に選択した100個の細胞を、各実験条件について分析した(N=400細胞)。平均して、細胞あたり18のBrdU病巣が検出されました。ボックスは四分位範囲(IQR)の第1四分位数と第3四分位数を表し、中央値は水平線で表され、ひげは最小値と最大値を定義し、外れ値は1.5 x IQRとして定義されます。クラスカル・ウォリス統計検定を実施した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:BrdU取り込みの効率の低下やヌクレオイドの分布への影響など、mtDNA合成の阻害の結果。 (A)mtDNA複製に関与するタンパク質を下方制御するddCまたはsiRNAで72時間処理したHeLa細胞の蛍光画像のサンプル。細胞を固定前に16時間BrdUで処理した。核DNA(青)をヘキストで染色し、抗BrdU(緑)抗体および抗DNA(赤)抗体を使用し、ミトコンドリアをミトコンドリア追跡色素で標識した。4つの蛍光チャンネルすべてのマージ画像が表示されます。スケールバーは10μmを表す。 (B,C)(B)抗BrdUおよび(C)抗DNA抗体からの蛍光シグナルの定量化。分析は、4つの独立した生物学的複製について実施されました。毎回、無作為に選択した650個の細胞を実験条件ごとに分析した(N=2,600細胞)。平均して、細胞あたり18のBrdU病巣と46のmtDNA病巣が検出されました。ボックスは四分位範囲(IQR)の第1四分位数と第3四分位数を表し、中央値は水平線で表され、ひげは最小値と最大値を定義し、外れ値は1.5 x IQRとして定義されます。クラスカル・ウォリス統計検定を実施した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:mtDNA合成阻害の効率と試験したsiRNAの有効性の検証。 HeLa細胞をddCまたは示されたsiRNAで72時間処理した後、DNAおよびRNA単離を行った。(A)qPCRを用いたmtDNAレベル解析の結果。(B)指示された条件下での遺伝子発現変化のqPCR解析。バーは、4つの独立した生物学的反復の平均値を表します。エラーバーはSEMを表します。分散分析統計検定が実施されました。Untr(未処理)サンプルとのペアワイズ比較のために t検定を実施しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:HeLa細胞のmtDNAへのBrdU取り込みのダイナミクス。 細胞を20 μM BrdUと共に一定時間インキュベートした経時実験の結果を示す。各時点の4つの独立した反復の平均が示されています。無作為に選択された900個の細胞を、各反復において分析した。バーは4回の反復の平均を表します。分散分析統計検定を実施した。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:A549 rho0セルの検証。 (A)mtDNAにコードされた ND1 および核DNAにコードされた B2M 遺伝子の増幅DNA断片からのqPCR産物の電気泳動分析。A549またはA549 rho0細胞からの総DNAを反応の鋳型として使用した。(B)qPCRを用いたmtDNAレベル解析の結果。バーは、4つの独立した生物学的反復の平均値を表します。エラーバーはSEMを表します。 t検定を実施した。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
歴史的に、BrdUの取り込みおよび抗体検出によるDNA標識は、核DNA複製および細胞周期研究において使用されてきた14,27,28。これまでのところ、BrdU標識DNAを検出するためのすべてのプロトコルには、エピトープの露出を可能にし、抗体の浸透を促進するためのDNA変性ステップ(酸性または熱)または酵素消化(DNaseまたはプロテイナーゼ)が含まれています。これらのプロトコルは、密集した核DNA用に開発されました。しかし、mtDNAの異なる構成により、変性ステップのない手順の開発が可能になりました。これにより、手順が簡素化され、高スループットアプリケーションにより適したものになりました。このアプローチは、変性ステップを省略すると、核の外側でのみBrdU標識DNAを検出できるため、優れた結果が得られました(図2および図3)。その結果、変性ステップが含まれる場合に常に存在し、BrdU標識mtDNA29からのシグナルをマスクすることによって深刻な問題を引き起こす可能性のある核DNAからの強いシグナルは、このプロトコルで回避できます。さらに、過酷な変性がないため、細胞構造のより良い保存が保証され、ヘキストやミトコンドリア追跡色素などの蛍光染色による染色の効率に影響を与えません(図2および図3)。
mtDNAへのBrdUの取り込みのダイナミクスは、細胞株に依存します。BrdUの取り込みに関するタイムコース実験を行うことは、新しい細胞株を使用するときはいつでも推奨されます。この研究では、HeLa細胞株の最適なBrdUインキュベーション時間として16時間が確立されました。しかしながら、異なる実験室30からのHeLa系統における生物学的変異のために、1つが扱うことを計画している特定のHeLa変異体についてBrdU時間経過実験を行うことが示唆される。
このプロトコルにおける抗BrdUと抗DNA標識の組み合わせにより、mtDNA合成のモニタリングと細胞内のmtDNA分布の同時研究が可能になります。これは、TFAMサイレンシング細胞で非常によく見られます(図3)。TFAMのレベルが低下すると、mtDNA合成が減少し(総抗BrdUシグナルが減少します)、ミトコンドリアヌクレオイドのクラスタリングが起こり、これは平均mtDNA蛍光シグナルの大幅な増加によって現れます(図3)。この場合、平均mtDNA蛍光強度の増加は、ミトコンドリアヌクレオイドの分布の変化によって引き起こされ、mtDNAレベルのアップレギュレーションを反映していないことに留意すべきである。実際、定量的PCR分析によって明らかにされるように、mtDNAレベルは低下しています(図4A)。POLG siRNAを導入した細胞について驚くべき結果が得られました(図3)。ミトコンドリアの複製DNAポリメラーゼであるsiRNA標的POLGを用いた細胞のトランスフェクションは、mtDNAへのBrdUの取り込みを大幅に減少させることが期待できます。しかし、この研究では、qPCRを使用してmtDNAレベルを測定することによってさらに確認されるように、BrdUの取り込みに対する効果はごくわずかでした(図3)。POLG発現の不十分なダウンレギュレーションは、適用されたsiRNAを細胞にトランスフェクションした場合のこの一見矛盾する結果を説明できます(図4B)。これは、機能研究にsiRNAを使用することの潜在的な欠点を浮き彫りにし、遺伝子サイレンシングの検証が必要であることを示唆しています。
全体として、培養細胞におけるmtDNA代謝の動態を研究するためのアッセイが開発されており、マルチウェルプレートフォーマットと免疫蛍光イメージングを使用してmtDNAの複製、修復、および分布を検出および定量化しています。この方法は、多くの異なる実験条件の同時研究を可能にする。mtDNA代謝に対するさまざまな阻害剤、細胞ストレス、および遺伝子サイレンシングの効果を調べるために使用できます。このアッセイは、さまざまな生理学的および病理学的状況におけるmtDNA代謝の研究に使用する可能性が高いが、このアッセイでは複製と修復結合mtDNA合成を区別できないことに注意する必要があります。これは、結果を解釈し、その後の機能実験を計画するときに考慮する必要があります。特に、このアッセイはさらなる開発の可能性を秘めています。例えば、複製不活性(または修復不活性)ミトコンドリアヌクレオイドは抗BrdU抗体では検出されない。したがって、抗DNA抗体の適用により、mtDNA状態レベル、複製サイレントヌクレオイドの数、および細胞内のヌクレオイドの分布の定量が可能になります。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、ポーランド国立科学センターの支援を受けました(助成金/受賞番号:2018/31/D/NZ2/03901)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
References
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
- Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284 (2019).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102 (2020).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
- Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579 (2020).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S.
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
- Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
- Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2021).
- Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021).
- Dowle, M., Srinivasan, A. data.table: Extension of `data.frame. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016).
- Kassambara, A. ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020).
- Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
- Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
- Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
- Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
- Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
- Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
- Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).
