Summary
mtDNA 합성 및 분포를 검출하고 정량화하기 위해 다중 웰 플레이트 형식 및 자동화된 면역형광 이미징을 사용하여 세포에서 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 대사의 역학을 연구하는 절차가 설명되어 있습니다. 이것은 mtDNA 대사에 대한 다양한 억제제, 세포 스트레스 및 유전자 침묵의 효과를 조사하는 데 추가로 사용될 수 있습니다.
Abstract
대부분의 세포 과정에는 지속적인 에너지 공급이 필요하며, 가장 일반적인 운반체는 ATP 분자입니다. 진핵 세포는 산화적 인산화에 의해 미토콘드리아에서 대부분의 ATP를 생산합니다. 미토콘드리아는 복제되어 차세대 세포로 전달되는 자체 게놈을 가지고 있기 때문에 독특한 세포 소기관입니다. 핵 게놈과 달리 세포에는 미토콘드리아 게놈의 여러 사본이 있습니다. 미토콘드리아 게놈의 복제, 복구 및 유지를 담당하는 메커니즘에 대한 자세한 연구는 정상 및 질병 조건 모두에서 미토콘드리아와 전체 세포의 적절한 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 여기서, 시험관 내에서 배양된 인간 세포에서 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 합성 및 분포를 고처리량 정량화할 수 있는 방법이 제시된다. 이 접근법은 5-브로모-2'-데옥시유리딘(BrdU) 혼입으로 표지된 능동적으로 합성된 DNA 분자의 면역형광 검출과 항-DNA 항체가 있는 모든 mtDNA 분자의 동시 검출을 기반으로 합니다. 또한 미토콘드리아는 특정 염료 또는 항체로 시각화됩니다. 다중 웰 형식의 세포 배양과 자동 형광 현미경의 활용을 통해 비교적 짧은 시간에 다양한 실험 조건에서 mtDNA의 역학과 미토콘드리아의 형태를 더 쉽게 연구할 수 있습니다.
Introduction
대부분의 진핵 세포에서 미토콘드리아는 수많은 세포 과정에서 중요한 역할을 하기 때문에 필수 세포 기관입니다. 무엇보다도, 미토콘드리아는 세포의 핵심 에너지 공급원이다1. 미토콘드리아는 또한 세포 항상성(예: 세포 내 산화환원2 및 칼슘 균형3), 세포 신호 전달4,5, 세포자멸사6, 다른 생화학적 화합물의 합성 7,8 및 선천성 면역 반응9 조절에 관여합니다. 미토콘드리아 기능 장애는 다양한 병리학 적 상태 및 인간 질병과 관련이 있습니다10.
미토콘드리아의 기능은 핵 게놈과 미토콘드리아 게놈이라는 두 개의 개별 게놈에 위치한 유전 정보에 달려 있습니다. 미토콘드리아 게놈은 핵 게놈에 비해 적은 수의 유전자를 암호화하지만 모든 mtDNA 암호화 유전자는 인간의 생명에 필수적입니다. mtDNA를 유지하는 데 필요한 미토콘드리아 단백질 기계는 nDNA에 의해 암호화됩니다. 미토콘드리아 반응체의 기본 구성 요소와 일부 미토콘드리아 생물 발생 인자는 이미 확인되었습니다(이전 연구11,12에서 검토됨). 그러나 미토콘드리아 DNA 복제 및 유지 메커니즘은 아직 이해되지 않았습니다. nDNA와 달리, 미토콘드리아 게놈은 다중 사본으로 존재하며, 이는 미토콘드리아 유전자 발현을 조절하기 위한 추가 층을 제공합니다. 세포 기관 내에서 mtDNA의 분포와 분리, 이러한 과정이 어느 정도 조절되는지, 그리고 그렇다면 어떤 단백질이 관련되어 있는지에 대해서는 현재 알려진 바가 훨씬 적습니다13. 분리 패턴은 세포가 야생형 및 돌연변이 mtDNA의 혼합 집단을 포함할 때 중요합니다. 이들의 불균등한 분포는 유해한 양의 돌연변이된 mtDNA를 가진 세포의 생성으로 이어질 수 있습니다.
지금까지 mtDNA 유지에 필요한 단백질 인자는 주로 생화학적 방법, 생물정보학적 분석 또는 질병 관련 연구를 통해 확인되었습니다. 이 작업에서는 이전에 식별을 벗어난 요인을 식별할 수 있는 높은 기회를 보장하기 위해 다른 전략이 설명됩니다. 이 방법은 티미딘의 뉴클레오시드 유사체인 5-브로모-2'-데옥시유리딘(BrdU)으로 복제 또는 복구하는 동안 mtDNA를 표지하는 것을 기반으로 합니다. BrdU는 DNA 합성 중에 초기 DNA 가닥에 쉽게 통합되며, 일반적으로 핵 DNA14의 복제를 모니터링하는 데 사용됩니다. 그러나 여기에서 개발된 절차는 항-BrdU 항체의 면역형광을 사용하여 mtDNA에 혼입된 BrdU를 검출하는 데 최적화되었습니다.
이 접근법은 시험관 내에서 배양된 인간 세포에서 mtDNA 합성 및 분포의 고처리량 정량화를 가능하게 합니다. 비교적 짧은 시간에 다양한 실험 조건에서 테스트를 수행하려면 고처리량 전략이 필요합니다. 따라서, 세포 배양을 위한 멀티웰 포맷 및 이미징을 위한 자동화된 형광 현미경을 활용하는 것이 프로토콜에서 제안된다. 이 프로토콜에는 siRNA 라이브러리를 사용한 인간 HeLa 세포의 형질감염과 BrdU로 새로 합성된 DNA의 대사 표지를 사용한 mtDNA 복제 또는 복구의 후속 모니터링이 포함됩니다. 이 접근법은 항 DNA 항체의 도움으로 DNA의 면역 염색과 결합됩니다. 두 매개변수 모두 정량적 형광 현미경을 사용하여 분석됩니다. 또한 미토콘드리아는 특정 염료로 시각화됩니다. 프로토콜의 특이성을 입증하기 위해 BrdU 염색을 mtDNA가 없는 세포(rho0 세포), 잘 알려진 mtDNA 유지 인자의 침묵 시 HeLa 세포 및 mtDNA 복제 억제제로 처리한 후 HeLa 세포에서 테스트했습니다. mtDNA 수준은 또한 독립적인 방법, 즉 qPCR에 의해 측정되었다.
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Protocol
1. siRNA 혼합물의 제조
- 실험 시작 하루 전, 종자 세포(예: HeLa)를 100mm 접시에 올려 다음날 70%-90% 합류에 도달하도록 합니다.
알림: 모든 작업은 층류 챔버의 무균 조건에서 수행해야 합니다. - Opti-MEM 배지에서 140 nM의 농도로 희석된 siRNA를 적당량 준비한다( 재료 표 참조). 96웰 플레이트를 저장소로 사용할 수 있습니다.
- 5μL의 siRNA 용액(또는 대조군 샘플용 Opti-MEM 배지)을 검은색 384웰 세포 배양 마이크로플레이트의 각 웰에 추가합니다.
참고: 테스트한 siRNA 샘플의 수에 따라 전자 또는 다중 채널 피펫을 사용할 수 있습니다. - Opti-MEM 배지에서 적절한 양의 RNAiMAX 형질주입 시약 용액( 재료 표 참조)을 준비합니다. 배지 100μL당 RNAiMAX 1μL을 추가합니다.
- 형질주입 시약 용액 10μL를 384웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 이를 수행하는 가장 편리하고 빠른 방법은 시약 디스펜서를 사용하는 것입니다.
- siRNA를 실온에서 30분 동안 형질주입 시약과 함께 인큐베이션합니다.
2. 형질주입을 위한 세포의 제조
- 인큐베이션 (단계 1.6) 동안, 흡입 장치 ( 재료 표 참조)를 사용하여 배지를 흡인하고, 세포를 3 mL의 PBS로 세척한다.
- PBS에 1:2로 희석된 트립신 1.5mL를 넣고 37°C에서 10분 동안 세포를 배양합니다.
- 셀이 분리되었는지 확인하십시오. 그렇다면 10% FBS가 있는 DMEM 배지 3mL를 추가합니다. 세포를 완전히 현탁하고 15mL 튜브로 옮깁니다. 현탁액의 최소 150 μL를 취하고, 세포 계수 챔버에서 세포를 계수한다 ( 물질의 표 참조).
- 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에서 적절한 농도(HeLa 라인의 경우 35,000/mL)로 세포 현탁액을 준비합니다.
3. 세포 형질감염
- 시약 디스펜서를 사용하여 384-웰 플레이트의 각 웰에 20 μL의 세포 현탁액을 추가합니다. 이렇게 하면 웰당 700개의 세포가 시딩됩니다.
- 세포를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 72시간 동안 인큐베이터에 넣는다(37°C 및 5%CO2).
4. BrdU 법인 설립
- 10% FBS가 있는 DMEM 배지에서 BrdU의 90μM 용액( 재료 표 참조)을 준비합니다.
- siRNA 형질감염 후 56시간(세포 고정 전 16시간)에 90μM BrdU 용액 10μL를 384웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다(최종 BrdU 농도는 20μM).
알림: 작업은 가능한 한 빨리 수행해야 합니다. 따라서 시약 디스펜서, 전자 피펫 또는 멀티 디스펜서 피펫을 사용하는 것이 가장 좋습니다. BrdU를 추가하지 않고 제어 우물을 준비하는 것을 잊지 마십시오. - 세포를 16시간 동안 인큐베이션한다(37°C 및 5%CO2).
5. 미토콘드리아의 표지
- 10% FBS를 갖는 DMEM 중의 BrdU의 20 μM 용액을 준비하고, 여기에 미토콘드리아 추적 염료 용액( 재료 표 참조)을 1.1 μM의 농도로 첨가한다.
- BrdU 혼입 시작 후 15시간(세포 고정 1시간 전)에 10μL의 미토콘드리아 추적 염료 용액( 재료 표 참조)을 384웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다(최종 염료 농도는 200nM).
알림: 시약 디스펜서, 전자 피펫 또는 멀티 디스펜서 피펫을 사용하십시오. BrdU를 추가하지 않고 미토콘드리아 추적 염료를 추가하여 제어 웰을 유지하는 것을 잊지 마십시오. - 세포를 1시간 동안 인큐베이션한다(37°C 및 5%CO2).
6. 세포 고정
참고: 모든 세척은 마이크로플레이트 세척기를 사용하여 가장 편리하게 수행되는 반면, 시약 추가는 시약 디스펜서를 사용하여 가장 빠르게 수행됩니다.
- 마이크로플레이트 세척기( 재료 표 참조)를 사용하여 100μL의 PBS로 각 웰을 두 번 헹굽니다. 두 번째 세척 후 25 μL의 PBS를 웰에 남겨 둡니다.
알림: PBS를 웰에 그대로 두면 다음 단계에서 액체를 추가하는 동안 세포가 분리될 가능성이 줄어듭니다. 모든 세척은 PBS가 남아 있는 상태에서 완료됩니다. 따라서 다음 단계에서 첨가된 용액은 나머지 PBS에 동일한 부피로 첨가될 것이므로 항상 2x 농도로 준비해야 합니다. - 4μg/mL의 농도로 0.4% Triton X-100 및 Hoechst 33342가 포함된 PBS에 8% 포름알데히드 용액 25μL를 추가하여 세포를 고정합니다(개별 시약의 최종 농도는 각각 4%, 0.2% 및 2μg/mL임)( 재료 표 참조).
- 플레이트를 실온의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.
7. 차단
- PBS 100μL로 각 웰을 4회 헹굽니다. 마지막 세척 후 25μL의 PBS를 웰에 남겨둡니다.
- PBS에 6% BSA 25μL(최종 BSA 농도는 3%)를 각 웰에 추가합니다.
- 플레이트를 실온의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.
8. 1차 항체의 첨가
- 마이크로플레이트 세척기를 사용하여 BSA를 흡인하고 10μL의 용액을 웰에 남겨둡니다.
- PBS에 3% BSA에서 제조된 1차 항체 용액 10 μL를 첨가한다. 0.8μg/mL의 항-BrdU 및 0.4μg/mL의 항-DNA를 사용하십시오(항체의 최종 농도는 각각 0.4μg/mL 및 0.2μg/mL임)( 재료 표 참조).
- 플레이트를 4°C의 암실에서 밤새 인큐베이션한다.
9. 2차 항체의 첨가
- PBS 100μL로 각 웰을 4회 헹굽니다. 마지막 세척 후 10 μL의 PBS를 웰에 남겨 둡니다.
- PBS에 4% BSA에서 제조된 4μg/mL 보조 항체 용액 6μL을 추가합니다(최종 농도는 2μg/mL). Alexa Fluor 488 및 Alexa Fluor 555와 같은 형광색소에 접합된 동형 특이적 항체(anti-mouse IgG1 및 anti-mouse IgM)를 사용합니다( 표 참조).
- 플레이트를 실온에서 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다.
- PBS 100μL로 각 웰을 4회 헹굽니다. 마지막 세척 후 50 μL의 PBS를 웰에 남겨 둡니다.
- 접착 밀봉 필름( 재료 표 참조)으로 플레이트를 밀봉하고 4°C의 어두운 곳에 보관합니다. 이미징은 2주 이내에 수행해야 합니다.
10. 이미징
참고: 이미징은 자동화된 광시야 현미경으로 수행해야 합니다. 현미경에는 플레이트의 개별 영역을 자동으로 이미지화할 수 있는 제어 장치와 함께 제공되는 모터 스테이지가 장착되어 있어야 합니다.
- 플레이트의 모서리 영역(웰 A1, A24, P24, P1)과 중앙에서 자동 초점 설정을 확인하십시오.
알림: 이미징의 경우 가능한 가장 높은 개구수를 가진 20배 짧은 작동 거리 대물렌즈( 재료 표 참조)를 사용하는 것이 좋습니다. - 라이브 뷰 모드에서 이미징 소프트웨어에 의해 생성된 강도 히스토그램을 기반으로 결과 이미지가 과포화되지 않도록 개별 형광 채널에 대해 충분히 긴 노출 시간을 선택합니다.
- z축에서 이미징을 위한 적절한 평면 수를 설정합니다.
참고: 20x 배율에서의 시야는 모든 셀이 동일한 초점면에 있지 않을 만큼 충분히 크므로 올바른 초점면에 있는 모든 셀을 보려면 z-절편을 수행해야 합니다. 일반적으로 5 대의 비행기로 충분합니다. 디스크 공간의 가용성에 따라 개별 z-스택 또는 최대 강도 프로젝션만 저장할 수 있습니다. 대표 결과 섹션에 표시된 이미지 분석은 최대 강도 투영을 기반으로 합니다. - 웰별로 표시할 적절한 수의 보기 필드를 선택합니다.
참고: 합류점에 따라 약 60-300개의 셀을 하나의 시야에서 이미지화할 수 있습니다. 일반적으로 합류도가 60%-90%인 HeLa 세포의 경우 5개의 시야를 이미징하면 500개 세포에서 1,000개 이상의 세포까지 분석할 수 있습니다. - 이미징할 웰을 선택하고 이미징을 시작합니다.
11. 정량적 이미지 분석
참고: 획득한 이미지의 정량 분석은 Cell Profiler15와 같은 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다. 본 연구를 위해, 분석은 ScanR 3.0.0 소프트웨어를 사용하여 수행되었다( 재료 표 참조).
- 모든 형광 채널의 모든 이미지에 대해 배경 보정을 수행하여 분석을 시작합니다. 분석 된 물체의 크기에 따라 적절한 필터 크기를 선택하십시오 : 세포핵의 경우 80 픽셀, BrdU 및 mtDNA 스폿의 경우 4 픽셀.
- 세포핵에 해당하는 채널에 대한 배경에 대한 형광 신호의 강도 비율을 기준으로 주 물체의 마스크를 만들어 이미지 분할을 시작합니다.
- 주어진 구조에 적합한 형광 채널을 사용하여 각각 BrdU 및 mtDNA 스폿을 나타내는 하위 물체에 대한 마스크를 만듭니다.
참고: 각 하위 개체는 가장 가까운 주 개체(세포핵)에 할당됩니다. - 분석 중에 측정할 파라미터를 설정하고 모든 형광 채널에 대해 각 마스크 내의 개별 픽셀의 강도를 측정합니다.
참고: 또한 주어진 세포핵에 할당된 하위 물체의 수와 각 하위 물체의 면적을 계산해야 합니다. - 얻은 데이터를 기반으로 계산할 파생 매개 변수를 정의합니다. BrdU 또는 mtDNA 채널에 대한 총 형광 강도를 얻으려면 주어진 세포핵에 할당된 모든 하위 개체의 강도를 합산합니다. 평균 형광 강도를 구하기 위해, 총 형광 강도를 주어진 세포핵에 할당된 하위 물체의 면적의 합으로 나눕니다.
참고: 생성된 하위 개체(BrdU 또는 mtDNA 스팟)가 실제로 미토콘드리아에 위치하도록 하려면 미토콘드리아 추적 염료의 형광 강도를 기반으로 게이트를 지정해야 합니다. - dplyr 17, data.table 18, ggplot219 및 ggpubr20 패키지와 함께 R 4.2.2 통계 소프트웨어 16을 사용하여 ScanR 소프트웨어로 얻은 데이터에 대한 추가 분석을 수행합니다. 이 단계는 선택 사항입니다.
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Representative Results
mtDNA 합성 및 분포의 역학에 대한 고처리량 연구를 위한 절차 계획이 그림 1에 나와 있습니다. 멀티웰 플레이트 형식을 사용하면 siRNA 라이브러리를 사용하여 서로 다른 유전자의 침묵과 같은 다양한 실험 조건을 동시에 분석할 수 있습니다. BrdU로 새로 합성된 DNA 분자의 표지에 사용되는 조건은 HeLa 세포의 미토콘드리아에서 BrdU 표지 DNA의 검출을 허용하지만(그림 2A) 다른 세포 유형에 대한 분석을 설정하기 위한 시작 조건으로도 사용할 수 있습니다. BrdU를 사용한 배양 시간은 시간 경과 실험을 기반으로 개별 세포주에 대해 선택해야 합니다(보충 그림 1). 본 연구에서는 siRNAs의 스크리닝을 위해 고효율로 형질감염될 수 있는 세포가 필요하기 때문에 HeLa 세포를 사용하였다. 중요한 것은 항-BrdU 항체로 얻은 신호가 BrdU로 처리된 세포에서만 관찰될 수 있기 때문에 특이적이라는 것입니다(그림 2). 항-BrdU 및 항-DNA 표지의 특이성은 미토콘드리아 DNA21 이 결여된 rho0 세포를 사용하여 추가로 확인되었습니다(보충 그림 2). 예상한 바와 같이, 이들 세포에서, BrdU 처리에 관계없이, 미토콘드리아에서 항-BrdU 또는 항-DNA 항체 둘 다에 대한 신호가 검출되지 않았다(도 2B). 항-BrdU 항체의 형광 신호를 정량화한 결과, BrdU로 처리된 rho0 세포는 BrdU-처리되지 않은 세포와 동일한 낮은 수준의 형광을 보인 반면, 모 라인 A549 및 HeLa에 대한 신호는 평균적으로 50배 더 높았습니다(그림 2C).
미토콘드리아 DNA 합성 및 분포 연구에서 여기에 제시된 방법의 유용성을 보여주기 위해 HeLa 세포를 mtDNA 합성 억제제인 2′,3′-디데옥시시티딘(ddC)으로 처리한 실험을 수행하였다22, mtDNA 복제에 필수적인 것으로 알려진 유전자의 발현을 siRNA로 침묵시켰다(도 3). ddC로 세포를 처리하면 BrdU 결합이 완전히 억제되는 반면, 사용된 siRNA는 다양한 효과를 나타냈습니다. 트윙클 헬리카제(TWNK)23 의 하향 조절은 BrdU 통합의 가장 강력한 억제로 이어졌습니다. TFAM 단백질24에 대해 더 약한 효과가 관찰된 반면, 미토콘드리아 DNA 중합효소 감마(POLG)25 의 침묵은 음성 대조군 siRNA로 처리된 세포에 비해 BrdU 결합의 중간 정도의 감소를 가져왔습니다(그림 3A, B). 상기 절차에서 항-DNA 항체를 사용하면 주어진 실험 조건 하에서 세포 내 mtDNA 분포를 모니터링할 수 있습니다. TFAM의 하향 조절은 mtDNA 분포의 급격한 변화를 가져왔습니다. 대조군 세포에 비해 mtDNA 스팟이 더 적게 검출되었지만, 남아 있는 스팟은 매우 높은 형광 강도를 가졌다(그림 3A). 항-DNA 항체로부터의 평균 형광 신호를 정량화하는 것은 시험된 다른 조건들에 비해 TFAM 침묵 시 몇 배의 증가를 보여주었다(도 3C).
정량적 실시간 PCR(qPCR)의 도움으로 mtDNA 및 유전자 발현 수준을 측정하여 이미징 결과의 특이성을 검증했습니다(그림 4). 이 방법은 다른 곳(26)에서 상세히 설명되었다. ddC로 치료하면 mtDNA 수준이 매우 크게 감소했습니다. TFAM 및 TWNK 침묵의 경우 약한 효과가 관찰된 반면, POLG siRNA를 사용한 세포의 형질감염은 mtDNA 복제 수에 매우 미미한 영향을 미쳤습니다(그림 4A). TFAM 및 TWNK 발현을 정량화하면 mRNA 수준에서 발현이 30%로 감소한 POLG와 대조적으로 대조군 수준의 ~15%-20%까지 발현이 효율적으로 감소하는 것이 확인되었습니다(그림 4B).
그림 1: 프로토콜 단계의 개략도. 현미경 이미지의 스케일 바는 10μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 항-BrdU 항체에 의한 mtDNA로의 BrdU 혼입의 특이적 검출. 항-BrdU(녹색) 및 항-DNA(빨간색) 항체로 면역형광 염색을 실시한 (A) HeLa 및 (B) A549 및 A549 rho0 세포의 샘플 이미지. 세포를 BrdU 용액으로 처리하거나 처리하지 않았다. 핵 DNA(파란색)는 Hoechst로 표지되었고 미토콘드리아(청록색)는 미토콘드리아 추적 염료로 시각화되었습니다. 4개의 형광 채널 모두의 병합된 이미지가 표시됩니다. 눈금 막대는 10μm를 나타냅니다. (C) 항-BrdU 항체로부터의 신호의 정량화 결과. 분석은 4개의 독립적인 생물학적 복제물에 대해 수행되었습니다. 매번, 각 실험 조건(N=400 세포)에 대해 무작위로 선택된 100개의 세포를 분석하였다. 평균적으로 세포 당 18 개의 BrdU 병소가 검출되었습니다. 상자는 사분위수 범위(IQR)의 첫 번째 및 세 번째 사분위수를 나타내고, 중앙값은 수평선으로 표시되며, 수염은 최소값과 최대값을 정의하고, 이상치는 1.5 x IQR로 정의됩니다. Kruskal-Wallis 통계 테스트가 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: BrdU 통합의 효율성 감소 및 뉴클레오이드 분포에 영향을 미치는 것을 포함하여 mtDNA 합성 억제의 결과. (A) mtDNA 복제에 관여하는 단백질을 하향 조절하는 ddC 또는 siRNA로 72시간 동안 처리된 HeLa 세포의 샘플 형광 이미지. 세포를 고정 전에 16시간 동안 BrdU로 처리하였다. 핵 DNA(파란색)는 Hoechst로 염색하고, 항-BrdU(녹색) 및 항-DNA(빨간색) 항체를 사용했으며, 미토콘드리아는 미토콘드리아 추적 염료로 표지했습니다. 4개의 형광 채널 모두의 병합된 이미지가 표시됩니다. 눈금 막대는 10μm를 나타냅니다. (B,C) (B) 항-BrdU 및 (C) 항-DNA 항체의 형광 신호 정량화. 분석은 4개의 독립적인 생물학적 복제물에 대해 수행되었습니다. 매번, 각 실험 조건(N=2,600 세포)에 대해 무작위로 선택된 650개의 세포를 분석하였다. 평균적으로, 세포당 18개의 BrdU 병소 및 46개의 mtDNA 병소가 검출되었다. 상자는 사분위수 범위(IQR)의 첫 번째 및 세 번째 사분위수를 나타내고, 중앙값은 수평선으로 표시되며, 수염은 최소값과 최대값을 정의하고, 이상치는 1.5 x IQR로 정의됩니다. Kruskal-Wallis 통계 테스트가 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: mtDNA 합성 억제 효율 및 테스트된 siRNA의 효과 검증. HeLa 세포를 ddC 또는 표시된 siRNA로 72시간 동안 처리한 다음 DNA 및 RNA 분리를 수행했습니다. (a) qPCR을 이용한 mtDNA 수준 분석의 결과. (b) 지시된 조건하에서 유전자 발현 변화의 qPCR 분석. 막대는 4개의 독립적인 생물학적 복제물의 평균값을 나타냅니다. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. ANOVA 통계 테스트가 수행되었습니다. Untr(처리되지 않은) 샘플에 대한 쌍별 비교를 위해 t-test를 수행했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: HeLa 세포의 mtDNA로의 BrdU 혼입의 역학. 세포를 주어진 시간 동안 20 μM BrdU와 함께 배양한 시간 경과 실험의 결과가 표시됩니다. 각 시점에 대한 4개의 독립적인 반복실험의 평균이 표시됩니다. 무작위로 선택된 900개의 세포가 각 반복에서 분석되었습니다. 막대는 4번의 반복실험의 평균을 나타냅니다. ANOVA 통계 테스트가 수행되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: A549 rho0 세포의 검증. (A) mtDNA-코딩된 ND1 및 핵-DNA-코딩된 B2M 유전자의 DNA 단편을 증폭하는 것으로부터 qPCR 산물의 전기영동 분석. A549 또는 A549 rho0 세포로부터의 총 DNA를 반응의 주형으로서 사용하였다. (B) qPCR을 이용한 mtDNA 수준 분석의 결과. 막대는 4개의 독립적인 생물학적 복제물의 평균값을 나타냅니다. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. T-검정을 수행하였다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
역사적으로, BrdU 혼입 및 항체 검출에 의한 DNA 표지는 핵 DNA 복제 및 세포주기 연구에 사용되어왔다 14,27,28. 지금까지 BrdU 표지 DNA를 검출하기 위한 모든 프로토콜에는 에피토프 노출을 가능하게 하고 항체 침투를 촉진하기 위한 DNA 변성 단계(산성 또는 열) 또는 효소 분해(DNase 또는 proteinase)가 포함되었습니다. 이 프로토콜은 단단히 채워진 핵 DNA를 위해 개발되었습니다. 그러나 mtDNA의 다른 조직은 변성 단계 없이 절차의 개발을 가능하게 했습니다. 이로 인해 절차가 간소화되고 처리량이 많은 응용 분야에 더 적합해졌습니다. 이 접근법은 변성 단계를 생략하면 핵 외부에서만 BrdU 표지 DNA가 검출되기 때문에 우수한 결과를 가져왔습니다(그림 2 및 그림 3). 결과적으로, 변성 단계가 포함될 때 항상 존재하고 BrdU-표지된 mtDNA29의 신호를 마스킹하여 심각한 문제를 일으킬 수 있는 핵 DNA의 강한 신호는 이 프로토콜을 통해 피할 수 있습니다. 또한, 가혹한 변성이 없기 때문에 세포 구조가 더 잘 보존되고 Hoechst 또는 미토콘드리아 추적 염료와 같은 형광 염색에 의한 염색 효율에 영향을 미치지 않습니다(그림 2 및 그림 3).
mtDNA로의 BrdU 통합의 역학은 세포주에 따라 다릅니다. 새로운 세포주를 사용할 때마다 BrdU 통합에 대한 시간 경과 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 이 연구는 HeLa 세포주에 대한 최적의 BrdU 배양 시간으로 16시간을 설정했습니다. 그러나, 상이한 실험실(30)로부터의 헬라 라인의 생물학적 변이로 인해, 작업하고자 하는 특정 헬라 변이체에 대해 BrdU 시간 경과 실험을 수행하는 것이 제안된다.
이 프로토콜에서 항-BrdU 및 항-DNA 라벨링의 조합은 mtDNA 합성의 모니터링과 세포 내 mtDNA 분포의 동시 연구를 가능하게 합니다. 이것은 TFAM 침묵 셀에서 매우 잘 볼 수 있습니다(그림 3). TFAM의 수준을 감소시키면 mtDNA 합성이 감소하고(총 항-BrdU 신호 감소) 미토콘드리아 뉴클레오이드의 클러스터링이 발생하며, 이는 평균 mtDNA 형광 신호의 상당한 증가로 나타납니다(그림 3). 이 경우 평균 mtDNA 형광 강도의 증가는 미토콘드리아 뉴클레오이드의 분포 변화에 의해 발생하며 mtDNA 수준의 상향 조절을 반영하지 않는다는 점에 유의해야 합니다. 사실, 정량적 PCR 분석에 의해 밝혀진 바와 같이 mtDNA 수준이 감소합니다(그림 4A). POLG siRNA로 형질감염된 세포에 대해 놀라운 결과가 얻어졌습니다(그림 3). 미토콘드리아의 복제 DNA 중합효소인 siRNA 표적 POLG로 세포를 형질감염시키면 mtDNA로의 BrdU 결합이 크게 감소할 것으로 예상할 수 있습니다. 그러나, 이 연구에서, BrdU 혼입에 대한 영향은 무시할 수 있는 수준이었고(도 3), qPCR을 사용하여 mtDNA 수준을 측정함으로써 추가로 확인되었다(도 4A). POLG 발현의 열악한 하향 조절은 적용된 siRNA로 세포를 형질감염할 때 이 겉보기에 모순되는 결과를 설명할 수 있습니다(그림 4B). 이는 기능 연구에 siRNA를 사용할 때의 잠재적인 단점을 강조하고 유전자 침묵 검증이 필요함을 시사합니다.
전반적으로, 배양된 세포에서 mtDNA 대사의 역학을 연구하기 위한 분석법이 다중 웰 플레이트 형식과 면역형광 이미징을 사용하여 mtDNA 복제, 복구 및 분포를 검출하고 정량화하는 분석법이 개발되었습니다. 이 방법을 사용하면 다양한 실험 조건을 동시에 연구 할 수 있습니다. 다양한 억제제, 세포 스트레스 및 유전자 침묵이 mtDNA 대사에 미치는 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석은 다양한 생리학적 및 병리학적 맥락에서 mtDNA 대사를 연구하는 데 사용할 가능성이 높지만, 이 분석은 복제 및 복구 연결된 mtDNA 합성을 구별할 수 없다는 점에 유의해야 합니다. 이는 결과를 해석하고 후속 기능 실험을 계획할 때 고려해야 합니다. 특히, 이 분석은 추가 개발 가능성이 있습니다. 예를 들어, 복제 비활성(또는 복구 비활성) 미토콘드리아 뉴클레오이드는 항-BrdU 항체로 검출되지 않습니다. 따라서 항-DNA 항체의 적용은 mtDNA 상태 수준, 복제 침묵 뉴클레오이드의 수 및 세포 내 뉴클레오이드 분포의 정량화를 가능하게 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 폴란드 국립 과학 센터(보조금/수상 번호: 2018/31/D/NZ2/03901)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
References
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