Summary
Se describe un procedimiento para estudiar la dinámica del metabolismo del ADN mitocondrial (ADNmt) en las células utilizando un formato de placa de múltiples pocillos e imágenes de inmunofluorescencia automatizadas para detectar y cuantificar la síntesis y distribución del ADNmt. Esto se puede utilizar aún más para investigar los efectos de varios inhibidores, tensiones celulares y silenciamiento génico en el metabolismo del ADNmt.
Abstract
La gran mayoría de los procesos celulares requieren un suministro continuo de energía, cuyo portador más común es la molécula de ATP. Las células eucariotas producen la mayor parte de su ATP en las mitocondrias por fosforilación oxidativa. Las mitocondrias son orgánulos únicos porque tienen su propio genoma que se replica y se transmite a la siguiente generación de células. En contraste con el genoma nuclear, hay múltiples copias del genoma mitocondrial en la célula. El estudio detallado de los mecanismos responsables de la replicación, reparación y mantenimiento del genoma mitocondrial es esencial para comprender el buen funcionamiento de las mitocondrias y las células enteras tanto en condiciones normales como de enfermedad. Aquí se presenta un método que permite la cuantificación de alto rendimiento de la síntesis y distribución de ADN mitocondrial (ADNmt) en células humanas cultivadas in vitro . Este enfoque se basa en la detección por inmunofluorescencia de moléculas de ADN sintetizadas activamente marcadas por la incorporación de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) y la detección concurrente de todas las moléculas de ADNmt con anticuerpos antiADN. Además, las mitocondrias se visualizan con colorantes o anticuerpos específicos. El cultivo de células en un formato de múltiples pocillos y la utilización de un microscopio de fluorescencia automatizado facilitan el estudio de la dinámica del ADNmt y la morfología de las mitocondrias en una variedad de condiciones experimentales en un tiempo relativamente corto.
Introduction
Para la mayoría de las células eucariotas, las mitocondrias son orgánulos esenciales, ya que desempeñan un papel crucial en numerosos procesos celulares. En primer lugar, las mitocondrias son los principales proveedores de energía de las células1. Las mitocondrias también están involucradas en la regulación de la homeostasis celular (por ejemplo, redox2 intracelular y el balance de calcio3), la señalización celular 4,5, la apoptosis6, la síntesis de diferentes compuestos bioquímicos 7,8 y la respuesta inmune innata9. La disfunción mitocondrial está asociada a diversos estados patológicos y enfermedades humanas10.
El funcionamiento de las mitocondrias depende de la información genética localizada en dos genomas separados: el nuclear y el mitocondrial. El genoma mitocondrial codifica un pequeño número de genes en comparación con el genoma nuclear, pero todos los genes codificados por ADNmt son esenciales para la vida humana. La maquinaria de proteínas mitocondriales necesaria para mantener el ADNmt está codificada por el ADNn. Los componentes básicos del replisoma mitocondrial, así como algunos factores de biogénesis mitocondrial, ya han sido identificados (revisado en investigaciones anteriores11,12). Sin embargo, la replicación del ADN mitocondrial y los mecanismos de mantenimiento aún están lejos de ser entendidos. En contraste con el ADNn, el genoma mitocondrial existe en múltiples copias, lo que proporciona una capa adicional para regular la expresión génica mitocondrial. Actualmente se sabe mucho menos sobre la distribución y segregación del ADNmt dentro de los orgánulos, en qué medida estos procesos están regulados y, si lo están, qué proteínas están involucradas13. El patrón de segregación es crucial cuando las células contienen una población mixta de ADNmt mutado y de tipo salvaje. Su distribución desigual puede conducir a la generación de células con una cantidad perjudicial de ADNmt mutado.
Hasta ahora, los factores proteicos necesarios para el mantenimiento del ADNmt se han identificado principalmente mediante métodos bioquímicos, análisis bioinformáticos o mediante estudios asociados a enfermedades. En este trabajo, con el fin de garantizar una alta probabilidad de identificar factores que previamente han escapado a la identificación, se describe una estrategia diferente. El método se basa en el etiquetado del ADNmt durante la replicación o reparación con 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU), un análogo nucleósido de la timidina. BrdU se incorpora fácilmente en las hebras de ADN nacientes durante la síntesis de ADN y, en general, se utiliza para monitorear la replicación del ADN nuclear14. Sin embargo, el procedimiento desarrollado aquí ha sido optimizado para detectar BrdU incorporado en el ADNmt utilizando la inmunofluorescencia de anticuerpos anti-BrdU.
El enfoque permite la cuantificación de alto rendimiento de la síntesis y distribución de ADNmt en células humanas cultivadas in vitro. Es necesaria una estrategia de alto rendimiento para realizar pruebas en diferentes condiciones experimentales en un tiempo relativamente corto; Por lo tanto, en el protocolo se propone utilizar un formato de pocillos múltiples para el cultivo celular y microscopía de fluorescencia automatizada para la obtención de imágenes. El protocolo incluye la transfección de células HeLa humanas con una biblioteca de ARNip y el posterior monitoreo de la replicación o reparación del ADNmt utilizando el etiquetado metabólico del ADN recién sintetizado con BrdU. Este enfoque se combina con la inmunotinción del ADN con la ayuda de anticuerpos anti-ADN. Ambos parámetros se analizan mediante microscopía de fluorescencia cuantitativa. Además, las mitocondrias se visualizan con un tinte específico. Para demostrar la especificidad del protocolo, se probó la tinción de BrdU en células desprovistas de ADNmt (células rho0), en células HeLa tras el silenciamiento de factores de mantenimiento de ADNmt bien conocidos y en células HeLa después del tratamiento con un inhibidor de la replicación del ADNmt. Los niveles de ADNmt también se midieron mediante un método independiente, a saber, qPCR.
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Protocol
1. Preparación de la mezcla de siRNA
- Un día antes del inicio del experimento, células semilla (por ejemplo, HeLa) en un plato de 100 mm para que alcancen una confluencia del 70% -90% al día siguiente.
NOTA: Todas las operaciones deben realizarse en condiciones estériles en una cámara de flujo laminar. - Preparar la cantidad adecuada de siRNA diluido a una concentración de 140 nM en medio Opti-MEM (ver Tabla de materiales). Una placa de 96 pocillos se puede utilizar como depósito.
- Agregue 5 μL de la solución de ARNip (o medio Opti-MEM para las muestras de control) a cada pocillo de una microplaca de cultivo celular negro de 384 pocillos.
NOTA: Dependiendo del número de muestras de ARNip analizadas, se puede utilizar una pipeta electrónica o multicanal. - Prepare la cantidad adecuada de solución de reactivo de transfección RNAiMAX (consulte la Tabla de materiales) en medio Opti-MEM. Añadir 1 μL de RNAiMAX por cada 100 μL de medio.
- Agregue 10 μL de la solución de reactivo de transfección a cada pocillo de la placa de 384 pocillos. La forma más conveniente y rápida de hacerlo es con un dispensador de reactivos.
- Incubar el ARNip con el reactivo de transfección durante 30 min a temperatura ambiente.
2. Preparación de células para la transfección
- Durante la incubación (paso 1.6), aspirar el medio con un dispositivo de succión (ver Tabla de materiales) y lavar las células con 3 ml de PBS.
- Añadir 1,5 ml de tripsina diluida 1:2 en PBS, e incubar las células a 37 °C durante 10 min.
- Compruebe si las células se han desprendido; si es así, agregue 3 ml de medio DMEM con 10% de FBS. Suspenda bien las células y transfiéralas a un tubo de 15 ml. Tome al menos 150 μL de la suspensión y cuente las células en una cámara de conteo de células (consulte la Tabla de materiales).
- Prepare una suspensión celular a la concentración apropiada (35,000 / ml para la línea HeLa) en medio DMEM con FBS al 10%, penicilina y estreptomicina.
3. Transfección celular
- Agregue 20 μL de la suspensión celular a cada pocillo de la placa de 384 pocillos utilizando el dispensador de reactivos. Esto resultará en 700 células sembradas por pozo.
- Incubar las células durante 1 h a temperatura ambiente y, a continuación, colocarlas en la incubadora durante 72 h (37 °C y 5% deCO2).
4. Incorporación de BrdU
- Prepare una solución de 90 μM de BrdU (consulte la Tabla de materiales) en medio DMEM con 10% de FBS.
- A las 56 h después de la transfección del ARNip (16 h antes de la fijación celular), añadir 10 μL de solución de BrdU de 90 μM a cada pocillo de la placa de 384 pocillos (la concentración final de BrdU es de 20 μM).
NOTA: La acción debe realizarse lo más rápido posible; Por lo tanto, es mejor usar un dispensador de reactivos, una pipeta electrónica o una pipeta de múltiples dispensadores. Recuerde preparar pozos de control sin la adición de BrdU. - Incubar las células durante 16 h (37 °C y 5%CO2).
5. Etiquetado de las mitocondrias
- Prepare una solución de 20 μM de BrdU en DMEM con 10% de FBS, y agréguele la solución de colorante de seguimiento de mitocondrias (consulte la Tabla de materiales) a una concentración de 1.1 μM.
- A las 15 h después del inicio de la incorporación de BrdU (1 h antes de la fijación celular), agregue 10 μL de la solución de colorante de seguimiento de mitocondrias (consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo de la placa de 384 pocillos (la concentración final de colorante es de 200 nM).
NOTA: Utilice un dispensador de reactivo, una pipeta electrónica o una pipeta de varios dispensadores. Recuerde retener los pozos de control sin la adición de BrdU, pero con la adición del tinte de seguimiento de las mitocondrias. - Incubar las células durante 1 h (37 °C y 5%CO2).
6. Fijación celular
NOTA: Todo el lavado se realiza más convenientemente con una lavadora de microplacas, mientras que la adición de reactivos se realiza más rápidamente con un dispensador de reactivos.
- Usando la lavadora de microplacas (ver Tabla de materiales), enjuague cada pocillo dos veces con 100 μL de PBS. Después del segundo lavado, deje 25 μL de PBS en el pozo.
NOTA: Dejar PBS en el pozo reduce la probabilidad de desprendimiento celular durante la adición de líquido en el siguiente paso. Todos los lavados se completan con el PBS sobrante; por lo tanto, la solución agregada en el siguiente paso siempre debe prepararse a una concentración de 2x, ya que se agregará en un volumen igual al PBS restante. - Fijar las células añadiendo 25 μL de una solución de formaldehído al 8% en PBS con Triton X-100 al 0,4% y Hoechst 33342 a una concentración de 4 μg/ml (las concentraciones finales de reactivos individuales son 4%, 0,2% y 2 μg/ml, respectivamente) (ver Tabla de materiales).
- Incubar el plato en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min.
7. Bloqueo
- Enjuague cada pocillo cuatro veces con 100 μL de PBS. Después del último lavado, deje 25 μL de PBS en el pozo.
- Agregue 25 μL de BSA al 6% en PBS (la concentración final de BSA es del 3%) a cada pocillo.
- Incubar el plato en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min.
8. Adición de los anticuerpos primarios
- Aspirar el BSA con una arandela de microplacas y dejar 10 μL de solución en el pozo.
- Añadir 10 μL de la solución de anticuerpos primarios preparada en BSA al 3% en PBS. Use anti-BrdU a 0.8 μg/mL y anti-DNA a 0.4 μg/mL (las concentraciones finales de anticuerpos son 0.4 μg/mL y 0.2 μg/mL, respectivamente) (ver Tabla de materiales).
- Incubar la placa en la oscuridad a 4 °C durante la noche.
9. Adición de los anticuerpos secundarios
- Enjuague cada pocillo cuatro veces con 100 μL de PBS. Después del último lavado, deje 10 μL de PBS en el pozo.
- Añadir 10 μL de la solución de 4 μg/ml de anticuerpos secundarios preparada en BSA al 6% en PBS (la concentración final es de 2 μg/ml). Utilice anticuerpos específicos del isotipo (IgG1 anti-ratón e IgM anti-ratón) conjugados a fluorocromos como Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 555 (ver Tabla de materiales).
- Incubar el plato en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 h.
- Enjuague cada pocillo cuatro veces con 100 μL de PBS. Después del último lavado, deje 50 μL de PBS en el pozo.
- Selle la placa con una película de sellado adhesiva (consulte la Tabla de materiales) y guárdela en la oscuridad a 4 °C. Las imágenes deben realizarse dentro de las 2 semanas.
10. Imágenes
NOTA: Las imágenes deben realizarse con un microscopio automatizado de campo amplio; El microscopio debe estar equipado con una etapa de motor suministrada con controles para obtener imágenes automáticas de áreas individuales de la placa.
- Compruebe la configuración del enfoque automático en las áreas de esquina de la placa (pozos A1, A24, P24, P1) y en el centro.
NOTA: Para la obtención de imágenes, se recomienda utilizar un objetivo de distancia de trabajo corta de 20x (consulte la Tabla de materiales) con la apertura numérica más alta posible. - En función de los histogramas de intensidad generados por el software de imágenes en el modo de visualización en vivo, seleccione un tiempo de exposición suficientemente largo para los canales de fluorescencia individuales para que la imagen resultante no esté sobresaturada.
- Establezca el número adecuado de planos para obtener imágenes en el eje z.
NOTA: El campo de visión con un aumento de 20x es lo suficientemente grande como para que no todas las celdas estén en el mismo plano de enfoque, por lo que se debe realizar una sección z para ver todas las celdas en su plano de enfoque correcto. Por lo general, cinco aviones son suficientes. Dependiendo de la disponibilidad de espacio en disco, se pueden guardar pilas z individuales o solo proyecciones de intensidad máxima. El análisis de imágenes que se muestra en la sección de resultados representativos se basa en proyecciones de intensidad máxima. - Seleccione el número adecuado de campos de vista para mostrar por pozo.
NOTA: Dependiendo de la confluencia, se pueden obtener imágenes de aproximadamente 60-300 celdas en un campo de visión. Por lo general, para las células HeLa con una confluencia del 60% -90%, la imagen de cinco campos de visión permitirá analizar desde 500 células hasta más de 1,000 células. - Seleccione los pozos de los que desea obtener la imagen y comience a crear imágenes.
11. Análisis cuantitativo de imágenes
NOTA: El análisis cuantitativo de las imágenes adquiridas se puede realizar utilizando un software de código abierto como Cell Profiler15. Para el presente estudio, el análisis se realizó utilizando el software ScanR 3.0.0 (ver Tabla de Materiales).
- Comience el análisis realizando la corrección de fondo para todas las imágenes de todos los canales de fluorescencia. Dependiendo del tamaño de los objetos analizados, seleccione el tamaño de filtro apropiado: 80 píxeles para núcleos celulares y 4 píxeles para puntos de BrdU y ADNmt.
- Comience a segmentar la imagen creando una máscara del objeto principal basada en la relación entre la intensidad de la señal de fluorescencia y el fondo para el canal correspondiente a los núcleos celulares.
- Cree máscaras para los subobjetos que representan los puntos BrdU y ADNmt, respectivamente, utilizando los canales de fluorescencia apropiados para las estructuras dadas.
NOTA: Cada subobjeto se asigna al objeto principal más cercano (núcleo celular). - Establezca los parámetros que se medirán durante el análisis y mida la intensidad de los píxeles individuales dentro de cada máscara para todos los canales de fluorescencia.
NOTA: También es necesario calcular el número de subobjetos asignados a un núcleo celular dado y el área de cada subobjeto. - Definir los parámetros derivados a calcular en base a los datos obtenidos. Para obtener las intensidades de fluorescencia totales para el canal BrdU o ADNmt, suma las intensidades de todos los subobjetos asignados a un núcleo celular dado. Para obtener la intensidad media de fluorescencia, divida la intensidad total de fluorescencia por la suma del área de los subobjetos asignados a un núcleo celular dado.
NOTA: Para asegurarse de que el subobjeto creado (BrdU o punto de ADNmt) se encuentra realmente en las mitocondrias, es necesario protegerlos en función de la intensidad de fluorescencia del tinte de seguimiento de las mitocondrias. - Realice un análisis más detallado de los datos obtenidos con el software ScanR utilizando el software estadístico R 4.2.216 junto con los siguientes paquetes: dplyr 17, data.table18, ggplot219 y ggpubr20. Este paso es opcional.
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Representative Results
En la Figura 1 se muestra un esquema del procedimiento para el estudio de alto rendimiento de la dinámica de la síntesis y distribución del ADNmt. El uso de un formato de placa de múltiples pocillos permite el análisis simultáneo de muchas condiciones experimentales diferentes, como el silenciamiento de diferentes genes utilizando una biblioteca de ARNsi. Las condiciones utilizadas para el etiquetado de moléculas de ADN recién sintetizadas con BrdU permiten la detección de ADN marcado con BrdU en las mitocondrias de las células HeLa (Figura 2A), pero también se pueden utilizar como condiciones iniciales para configurar el ensayo para otros tipos de células. El tiempo de incubación con BrdU debe seleccionarse para líneas celulares individuales sobre la base de un experimento de curso temporal (Figura complementaria 1). En el presente estudio, se utilizaron células HeLa, ya que el cribado de siRNAs requiere células que puedan ser transfectadas con alta eficiencia. Es importante destacar que la señal obtenida con anticuerpos anti-BrdU es específica, ya que solo se puede observar en células tratadas con BrdU (Figura 2). Las especificidades del etiquetado anti-BrdU y anti-ADN se confirmaron aún más utilizando células rho0 que carecen de ADN mitocondrial21 (Figura complementaria 2). Como era de esperar, en estas células, independientemente del tratamiento con BrdU, no se detectó ninguna señal en las mitocondrias tanto para los anticuerpos anti-BrdU como para los anticuerpos anti-ADN (Figura 2B). La cuantificación de la señal fluorescente de los anticuerpos anti-BrdU indicó que las células rho0 tratadas con BrdU mostraron el mismo nivel bajo de fluorescencia que las células no tratadas con BrdU, mientras que la señal para las líneas parentales A549 y HeLa fue, en promedio, 50 veces mayor (Figura 2C).
Para mostrar la utilidad del método presentado aquí en el estudio de la síntesis y distribución del ADN mitocondrial, se realizó un experimento en el que se trataron células HeLa con 2′,3′-didesoxicitidina (ddC), un inhibidor de la síntesis de ADNmt22, y se silenció la expresión de genes conocidos como esenciales para la replicación del ADNmt con ARNip (Figura 3). El tratamiento de las células con ddC condujo a la inhibición completa de la incorporación de BrdU, mientras que los siRNAs utilizados tuvieron efectos variados. La regulación a la baja de la helicasa Twinkle (TWNK)23 condujo a la inhibición más potente de la incorporación de BrdU; se observó un efecto más débil para la proteína TFAM24, mientras que el silenciamiento de la ADN polimerasa gamma mitocondrial (POLG)25 condujo a una disminución moderada en la incorporación de BrdU en comparación con las células tratadas con siRNA de control negativo (Figura 3A, B). El uso de anticuerpos anti-ADN en el procedimiento permite el monitoreo de la distribución de ADNmt en la célula bajo las condiciones experimentales dadas. La regulación a la baja de TFAM condujo a cambios drásticos en la distribución del ADNmt; se detectaron menos manchas de ADNmt en comparación con las células de control, pero las que permanecieron tenían una intensidad de fluorescencia muy alta (Figura 3A). La cuantificación de la señal de fluorescencia media del anticuerpo anti-ADN mostró un aumento de varias veces tras el silenciamiento de TFAM en comparación con las otras condiciones probadas (Figura 3C).
La especificidad de los resultados de imagen se verificó midiendo el ADNmt y los niveles de expresión génica con la ayuda de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) (Figura 4). El método se ha descrito detalladamente en otra parte26. El tratamiento con ddC resultó en una disminución muy fuerte en los niveles de ADNmt; se observó un efecto más débil en el caso del silenciamiento de TFAM y TWNK, mientras que la transfección de células con POLG siRNA tuvo un efecto muy modesto sobre el número de copias de ADNmt (Figura 4A). La cuantificación de la expresión de TFAM y TWNK confirmó una reducción eficiente en su expresión a ~15%-20% de los niveles de control, en contraste con POLG, cuya expresión a nivel de ARNm se redujo al 30% (Figura 4B).
Figura 1: Representación esquemática de los pasos del protocolo. Las barras de escala para las imágenes microscópicas son de 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Detección específica de la incorporación de BrdU en el ADNmt por anticuerpos anti-BrdU. Imágenes de muestra de células (A) HeLa y (B) A549 y A549 rho0 sometidas a tinción de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-BrdU (verde) y anti-ADN (rojo). Las células fueron tratadas o no tratadas con la solución BrdU. El ADN nuclear (azul) se marcó con Hoechst, y las mitocondrias (cian) se visualizaron con un tinte de seguimiento de mitocondrias. Se muestra una imagen combinada de los cuatro canales de fluorescencia. La barra de escala representa 10 μm. (C) El resultado de la cuantificación de la señal de los anticuerpos anti-BrdU. El análisis se llevó a cabo para cuatro réplicas biológicas independientes; cada vez, se analizaron 100 células seleccionadas al azar para cada condición experimental (N = 400 células). En promedio, se detectaron 18 focos BrdU por célula. Las cajas representan el primer y tercer cuartil del rango intercuartil (IQR), la mediana está representada por una línea horizontal, los bigotes definen el mínimo y el máximo, y los valores atípicos se definen como 1.5 x IQR. Se realizó una prueba estadística de Kruskal-Wallis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados de la inhibición de la síntesis de ADNmt, incluida la reducción de la eficiencia de la incorporación de BrdU y la distribución de nucleoides. (A) Imágenes de fluorescencia de muestra de células HeLa tratadas durante 72 h con ddC o siRNA, que regulan a la baja las proteínas involucradas en la replicación del ADNmt. Las células fueron tratadas con BrdU durante 16 h antes de la fijación. El ADN nuclear (azul) se tiñó con Hoechst, se utilizaron anticuerpos anti-BrdU (verde) y anti-ADN (rojo), y las mitocondrias se marcaron con un tinte de seguimiento de mitocondrias. Se muestra una imagen combinada de los cuatro canales de fluorescencia. La barra de escala representa 10 μm. (B,C) Cuantificación de las señales de fluorescencia de (B) anticuerpos anti-BrdU y (C) anti-ADN. El análisis se llevó a cabo para cuatro réplicas biológicas independientes; cada vez, se analizaron 650 células seleccionadas al azar para cada condición experimental (N = 2.600 células). En promedio, se detectaron 18 focos de BrdU y 46 focos de ADNmt por célula. Las cajas representan el primer y tercer cuartil del rango intercuartil (IQR), la mediana está representada por una línea horizontal, los bigotes definen el mínimo y el máximo, y los valores atípicos se definen como 1.5 x IQR. Se realizó una prueba estadística de Kruskal-Wallis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Validación de la eficiencia de la inhibición de la síntesis de ADNmt y de la eficacia de los siRNAs probados. Las células HeLa fueron tratadas durante 72 h con ddC o los siRNAs indicados y luego sometidas a aislamiento de ADN y ARN. (A) Resultados del análisis del nivel de ADNmt mediante qPCR. (B) análisis por qPCR de cambios en la expresión génica en las condiciones indicadas. Las barras representan los valores medios de cuatro réplicas biológicas independientes; las barras de error representan el SEM; se realizó una prueba estadística ANOVA; se realizó una prueba t para la comparación por pares con muestras Untr (no tratadas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Dinámica de la incorporación de BrdU en el ADNmt de las células HeLa. Se muestran los resultados de un experimento de curso temporal en el que las células se incubaron con 20 μM BrdU durante un tiempo determinado. Se muestran las medias de cuatro réplicas independientes para cada punto de tiempo; Se analizaron 900 células seleccionadas al azar en cada réplica. Las barras representan los medios de cuatro réplicas; se realizó una prueba estadística ANOVA. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Validación de las células A549 rho0. (A) Análisis electroforético de los productos de qPCR a partir de la amplificación de fragmentos de ADN de los genes ND1 codificado por ADNmt y B2M codificado por ADN nuclear. El ADN total de las células Rh549 o A549 rho0 se utilizó como plantillas en la reacción. (B) Resultados del análisis del nivel de ADNmt mediante qPCR. Las barras representan los valores medios de cuatro réplicas biológicas independientes; las barras de error representan el SEM; Se realizó una prueba T. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Históricamente, el etiquetado de ADN por incorporación de BrdU y detección de anticuerpos se ha utilizado en la replicación del ADN nuclear y la investigación del ciclo celular 14,27,28. Hasta ahora, todos los protocolos para detectar ADN marcado con BrdU han incluido un paso de desnaturalización del ADN (ácido o térmico) o digestión enzimática (DNasa o proteinasa) para permitir la exposición al epítopo y facilitar la penetración de anticuerpos. Estos protocolos fueron desarrollados para ADN nuclear apretado. Sin embargo, la diferente organización del ADNmt permitió el desarrollo de un procedimiento sin la etapa de desnaturalización; Esto ha simplificado el procedimiento y lo ha hecho más adecuado para aplicaciones de alto rendimiento. Este enfoque ha dado excelentes resultados porque omitir el paso de desnaturalización da como resultado la detección de ADN marcado con BrdU solo fuera del núcleo (Figura 2 y Figura 3). En consecuencia, la fuerte señal del ADN nuclear, que siempre está presente cuando se incluye un paso de desnaturalización y que puede causar un problema grave al enmascarar la señal del ADNmt29 marcado con BrdU, se puede evitar con este protocolo. Además, la falta de desnaturalización severa asegura una mejor preservación de las estructuras celulares y no afecta la eficiencia de la tinción por tinciones fluorescentes como Hoechst o colorante de seguimiento mitocondrial (Figura 2 y Figura 3).
La dinámica de la incorporación de BrdU en el ADNmt depende de la línea celular. Se recomienda hacer un experimento de curso de tiempo sobre la incorporación de BrdU siempre que se use una nueva línea celular. Este estudio ha establecido 16 h como un tiempo óptimo de incubación de BrdU para líneas celulares HeLa. Sin embargo, debido a la variación biológica en las líneas HeLa de diferentes laboratorios30, se sugiere realizar un experimento de curso de tiempo BrdU en la variante particular de HeLa con la que se planea trabajar.
La combinación de anti-BrdU y anti-ADN en este protocolo permite el monitoreo de la síntesis de ADNmt y el estudio simultáneo de la distribución de ADNmt en la célula. Esto se puede ver muy bien en células silenciadas por TFAM (Figura 3). La disminución del nivel de TFAM conduce a una reducción en la síntesis de ADNmt (una disminución de la señal total anti-BrdU) y a la agrupación de nucleoides mitocondriales, que se manifiesta por un aumento sustancial en la señal media de fluorescencia de ADNmt (Figura 3). Cabe señalar que, en este caso, el aumento en la intensidad media de fluorescencia del ADNmt es causado por la distribución cambiada de los nucleoides mitocondriales y no refleja la regulación positiva de los niveles de ADNmt; de hecho, los niveles de ADNmt se reducen, como lo revela el análisis cuantitativo de PCR (Figura 4A). Se obtuvieron resultados sorprendentes para las células transfectadas con POLG siRNA (Figura 3). Se podría esperar que la transfección de células con POLG dirigido a ARNsi, que es la ADN polimerasa replicativa en las mitocondrias, reduciría significativamente la incorporación de BrdU en el ADNmt. Sin embargo, en este estudio, el efecto sobre la incorporación de BrdU fue insignificante (Figura 3), como se confirma al medir los niveles de ADNmt mediante qPCR (Figura 4A). La mala regulación a la baja de la expresión de POLG puede explicar este resultado aparentemente contradictorio en la transfección de células con el siRNA aplicado (Figura 4B). Esto resalta una desventaja potencial del uso de ARNip para estudios funcionales y sugiere que existe la necesidad de validación del silenciamiento génico.
En general, se ha desarrollado un ensayo para estudiar la dinámica del metabolismo del ADNmt en células cultivadas que utiliza un formato de placa de múltiples pocillos e imágenes de inmunofluorescencia para detectar y cuantificar la replicación, reparación y distribución del ADNmt. El método permite el estudio simultáneo de muchas condiciones experimentales diferentes. Se puede utilizar para investigar los efectos de varios inhibidores, tensiones celulares y silenciamiento génico en el metabolismo del ADNmt. Si bien el ensayo tiene un alto potencial para su uso en el estudio del metabolismo del ADNmt en diversos contextos fisiológicos y patológicos, debe tenerse en cuenta que el ensayo no permite distinguir la replicación y la síntesis de ADNmt vinculada a la reparación. Esto debe tenerse en cuenta al interpretar los resultados y planificar experimentos funcionales posteriores. En particular, el ensayo tiene un mayor potencial de desarrollo. Por ejemplo, los nucleoides mitocondriales inactivos de replicación (o reparadores inactivos) no se detectan con anticuerpos anti-BrdU. Por lo tanto, la aplicación de anticuerpos anti-ADN permite la cuantificación de los niveles de estado de ADNmt, el número de nucleoides silenciosos de replicación y la distribución de nucleoides en la célula.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de Ciencias, Polonia (Número de subvención / premio: 2018/31 / D / NZ2 / 03901).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
References
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
- Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284 (2019).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102 (2020).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
- Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579 (2020).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S.
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
- Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
- Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2021).
- Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021).
- Dowle, M., Srinivasan, A. data.table: Extension of `data.frame. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016).
- Kassambara, A. ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020).
- Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
- Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
- Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
- Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
- Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
- Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
- Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).
