Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة للاكتساب المتزامن والتسجيل المشترك لأحداث الإشارات داخل الخلايا وإفراز الأنسولين والجلوكاجون بواسطة الجزر الكاذبة البشرية الأولية باستخدام توصيل الفيروس الغدي لمستشعر حيوي دوري أدينوسين أحادي الفوسفات (cAMP) ، وكاشف فرق cAMP في الموقع (cADDis) ، ونظام microperifusion.
Abstract
جزر البنكرياس في لانجرهانز ، وهي مجموعات 3D صغيرة من الغدد الصماء المتخصصة والخلايا الداعمة التي تتخللها البنكرياس ، لها دور مركزي في السيطرة على توازن الجلوكوز من خلال إفراز الأنسولين بواسطة خلايا بيتا ، مما يخفض نسبة الجلوكوز في الدم ، والجلوكاجون بواسطة خلايا ألفا ، مما يرفع نسبة الجلوكوز في الدم. تعد مسارات الإشارات داخل الخلايا ، بما في ذلك تلك التي تتوسطها cAMP ، أساسية لتنظيم إفراز هرمون خلايا ألفا وبيتا. هيكل جزيرة 3D ، في حين أنه ضروري لوظيفة الجزيرة المنسقة ، يقدم تحديات تجريبية للدراسات الميكانيكية لمسارات الإشارات داخل الخلايا في خلايا الجزيرة البشرية الأولية. للتغلب على هذه التحديات والقيود ، يصف هذا البروتوكول تصويرا متكاملا للخلايا الحية ومنصة الموائع الدقيقة باستخدام الجزر الكاذبة البشرية الأولية المتولدة من متبرعين غير مصابين بداء السكري تشبه الجزر الأصلية في مورفولوجيتها وتكوينها ووظيفتها. يتم التحكم في حجم هذه الجزر الكاذبة من خلال عملية التشتت وإعادة تجميع الخلايا الجزيرية البشرية الأولية. في الحالة المشتتة ، يمكن التلاعب بالتعبير الجيني لخلية الجزيرة. على سبيل المثال ، يمكن إدخال أجهزة الاستشعار الحيوية مثل المستشعر الحيوي cAMP المشفر وراثيا ، cADDis. بمجرد تشكيلها ، تسمح الجزر الكاذبة التي تعبر عن مستشعر حيوي مشفر وراثيا ، جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري متحد البؤر ومنصة microperifusion ، بالتقييم المتزامن لديناميكيات المستشعر الحيوي الفلوري وملامح إفراز هرمون خلايا ألفا وبيتا لتوفير مزيد من التبصر في العمليات الخلوية والوظيفة.
Introduction
جزر لانجرهانز أعضاء صغيرة منتشرة في جميع أنحاء البنكرياس، ووظيفتها حاسمة للحفاظ على توازن الجلوكوز. يفرز الأنسولين من خلايا بيتا بعد استقلاب الجلوكوز ، وزيادة نسبة ATP / ADP ، وإغلاق قنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP ، وإزالة استقطاب غشاء البلازما ، وتدفق الكالسيوم خارج الخلية1. إفراز الجلوكاجون من خلايا ألفا أقل فهما ، ولكن تم افتراض أن المسارات داخل الخلايا و paracrine تساهم في زيادة عدد الخلايا الحبيبيةللجلوكاجون 2،3،4. يرتبط كل من مرض السكري من النوع 1 والنوع 2 بخلل الخلايا الجزيرية5،6،7. لذلك ، فإن توضيح مسارات الإشارات داخل الخلايا التي تتوسط إفراز هرمون الجزيرة أمر ضروري لفهم الآليات الفسيولوجية والمرضية في جزر البنكرياس.
تمثل العمارة الكروية للجزر بعض العقبات أمام التجريب. وتشمل هذه التحديات اختلاف حجم الجزيرة وطبيعة 3D للجزر ، مما يقلل من نقل الفيروس داخل قلب الجزيرة 8,9. للتغلب على هذه التحديات ، تم تطوير نظام الجزر الزائفة ، حيث يتم تشتيت الجزر البشرية الأولية في خلايا مفردة ، وتحويلها بشكل غدي مع تركيبات ترميز الأهداف ذات الأهمية ، وإعادة تجميعها لتشكيل هياكل تشبه الجزر يتم التحكم فيها بالحجم تسمى الجزر الزائفة7. بالمقارنة مع الجزر الأصلية من نفس المتبرع التي تم استزراعها بالتوازي ، فإن هذه الجزر الزائفة متشابهة في التشكل وتكوين خلايا الغدد الصماء وإفراز الهرمونات7. تسمح هذه الطريقة بالتعبير عن التركيبات في جميع أنحاء الجزيرة الكاذبة ، مما يعني أنها تتغلب على حاجز سابق أمام التلاعب الجيني الموحد للجزر البشرية الأولية7،8،9.
في هذا البروتوكول ، تم دمج نظام الجزر الكاذبة مع جهاز الموائع الدقيقة للتعبير عن أجهزة الاستشعار الحيوية في خلايا الجزيرة البشرية الأولية والحصول على دقة زمنية لإفراز هرمون الجزيرة الكاذبة أثناء الانتشار الديناميكي10،11،12. يتم وضع الجزر الكاذبة في رقاقة دقيقة وتعريضها لتدفق مستمر من الإفرازات المختلفة عبر مضخة تمعجية12. تحتوي الرقاقة الدقيقة على قاع زجاجي شفاف ويتم تركيبها على مجهر متحد البؤر لتسجيل ديناميكيات الإشارات داخل الخلايا عبر التغيرات في شدة مضان المستشعر الحيوي. تتم مزامنة تصوير المستشعر الحيوي مع مجموعة النفايات السائلة الدقيقة للتحليل اللاحق لإفراز الأنسولين والجلوكاجون7. بالمقارنة مع macroperifusion ، يسمح نهج microperifusion هذا باستخدام عدد أقل من الجزر الكاذبة بسبب الحجم الأصغر لجهاز الموائع الدقيقة مقارنة بغرفة macroperifusion7.
لتسخير فائدة هذا النظام ، تم التعبير عن كاشف فرق الأدينوزين أحادي الفوسفات الدوري (cAMP) في المستشعر الحيوي في الموقع (cADDis) في الجزر الكاذبة البشرية لتقييم ديناميكيات cAMP وإفراز الهرمونات . يتكون المستشعر الحيوي cADDis من بروتين فلوري أخضر دائري (cpGFP) يتم وضعه في منطقة المفصلة لبروتين التبادل الذي يتم تنشيطه بواسطة cAMP 2 (EPAC2) ، ويربط مناطقه التنظيمية والحفازة. يؤدي ارتباط cAMP بالمنطقة التنظيمية ل EPAC2 إلى حدوث تغيير توافقي في منطقة المفصلة يزيد من التألق من cpGFP13. تستنبط الرسل داخل الخلايا مثل cAMP إفراز الأنسولين والجلوكاجون بعد التنشيط الأولي للمستقبلات المقترنة بالبروتين G14. يساعد تصوير الخلايا الحية إلى جانب microperifusion على ربط ديناميكيات cAMP داخل الخلايا بإفراز هرمون الجزيرة. على وجه التحديد ، في هذا البروتوكول ، يتم إنشاء الجزر الكاذبة المعبرة عن cADDis لمراقبة استجابات cAMP في خلايا ألفا وبيتا للمحفزات المختلفة: انخفاض الجلوكوز (2 mM الجلوكوز. G 2) ، ارتفاع الجلوكوز بالإضافة إلى إيزوبوتيل ميثيل زانثين (IBMX ؛ 20 مللي متر جلوكوز + 100 ميكرومتر IBMX ؛ G 20 + IBMX) ، وانخفاض الجلوكوز بالإضافة إلى الأدرينالين (Epi ؛ 2 mM الجلوكوز + 1 μM Epi ؛ G 2 + Epi). يسمح سير عمل العلاج هذا بتقييم ديناميكيات cAMP داخل الخلايا مباشرة عبر 1) تثبيط الفوسفوديستراز بوساطة IBMX ، والذي يعزز مستويات cAMP داخل الخلايا عن طريق منع تدهوره ، و 2) الأدرينالين ، وهو محفز معروف يعتمد على cAMP لإفراز الجلوكاجون في خلايا ألفا بوساطة تنشيط مستقبلات β الأدرينالية. فيما يلي تفاصيل خطوات إعداد جهاز microperifusion لتجارب تصوير الخلايا الحية ، وتحميل الجزر الكاذبة في الرقاقة الدقيقة ، والتصوير المتزامن للخلايا الحية و microperifusion ، وتحليل آثار المستشعر الحيوي وإفراز الهرمونات بواسطة فحوصات الهرمونات القائمة على الصفيحة الدقيقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على الجزر البشرية (N = 4 مستحضرات) من خلال شراكات مع برنامج توزيع الجزر المتكامل ، وبرنامج تحليل البنكرياس البشري ، ومختبرات Prodo ، Inc. ، و Imagine Pharma. لا يعتبر مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة فاندربيلت عينات البنكرياس البشرية غير المحددة كأبحاث بشرية. لن يكون هذا العمل ممكنا بدون المتبرعين بالأعضاء وعائلاتهم ومنظمات شراء الأعضاء. انظر الجدول 1 للاطلاع على المعلومات الديمغرافية للمانحين. تم عزل الجزر البشرية من المتبرعين بالبنكرياس غير المصابين بداء السكري بأقل من 15 ساعة من وقت نقص التروية الباردة.
1. تشكيل جزيرة زائفة (مفصلة في Walker et al.7)
- احصل على الجزر البشرية الأولية واخترها يدويا باستخدام ماصة P200 ومجهر منضدة ، مع إيلاء اهتمام وثيق لعدم تلويث طرف الماصة على أي أسطح خارج وسط استزراع الجزيرة (10٪ FBS ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، 100 وحدة / مل بنسلين ، 2 مللي متر L-glutamine في CMRL 1066).
- انقل الجزر الأولية إلى أنبوب سعة 15 مل ، وقم بإجراء جميع خطوات تكوين الجزر الزائفة التالية تحت غطاء زراعة الأنسجة لمنع التلوث. افصل الجزر الأولية ببطء لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة باستخدام ماصة P1000 في 0.025٪ تربسين. سيصبح الحل معتما عندما تبدأ الجزر في الانهيار.
- بالنسبة لهذه الدراسات ، فإن 200-300 جزيرة أولية منتقاة يدويا بأقطار تبلغ حوالي 200 ميكرومتر منتشرة في 500 ميكرولتر من 0.025٪ من التربسين تنتج صفيحة إلى صفيحتين من 96 بئرا من الجزر الزائفة. قد يختلف العدد الدقيق اعتمادا على متوسط حجم الجزيرة وصلاحيتها. بالنسبة للجزر >500 جزيرة أولية، قم بزيادة حجم 0.025٪ من التربسين المستخدم بنسبة 1: 1 (على سبيل المثال، 600 ميكرولتر من 0.025٪ تربسين ل 600 جزيرة منتقاة يدويا).
- قم بإخماد التشتت عن طريق إضافة حجم من وسائط Vanderbilt Pseudoislet (VPM) يعادل حجم التربسين المستخدم. ثم اغسل مرتين ب 1 مل من VPM. بالنسبة للغسيل ، قم بطرد مركزي للخلايا المشتتة عند 485 × جم لمدة 2-3 دقائق عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي على الطاولة. أعد تعليق الخلايا في وحدة تخزين محددة من VPM (عادة 1 مل) للعد.
ملاحظة: تم تفصيل جيل الجزر الزائفة وتكوين VPM في منشور سابق7. باختصار ، يحتوي VPM على كميات متساوية من وسائط CMRL المخصبة (20٪ FBS ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، 100 وحدة / مل بنسلين ، 1 مللي مول بيروفات الصوديوم ، 2 مللي مول جلوتاماكس ، 2 مللي مول HEPES في CMRL 1066) و iEC-media (VEGF Medium Complete Kit ناقص FBS + 1 زجاجة من مكمل الخلايا البطانية المتوسط). يتم تضمين مخطط موجز لتوليد الجزر الزائفة في الشكل 1 أ. - حدد عدد الخلايا وصلاحيتها باستخدام عداد خلية آلي من خلال الجمع بين 10 ميكرولتر من Trypan Blue مع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية. امزج تعليق الخلية جيدا لضمان عدد الخلايا بدقة.
- احسب حجم تعليق الخلية والفيروسات و VPM المطلوب للعدد المطلوب من الجزر الزائفة. قم بتأسيس جميع الحسابات على عدد الخلايا الحية التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.4.
- بالنسبة لهذه الدراسات ، تم تحويل الخلايا الجزيرية البشرية المشتتة عند MOI 500 (N = 1) أو 1000 (N = 2) مع Ad-CMV-cADDis بحجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر. تنتج صفيحة واحدة من الجزر الكاذبة المحولة (2000 خلية / جزيرة زائفة) ثلاث نسخ تقنية لكل متبرع (32 جزيرة كاذبة / تجربة). تم الحصول على الفيروس الغدي تجاريا في هذا العمل.
- اجمع بين الكميات المحسوبة من تعليق الخلية والفيروسات و VPM في أنبوب سعة 1.5 مل. امزج المحتويات برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
- أثناء النقل ، احتضان الأنابيب بأغطية مفتوحة ، وقم بتغطيتها بطبق بتري معقم لمدة ساعتين في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2/95٪ هواء.
- أضف 500 ميكرولتر من VPM إلى كل أنبوب ، واغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي لها عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. أكمل غسلتين أخريين ليصبح المجموع ثلاث غسلات. نضح من طاف، وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من VPM.
- احسب إجمالي حجم بذر الخلية (200 ميكرولتر / جزيرة كاذبة). أضف VPM (حجم بذر الخلية المحسوب ناقص 2 مل) إلى أنبوب مخروطي الحجم مناسب. أضف معلق الخلية المستحثة من الخطوة 1.7 إلى الأنبوب المخروطي. حافظ على الأنبوب المخروطي مغلقا قليلا ولكن ليس مغلقا بإحكام للسماح بتبادل الهواء للخلايا.
- اشطف الأنبوب سعة 1.5 مل (من الخطوة 1.7) ب 1 مل من VPM ، وانقل المحتويات إلى الأنبوب المخروطي ، وعند هذه النقطة يجب أن يحتوي الأنبوب المخروطي على إجمالي حجم بذر الخلية.
- امزج محتويات الأنبوب المخروطي جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة مصلية آلية ، ثم انقل المحتويات إلى خزان كاشف معقم. إذا كان الخزان لا يحتوي على حجم بذر الخلية بالكامل ، فقم بإجراء عمليات نقل تسلسلية ، وتأكد من خلط التعليق جيدا في كل خطوة.
- باستخدام ماصة P200 متعددة القنوات ، قم بسحب تعليق الخلية في خزان الكاشف لأعلى ولأسفل 3-4 مرات لضمان التجانس ، ثم قم بسحب 200 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من ألواح microwell.
- احتضان الجزر الكاذبة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2/95٪ هواء لمدة 6 أيام دون تغييرات متوسطة. بحلول اليوم 6 ، يجب أن تكون الجزر الكاذبة مكتملة التكوين وجاهزة للتجارب (الشكل 1B-D).
2. التحضير لتصوير الخلايا الحية و microperifusion (1 يوم قبل التجربة)
ملاحظة: تتوفر معلومات عن تحضير وسط microperifusion من خلال مورد protocols.io (https://www.protocols.io/view/analysis-of-islet-function-in-dynamic-cell-perifus-bt9knr4w.html).
- احصد الجزر الكاذبة باستخدام ماصة متعددة القنوات عن طريق نقلها من طبق 96 بئرا إلى طبق بتري معقم. بعد ذلك ، اختر الجزر الكاذبة يدويا ، وانقلها إلى طبق بتري معقم آخر يحتوي على VPM طازج. اسمح للجزر الكاذبة بالاحتضان في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2/95٪ هواء طوال الليل.
- تحضير 1 لتر من DMEM عن طريق إضافة 1 غرام من BSA (درجة المقايسة المناعية الإشعاعية) ، 0.11 غرام من بيروفات الصوديوم ، 0.58 غرام من L- الجلوتامين ، 3.2 غرام من بيكربونات الصوديوم ، 1.11 غرام من HEPES ، وزجاجة واحدة من DMEM إلى 1 لتر من الماء فائق النقاء. قم بإعداد محلول مخزون الجلوكوز 1 متر في DMEM. احتفظ بكلا المحلولين عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
- تحقق من تدفق نظام microperifusion في اليوم السابق للتجربة. قم بتوصيل كل الأنبوب بحامل رقاقة يحتوي على شريحة فارغة ، كما هو موضح في الشكل 2A-B. استخدم المياه فائقة النقاء كنفايات سائلة لتأكيد معدل تدفق يبلغ 100 ميكرولتر / دقيقة في مجمع الكسر.
3. إضافة الأسرار إلى DMEM (يوم التجربة)
- أضف 0.07 مجم / مل أسكوربات إلى DMEM ، وقم بإعداد الإفرازات في DMEM + مخزن أسكوربات باستخدام مخزون جلوكوز 1 M للمخازن المؤقتة المحتوية على الجلوكوز.
ملاحظة: يستخدم الأسكوربات لتثبيت الإبينفرين عن طريق منع أكسدته. إذا لم يتم استخدام الإبينفرين ، يمكن حذف الأسكوربات من DMEM. - قم بتصفية الإفرازات مرتين من خلال مرشح المسام 0.22 ميكرومتر ، باستخدام مرشح جديد في كل مرة. قم بتسخين المحاليل إلى 37 درجة مئوية ، وقم بقياس الجلوكوز عبر جهاز قياس السكر لتأكيد التركيز المطلوب.
4. إعداد جهاز microperifusion
- قم بتسخين الغرفة البيئية لمجهر المسح بالليزر متحد البؤر إلى 37 درجة مئوية ، مما يضمن إغلاق جميع الأبواب والحفاظ على درجة حرارة ثابتة. ضع حامل الرقاقة الذي يحتوي على الرقاقة في الحجرة للإحماء. تحقق من درجة حرارة الرقاقة باستخدام مسدس الأشعة تحت الحمراء.
ملاحظة: في هذه الحالة ، يتم ضبط الغرفة البيئية على 38.5 درجة مئوية ، مما يسمح للرقاقة بالوصول إلى 37 درجة مئوية. - قم بتوصيل جميع الأنابيب بحامل الرقاقة (كما هو موضح في الشكل 2A-B). خط دافق مع إفراز خط الأساس لمدة 5 دقائق. في هذه الدراسة ، تم مسح الخط بجلوكوز 2 مللي متر (G 2). قم بتغيير غشاء مصيدة الفقاعات في جهاز إزالة الفقاعات كل 8-10 تجارب.
5. تحميل الجزر الكاذبة في الرقاقة
- قبل تحميل الرقاقة الدقيقة ، التقط صورة برايت فيلد ودارك فيلد (تكبير 10x) للجزر الزائفة التي سيتم استخدامها في التجربة للقياس الكمي اللاحق لمكافئات الجزر (IEQ).
ملاحظة: يستخدم IEQ لتطبيع إفراز الهرمون إلى الاختلافات في عدد الجزر عبر التجارب. يمكن أيضا القيام بهذه الخطوة في اليوم السابق للتجربة. - نضح أي سائل إضافي من النصفين السفلي والعلوي للرقاقة. يحتوي النصف العلوي من الرقاقة على حشيات تضمن ختما مناسبا لكل بئر ، بينما يحتوي النصف السفلي من الرقاقة على الآبار مع غطاء زجاجي متصل. قبل الرطب بئر واحد في رقاقة مع 5 ميكرولتر من DMEM. تأكد من السحب حول الحواف الخارجية للبئر لتبليل الشقوق.
- استخدم ماصة مبللة مسبقا لجمع 30-32 جزيرة زائفة بحجم 23 ميكرولتر ، وقم بتوزيع الجزر الكاذبة ببطء في وسط البئر في الجزء السفلي من الرقاقة. تحقق من طرف الماصة بحثا عن أي جزر كاذبة قد تكون متصلة.
- استخدم طرف تحميل هلام لمناورة الجزر الكاذبة برفق في وسط البئر. هذا يضمن أن الحد الأقصى لعدد الجزر الزائفة سيتم التقاطها في مجال الرؤية.
- التقط صورة للجزر الكاذبة في الرقاقة الدقيقة على المجسم. سيتم استخدام هذا العدد لضبط IEQ المحسوب لأي خسارة في الجزيرة الزائفة أثناء هذه العملية.
- إذا لم يتم تحميل جميع الجزر الزائفة من الخطوة 5.3 في الرقاقة ، فاضبط IEQ وفقا لذلك. على سبيل المثال ، إذا تم تصور 30 جزيرة زائفة الآن ولكن تم تصور 32 في الخطوة 5.1 ، فاحسب IEQ على الصور من الخطوة 5.1 ثم اضربها في 30/32.
- ضع الجزء السفلي من الرقاقة في حامل الرقاقة. ضع الجزء العلوي من الرقاقة بعناية بحيث يكون جانب الحشية الخضراء لأسفل.
- أثناء تثبيت الرقاقة في مكانها ، أغلق حامل الرقاقة برفق لربط الرقاقة معا. حاول ألا تضغط بشكل مفرط على الرقاقة أثناء هذه العملية ، لأن القيام بذلك سيؤدي إلى إزاحة السائل الموجود في البئر وقد يؤدي إلى فقدان الجزيرة الزائفة. تجنب إدخال فقاعات الهواء في البئر.
6. التصوير المتزامن للخلايا الحية و microperifusion
- انقل الإفرازات والمضخة والرقاقة الدقيقة في الحامل إلى الغرفة البيئية المثبتة على المجهر متحد البؤر. قم بتوجيه أنبوب التدفق خارج الغرفة إلى مجمع الكسر.
- ضع المخازن المؤقتة في أنابيب مخروطية سعة 15 مل مع فتحات محفورة في أغطيةها. تمنع هذه الثقوب أنبوب التجميع من الانجراف خارج الأنبوب.
- عند شد الأنبوب في جهاز إزالة الفقاعات ، افصل الجوز والطويق ، ثم قم بتثبيته في جهاز إزالة الفقاعات. هذا يمنع التواء الخط.
- اضبط جامع الكسر على الدوران كل 2 دقيقة. قم بتحميل العدد المناسب من الأنابيب في مجمع الكسور ، مع مراعاة الغسلات والكسور التجريبية. لهذه التجارب ، تم استخدام 15 أنبوب غسيل (30 دقيقة غسيل كلي) و 28 أنبوبا لجمع الكسور.
- ابدأ تشغيل المضخة لتوصيل الوسط الأساسي (الذي يحتوي على تركيز الجلوكوز الأساسي) عند 100 ميكرولتر / دقيقة (ينتج عن جمع 2 دقيقة بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / دقيقة 200 ميكرولتر من النفايات السائلة لكل أنبوب كسر). تم اختيار معدل التدفق هذا للحد من الضغط الهائل على الجزر الكاذبة ومنع حركة الجزر الزائفة الكبيرة أثناء التصوير الحي.
- أثناء تشغيل السائل عبر الجهاز ، راقب ما يلي:
- راقب القطرات في نهاية صنبور جامع الكسر ، والتي تشير إلى التدفق عبر النظام.
- راقب الانخفاضات في التدفق من النظام ؛ إذا كان هناك <200 ميكرولتر في أنابيب التجميع ، فهذا يشير إلى أنه قد يكون هناك انسداد أو تسرب في النظام. انظر الجدول 2 للحصول على قائمة بالأسباب المحتملة لانخفاض حجم النفايات السائلة والحلول ونصائح الوقاية.
- أثناء تشغيل السائل عبر الجهاز ، راقب ما يلي:
- بمجرد وجود تدفق متوسط ثابت من أنبوب التدفق ، قم بتدوير رأس مجمع الكسر للتوزيع في الأنابيب ، وابدأ مجمع الكسر. اجمع أول 15 جزءا (30 دقيقة) كغسول للسماح للجزر الكاذبة بالتوازن. استخدم هذه الكسور ال 15 الأولى لضمان التدفق المتوسط المستمر والدقيق عبر النظام. تخلص من هذه الكسور بعد ذلك.
- أثناء الغسيل لمدة 30 دقيقة ، قم بإعداد المجهر لتصوير الخلايا الحية وفقا لهذه المعلمات: عدسة موضوعية: U Plan Fluorite 20x مع تكبير 1x ؛ قنوات مضان: EGFP (الانبعاث = 510 نانومتر ، الطول الموجي بالليزر = 488 ، الطول الموجي للكشف = 500-600 نانومتر) ؛ السلاسل الزمنية: صورة تم الحصول عليها كل 2 ثانية لكامل التجربة (أي 56 دقيقة) ؛ سرعة أخذ العينات: 2 ميكروثانية / بكسل.
- حدد الجزء السفلي من الجزر الزائفة في مجال الرؤية واضبط المستوى البؤري على 15 ميكرومتر فوق هذا الموضع. هذا هو الإطار الذي سيتم استخدامه خلال تجربة التصوير.
- بمجرد اكتمال الغسيل لمدة 30 دقيقة ، ابدأ في جمع الكسور والحصول على الصور.
ملاحظة: يجب بذل كل الجهود لتحديد وتصحيح أي مشكلات قبل هذه الخطوة. بمجرد بدء جمع البيانات ، قد يؤثر أي توقف مؤقت في التجربة أو التعرض الزائد للإفرازات سلبا على النتائج. - استمر في تطويق الجزر الزائفة بوسط خط الأساس طوال مدة جمع خط الأساس الأول ، وجمع النفايات السائلة في أنابيب سعة 1.5 مل. قم بتبديل الأنبوب من المخزن المؤقت الأساسي يدويا إلى أنبوب المخزن المؤقت الجديد للتحفيز عندما يكون الوقت مناسبا للتجربة.
- يظهر تسلسل microperifusion القياسي في الجدول 3.
- بعد جمع ~ 10 كسور ، ضع جميع الكسور في ثلاجة 4 درجات مئوية حتى نهاية التجربة لمنع تدهور الهرمونات ، وخاصة الجلوكاجون.
- استمر في مراقبة تدفق النظام طوال التجربة عن طريق التحقق من حجم النفايات السائلة في كل أنبوب.
- عند اكتمال التجربة ، عد إلى الوسط الأساسي ، واسمح للمضخة بالاستمرار في العمل لمدة 5 دقائق لغسل التحفيز بوسط خط الأساس (في هذه الحالة ، 2 مللي مول جلوكوز).
- أوقف المضخة ، وافصل أنبوب حامل الرقاقة الدقيقة في أداة إزالة الفقاعات ومجمع الكسور لإزالة حامل الرقاقة الدقيقة من الغرفة البيئية. أغلق جميع الأبواب بعد إزالة الرقاقة للحفاظ على درجة الحرارة.
- قم بتخزين perifusates في -80 درجة مئوية لتحليل الهرمونات اللاحقة.
7. استخراج الإيثانول حمض الجزر الزائفة
- افتح حامل الرقاقة بعناية وارفع الجزء العلوي من الرقاقة. استخدم مجهر ماصة ومنضدة لالتقاط الجزر الكاذبة من البئر ونقلها إلى أنبوب سعة 1.5 مل. تأكد من جمع جميع الجزر الكاذبة باستخدام مجهر منضدة إذا لزم الأمر.
- التقط صورة نهائية للجزر الكاذبة في الرقاقة الدقيقة قبل إزالتها من البئر لضبط مستخلص الجزيرة IEQ ، على غرار الخطوة 5.5.
- اغسل مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. قم بتدوير الجزر الكاذبة لمدة 1 دقيقة عند 94 × جم بين كل غسلة ، ونضح من المادة الطافية.
- بعد إزالة الغسيل الأخير ، أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول الحمضي (5.5 مل من 95٪ إيثانول + 50 ميكرولتر من 12 نيوتن حمض الهيدروكلوريك). يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
- في اليوم التالي ، قم بتدوير المستخلصات لمدة 10 دقائق عند 15989 × جم و 4 درجات مئوية. القسمة 45 ميكرولتر في ثلاثة أنابيب جديدة. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية لتحليل محتوى الهرمونات. كبديل لتطبيع إفراز الهرمون إلى IEQ ، يمكن أيضا تطبيع إفراز الهرمون إلى محتوى هرمون الجزيرة الكاذبة المقاس من المستخلصات.
8. تجارب إضافية وتنظيف
- كرر الخطوات من 5 إلى 7 مع المجموعات اللاحقة من الجزر الزائفة للحصول على نسخ متماثلة تقنية إضافية.
- بعد الانتهاء من جميع تجارب microperifusion ، قم بتشغيل 10٪ من المبيض عبر الرقاقة الدقيقة والأنابيب لمدة 5 دقائق ثم الماء فائق النقاء لمدة 30 دقيقة لتعقيم الأنبوب.
9. تحليل البيانات
ملاحظة: تم إجراء تصوير الخلايا الحية باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر. تم تحليل الصور باستخدام حزمة برامج التصوير المرتبطة بالمجهر. فيما يلي إرشادات عامة ولكنها قد تختلف اعتمادا على الشركة المصنعة للمجهر وبرنامج الحصول على الصور.
- تحديد إجمالي مكافئات الجزر (IEQ) لتسوية البيانات
- افتح البرنامج ، وانقر فوق علامة التبويب " اكتساب" في أعلى يمين النافذة. نسخ الدفعات في جميع صور الحقول المظلمة عن طريق تحديد وظيفة حرق الدفعات في إدارة الماكرو (عرض أداة > Windows > إدارة الماكرو).
- لنسخ صور متعددة في وقت واحد ، انقر فوق الزر تبديل وضع الدفعات قبل النقر فوق الزر "تشغيل " داخل مدير الماكرو. اتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة لتحديد موقع الصورة المصدر وموقع الوجهة للصور المحروقة. لنوع ملف الصورة، اختر تنسيق ملف تخيل (*.tif).
- لقياس IEQ ، افتح الإصدار المحروق من صورة الحقل المظلم 10x التي تم التقاطها في الخطوة 5.1. انقر فوق علامة التبويب العد والقياس في الجزء العلوي ، واختر زر عتبة HSV اليدوي على اليسار.
- استخدم وظيفة القطارة لإضافة / إزالة المنطقة الموجبة (باللون الأحمر) حتى يتم تمييز كل جزيرة زائفة باللون الأحمر ، دون الامتداد إلى ما بعد حدود الجزيرة الزائفة. انقر فوق العد والقياس.
- استخدم وظائف التقسيم التلقائي أو التقسيم اليدوي لتقسيم الجزر الزائفة التي تم ضمها معا.
- لتقسيم الجزر الزائفة يدويا ، اختر وظيفة التقسيم اليدوي ، وانقر بزر الماوس الأيسر لرسم خط يفصل بين الجزر الزائفة ، ثم انقر بزر الماوس الأيمن لإكمال السطر. للتقسيم التلقائي ، اختر وظيفة التقسيم التلقائي ، وانقر فوق الجزر الزائفة المجمعة ذات الاهتمام. قم بتأكيد التقسيم التلقائي الصحيح بعد ذلك.
- في الصور المجمعة، قد يتم تمييز شريط القياس ونص التكبير كموجب. احذف هذه الكائنات للحصول على عد دقيق عن طريق تمييز النص وشريط القياس باستخدام الماوس والضغط على مفتاح حذف لوحة المفاتيح.
- قم بتبديل الفلتر وإيقاف تشغيله للتأكد من أنه يتم عد جميع الجزر الزائفة. يمكن أيضا فتح الملف خارج البرنامج للإحالة المرجعية. عند الانتهاء ، انقر فوق تصدير إلى Excel.
- افتح جدول البيانات، وقم بتعديله على النحو التالي.
- احذف معلومات العد والمتوسط والفرز في الأسفل. قم بفرز الكائنات بناء على متوسط قطرها. أدخل عمودا بعد متوسط القطر ، وقم بتسمية العمود "عدد الجزر الزائفة".
- يتم تحديد عدد الجزر من خلال عدد الجزر الزائفة ذات الأقطار المتوسطة التي تقع ضمن كل مؤشر أدناه. اضرب عدد الجزر الزائفة لكل فهرس في عامل تحويل IEQ المعني ، واجمع هذه القيم لتحديد إجمالي IEQ. قم بإجراء حسابات IEQ على الصور التي تم الحصول عليها قبل كل تجربة. استخدم الفهارس التالية وعوامل تحويل IEQ:
1-49 ميكرومتر: × 0.167
50-100 ميكرومتر: × 0.667
101-150 ميكرومتر: × 1.685
151-200 ميكرومتر: × 3.500
201-300 ميكرومتر: × 6.315
301-350 ميكرومتر: × 10.352 - للحصول على جدول بيانات مثال لتحديد أعداد IEQ، راجع الملف التكميلي 1.
- افتح البرنامج ، وانقر فوق علامة التبويب " اكتساب" في أعلى يمين النافذة. نسخ الدفعات في جميع صور الحقول المظلمة عن طريق تحديد وظيفة حرق الدفعات في إدارة الماكرو (عرض أداة > Windows > إدارة الماكرو).
- القياس الكمي لتصوير الخلايا الحية في البرامج
- افتح الملف المطلوب (.oir) في cellSens.
- حدد مناطق الاهتمام (ROIs) على النحو التالي.
- استخدم أدوات الرسم لتعيين عائد الاستثمار (أي كل جزيرة زائفة). إذا كنت تستخدم خيار الرسم اليدوي ، فانقر بزر الماوس الأيمن لإغلاق الشكل.
- قم بتمييز جميع عائد الاستثمار باستخدام يد السهم واسحبه ليشمل جميع عائد الاستثمار في الصورة. مع تمييز جميع عائد الاستثمار ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد تحويل إلى عائد استثمار ديناميكي بمرور الوقت
- قم بتشغيل ملف XYT للتأكد من دقة عائد الاستثمار بمرور الوقت. إذا كان عائد الاستثمار غير دقيق في فترة محددة ، فقم بتصحيح حجمه / موقعه في تلك الفترة. سيقوم البرنامج بتعديل حجم / موقع عائد الاستثمار تدريجيا بمرور الوقت لمطابقة هذه التغييرات. كرر هذه الخطوات حتى يصبح عائد الاستثمار دقيقا طوال تجربة التصوير.
- قم بإجراء قياسات الشدة على كل عائد استثمار على النحو التالي.
- في شريط الأدوات ، انقر فوق قياس ملف تعريف الكثافة. تسليط الضوء على عائد الاستثمار لتحليله ؛ استخدم Shift + Click لتحديد عائد استثمار متعدد.
ملاحظة: على الرغم من أن ملفات متعددة قد تكون مفتوحة في وقت واحد في البرنامج ، إلا أن تحليل عائد الاستثمار من ملف واحد فقط في كل مرة. - لحساب ضوضاء الخلفية، حدد قيمة ثابتة لطرحها من كل قيمة شدة، أو قم بتعيين عائد استثمار واحد كخلفية. انقر فوق تنفيذ.
- ضمن شريط أدوات ملف تعريف الكثافة ، انقر فوق تصدير إلى Excel لتصدير البيانات.
- تطبيع جميع نقاط البيانات إلى متوسط الشدة المقاسة من 7-8 دقائق (أي الحد الأدنى الأخير من أول محيط متوسط خط الأساس). يتم تعريف هذه القيم الطبيعية في كل نقطة زمنية على أنها كثافة cADDis النسبية. للحصول على جدول بيانات لتحليل بيانات التصوير وتسويتها، راجع الملف التكميلي 2.
- في شريط الأدوات ، انقر فوق قياس ملف تعريف الكثافة. تسليط الضوء على عائد الاستثمار لتحليله ؛ استخدم Shift + Click لتحديد عائد استثمار متعدد.
- قياس إفراز هرمون في كل جزء واستخراج الجزيرة. في هذه التجارب ، تم قياس تركيزات الأنسولين والجلوكاجون بواسطة ELISA. تطبيع إفراز الهرمون في كل جزء إلى حجم الجزيرة الكاذبة باستخدام قياسات IEQ المحددة في الخطوة 9.1 أو عن طريق محتوى هرمون الاستخراج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إنشاء الجزر الكاذبة البشرية المعبرة عن أجهزة الاستشعار الحيوية عن طريق توصيل الفيروسات الغدية للتركيبات التي تشفر cAMP biosensor cADDis (الشكل 1 أ). يوضح الشكل 1B إعادة تجميع الخلايا الجزيرية البشرية المتحولة بمرور الوقت ، مع ملاحظة الجزر الكاذبة كاملة التكوين بعد 6 أيام من الثقافة. بدأت الخلايا في إظهار مضان cADDis مرئي في غضون 48 ساعة ، وكان هناك تعبير عالي للمستشعر الحيوي في الخلايا المنقولة بحلول نهاية فترة الاستزراع. باستخدام هذا البروتوكول ، أظهرت الجزر الكاذبة متوسط كفاءة نقل بنسبة 60٪ في خلايا ألفا و 95٪ في خلايا بيتا (الشكل 1C-D).
يتم تسليط الضوء على منصة تصوير الموائع الدقيقة والخلايا الحية المتكاملة في الشكل 2. بعد حصاد الجزر الكاذبة التي تعبر عن cADDis والسماح لها بالاحتضان في وسط جديد طوال الليل ، تم تحميل الجزر الزائفة في وسط بئر مبلل مسبقا على رقاقة. ثم تم تثبيت الرقاقة في حامل ووضعها على مرحلة المجهر. داخل الغرفة البيئية المتصلة بالمجهر ، والتي تم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية ، تم دمج الجزر الكاذبة بوسائط تحتوي على إفرازات خلايا ألفا وبيتا ، والتي تم ضخها من خلال جهاز إزالة الفقاعات لمنع إدخال فقاعات الهواء في النظام. تم دمج الجزر الزائفة في الرقاقة الدقيقة بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / دقيقة ، وتم جمع النفايات السائلة على فترات 2 دقيقة عبر مجمع الكسر (الشكل 2A-B). يسمح الجزء السفلي الزجاجي لبئر الرقاقة الدقيقة بالتقاط شدة مضان cADDis للعديد من الجزر الزائفة في مجال الرؤية ، وهو أمر ضروري للتحليل اللاحق (الشكل 2C).
يوضح الشكل 3 النتائج التمثيلية باستخدام البروتوكول الموصوف مع الجزر الكاذبة المعبرة عن cADDis المتولدة من الجزر الأصلية المعزولة من ثلاثة متبرعين بشريين غير مصابين بالسكري. تم دمج الجزر الكاذبة المعبرة عن cADDis مع 2 mM الجلوكوز (G 2) ، 20 mM الجلوكوز بالإضافة إلى مثبط الفوسفوديستراز isobutylmethylxanthine (IBMX; G 20 + IBMX) ، و 2 mM الجلوكوز بالإضافة إلى الأدرينالين (G 2 + Epi). يستنبط هذا البروتوكول مسارات معروفة داخل الخلايا تعزز cAMP داخل خلايا ألفا وبيتا (الشكل 3A-B). يسهل إعداد microperifusion الجمع المتزامن لديناميكيات cAMP داخل الخلايا من خلال مضان cADDis وإفراز الهرمونات (الشكل 3C-E). لضمان الدقة التجريبية ، تم إجراء تجارب على الجزر الكاذبة من نفس المتبرع مع نسختين إلى ثلاث نسخ متماثلة ، وتم رسم القيم الإجمالية في الشكل 3C-E ، D '، E'. مع التعرض ل G 2 ، كانت شدة cADDis النسبية منخفضة ومستقرة ، وكذلك إفراز الأنسولين (الشكل 3C-D). عندما تعرضت الجزر الكاذبة ل G 20 + IBMX ، كانت هناك زيادة قوية في تركيز cAMP داخل الخلايا ، كما يتضح من زيادة كثافة cADDis النسبية (الشكل 3C). كانت هذه الزيادة على الأرجح بسبب كل من خلايا بيتا وألفا ، كما يتضح من الزيادات الملحوظة المصاحبة في كل من إفراز الأنسولين والجلوكاجون (الشكل 3D-E). أدى تعرض الجزر الكاذبة إلى G 2 + Epi إلى زيادة تركيز cAMP داخل الخلايا (الشكل 3C) ، وارتبط ذلك بزيادة إفراز الجلوكاجون (الشكل 3E). قد تكون الملاحظة القائلة بأن استجابة cAMP ل G 2 + Epi أصغر نسبيا مقارنة باستجابة IBMX قد حدثت بسبب مزيج من انخفاض كفاءة النقل لبنية cADDis adenoviral في خلايا ألفا مقابل خلايا بيتا (الشكل 1D) وخصوصية خلية ألفا لهذه الإشارة (الشكل 3E). لذلك ، استنادا إلى مسارات الإشارات المعروفة بوساطة cAMP في خلايا بيتا وألفا البشرية الأولية ، يوضح هذا البروتوكول بنجاح فائدة هذه المنصة المتكاملة لفحص كثافة التألق النسبية للمستشعر الحيوي cADDis وملامح إفراز هرمون خلايا بيتا وألفا في وقت واحد عبر النسخ المتماثلة التقنية والبيولوجية.
الشكل 1: تكوين الجزر الكاذبة البشرية المعبرة عن أجهزة الاستشعار الحيوية . (أ) رسم تخطيطي يوضح تفكك الجزر البشرية الأولية، والنقل باستخدام بنية المستشعر الحيوي في حالة الخلية الواحدة، وإعادة التجميع. بعد إعادة التجميع ، يتم حصاد الجزر الكاذبة وتخضع لتصوير متزامن للخلايا الحية و microperifusion. يشار إلى خطوات البروتوكول في جميع أنحاء التخطيطي. (ب) صور تمثيلية تلتقط تشكيل جزيرة زائفة تعبر عن cADDis خلال فترة إعادة تجميع مدتها 6 أيام ؛ أعلى: برايتفيلد مع تباين ، أسفل: مضان cADDis. شريط المقياس هو 100 ميكرومتر. (ج) صور تمثيلية لجزيرة كاذبة تعبر عن cADDis (خضراء) مع خلايا ألفا وبيتا مصورة بواسطة الببتيد C (CPEP ، الأزرق) والجلوكاجون (GCG ، الأحمر) ، على التوالي. تم استخدام DAPI (أبيض) كمضاد نووي. تبرز الأسهم البيضاء خلايا ألفا وبيتا المحولة. يشير السهم الأصفر إلى خلية ألفا غير محولة. شريط المقياس هو 100 ميكرومتر. (د) القياس الكمي لكفاءة النقل عند MOI 1,000 في خلايا بيتا وألفا بواسطة خوارزمية HALO الخلوية النووية (N = 2 متبرعين ، بمتوسط 601 خلية بيتا و 627 خلية ألفا تم تحليلها لكل متبرع عبر جزر كاذبة متعددة). تشير أشرطة الخطأ إلى الخطأ القياسي للمتوسط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نظام التصوير المتكامل للخلايا الحية والاندماج الدقيق. (أ) نظرة عامة على مكونات نظام التصوير بالخلايا الحية ونظام الانتشار الدقيق. يتم وضع الجزر الزائفة في رقاقة على مرحلة مجهر المسح بالليزر متحد البؤر المحاط داخل غرفة بيئية. يسمح هذا التكوين بالدقة الزمنية فيما يتعلق بالتغيرات داخل الخلايا في مضان المستشعر الحيوي أثناء الاستجابة الديناميكية لسلسلة من الإفرازات المحددة جيدا وجمع كسور perifusate الزائفة للقياس المتزامن لإفراز الهرمون لمزيد من التكامل مع أحداث الإشارات داخل الخلايا. (ب) مكونات منصة الموائع الدقيقة خارج الغرفة البيئية. اتجاه السائل هو كما يلي: (1) أنابيب تحتوي على إفرازات إلى (2) 0.01 في الأنابيب إلى (3) أنابيب مضخة تمعجية (0.02 في القطر الداخلي) إلى (4) 0.01 في الأنابيب إلى (5) إزالة الفقاعات إلى (6) مدخل رقاقة (0.01 في الأنابيب) إلى (7) حامل رقاقة / رقاقة دقيقة إلى (8) مخرج رقاقة (0.01 في الأنابيب). ملاحظة: يتم ربط الأنبوب 0.01 بوصة بأنبوب المضخة التمعجية بمحولات مخروطية (رؤوس أسهم بيضاء). يتم توصيل الأنبوب بمزيل الفقاعات عبر صمولة وحلقة (رأس سهم أخضر). يعرض الخط الأحمر المتقطع الاتصال بين المكونات. (ج) منظر عن قرب للرقاقة الدقيقة والحامل داخل الغرفة البيئية المثبتة على مرحلة المجهر متحد البؤر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الجزر الكاذبة في الإنسان وديناميكيات إفراز الهرمونات. أ: مخططات مضان cADDis الناجم عن الإفراز وإفراز الهرمونات في خلايا بيتا وألفا. في خلايا بيتا ، يربط الإبينفرين (Epi) مستقبلات ألفا2 الأدرينالية المقترنة ب Gi ، مما يؤدي إلى تثبيط سيكلاز الأدينيل (AC) ، وانخفاض cAMP ، وتقليل إفراز الأنسولين. في خلايا ألفا ، يحفز Epi مستقبلاتبيتا 1 الأدرينالية المقترنة ب G s ، مما يؤدي إلى تنشيط AC وزيادة في cAMP داخل الخلايا. في كلا النوعين من الخلايا ، يمنع IBMX ، وهو مثبط للفوسفوديستراز (PDE) ، تدهور cAMP داخل الخلايا ويعزز إفراز الهرمونات. يؤدي ارتباط cAMP الحر داخل الخلايا إلى حدوث تغييرات توافقية في بروتين cADDis ، مما يتسبب في زيادة شدة التألق. (B) صور تمثيلية للجزر الكاذبة المعبرة عن cADDis أثناء تصوير الخلايا الحية استجابة ل G 2 (2 mM glucose) و G 20 + IBMX (20 mM glucose + IBMX) و G 2 + Epi (2 mM glucose + Epi). تم تحديد الجزر الزائفة باللون الأبيض ، ويشار إلى نوع الإفراز في الزاوية العلوية اليسرى. شريط المقياس هو 50 ميكرومتر. (ج) متوسط مضان cADDis النسبي بمرور الوقت عبر الجزر الزائفة المعبرة عن cADDis المصنوعة من الجزر البشرية من ثلاثة مستحضرات متبرعة بالأعضاء. د: الإنسولين الكلي و(ه) إفراز الجلوكاجون استجابة للإفرازات المشار إليها. يتم تسوية البيانات إلى حجم الجزيرة ، معبرا عنها بمكافئات الجزر (IEQs). تم تحضير الجزر الكاذبة من ثلاثة متبرعين بشريين بالجزر وتحليلها باستخدام اثنين إلى ثلاثة مكررات تقنية / مانح. تم تحويل الخلايا الجزيرية باستخدام بنية cADDis adenoviral عند MOI 500 (N = 1) أو 1000 (N = 2). (D',E') محتوى هرمون الجزيرة الكاذبة. تشير أشرطة الخطأ إلى الخطأ القياسي للمتوسط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: الخصائص الديمغرافية للمانحين. ملخص المعلومات الديموغرافية للمانحين للجزر البشرية المستخدمة أثناء تحضير الجزر الكاذبة مع تعبير المستشعر الحيوي cADDis وتصوير الخلايا الحية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها. يتم تسليط الضوء على التحديات التي قد تتم مواجهتها ، بما في ذلك قائمة بالأسباب الشائعة للقضايا والحلول وتقنيات الوقاية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 3: بروتوكول microperifusion .مثال على بروتوكول microperifusion المستخدم للتجارب الموضحة في النتائج التمثيلية. هذا البروتوكول موجه بشكل خاص نحو التسجيل المشترك لإفراز cAMP داخل الخلايا وهرمون الجزيرة. قد تكون البروتوكولات البديلة أكثر ملاءمة اعتمادا على الجزيء داخل الخلايا محل الاهتمام و / أو ديناميكيات المستشعر الحيوي المختارة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الملف التكميلي 1: حساب مكافئات الجزر (IEQ). مثال على كيفية حساب IEQ للجزر الزائفة المستخدمة في كل تجربة. البيانات الواردة في الورقة 1 (1. Object Measurements) تتضمن بيانات الكائن المصدرة مباشرة من البرنامج (راجع الخطوة 9.1). يتم إدراج العمود الأخضر المميز لحساب عدد الجزر الزائفة التي تقع داخل كل فهرس في الخطوة 9.1.6.2. يتم نسخ الأعداد إلى الورقة 2 (2. حساب IEQ) وتحويلها إلى IEQ باستخدام عامل التحويل المناسب لكل مؤشر. يمكن حساب أي فقدان للجزيرة الزائفة أثناء تحميل الرقاقة (In-chip pseudoislet #) وقبل إزالة المستخلصات (الجزيرة الزائفة # بعد التشغيل) باستخدام الصور الملتقطة خلال هذه المراحل (انظر الخطوة 5.5 والخطوة 7.1.1 ، على التوالي). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: تحليل البيانات. مثال على كيفية حساب كثافة cADDis النسبية من البيانات التي تم الحصول عليها في الخطوة 9.2. يتم تصدير البيانات الأولية في الأعمدة D-F مباشرة من البرنامج. يتم تسوية القيم الأولية في كل نقطة زمنية إلى متوسط الشدة في الدقيقة الأخيرة من وسط خط الأساس (G 2 ؛ 7-8 دقائق في البروتوكول). يتم حساب متوسط الكثافة عبر جميع الجزر الكاذبة بمرور الوقت لإنشاء الرسم البياني في الشكل 2C. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يسمح دمج نظام microperifusion ، والجزر الكاذبة التي تعبر عن أجهزة الاستشعار الحيوية ، والفحص المجهري متحد البؤر بالمسح بالليزر بالتقييم المتزامن لأحداث الإشارات داخل الخلايا وملامح إفراز الهرمونات الديناميكية. يمكن لنظام microperifusion الديناميكي تقديم سلسلة من المحفزات المحددة جيدا إلى الجزر الكاذبة ويسمح بجمع النفايات السائلة ، حيث يمكن قياس تركيزات الأنسولين والجلوكاجون بواسطة ELISA المتاح تجاريا. في الوقت نفسه ، يلتقط تصوير الخلايا الحية للجزر الكاذبة التي تعبر عن المستشعر الحيوي بواسطة منصة مجهرية متحدة البؤر نشاط مضان المستشعر الحيوي في الوقت الفعلي ، والذي يوفر معلومات حول أحداث الإشارات داخل الخلايا. يوفر القياس المتزامن لإشارة المستشعر الحيوي وملف إفراز الهرمونات بمرور الوقت الفرصة لمقارنة تأثير أحداث الإشارات داخل الخلايا مباشرة على إفراز هرمون الجزيرة.
الاعتبارات المتعددة هي مفتاح نجاح البروتوكول المقدم. وتشمل هذه توليد الجزر الكاذبة التي تعبر عن أجهزة الاستشعار الحيوية واستخدام معدل تدفق ثابت خلال كل تجربة دون حركة الجزر الزائفة. بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / دقيقة ومع 2 دقيقة من جمع الكسر ، يكون حجم perifusate لكل كسر 200 ميكرولتر ويجب ألا يتقلب بأكثر من 10 ميكرولتر / كسر. بالإضافة إلى ذلك ، في حين أن برنامج التصوير يمكن أن يتكيف مع حركة الجزر الكاذبة الطفيفة في المستوى XY داخل مجال الرؤية ، لا يمكن تحليل الجزر الزائفة التي تتحرك خارج مجال الرؤية في سياق تجربة microperifusion. وبالتالي ، من المهم اكتشاف أي تسريبات وحركة في وقت مبكر أثناء التجربة بحيث يمكن إجراء محاولات لإصلاح المشكلة. ويرد في الجدول 2 ملخص للتحديات المحتملة وأسبابها المشتركة وحلولها ونصائح لمنع حدوثها. ومع ذلك ، يتضمن هذا البروتوكول فرصا متعددة لتوقع المشكلات ، مثل إجراء تجربة اختبار قبل تحميل الشريحة (الخطوة 2.3) ومراقبة الجزر الكاذبة لحركة كبيرة عبر المجهر خلال فترة الغسيل البالغة 30 دقيقة قبل الحصول على الصورة وجمع جزء microperifusion (الخطوات 6.4-6.5).
أحد القيود هو أن مجال الرؤية على منصة الفحص المجهري متحد البؤر الحالية لا يسمح بالتقاط جميع الجزر الكاذبة داخل الرقاقة في وقت واحد. في حين أن هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 30 جزيرة كاذبة للكشف بشكل موثوق عن الأنسولين والجلوكاجون في microperifusates ، يمكن تصوير مجموعة فرعية فقط بتكبير 20x. يؤدي تحميل الجزر الزائفة في وسط البئر إلى زيادة العدد الذي يمكن التقاطه في مجال الرؤية. بالإضافة إلى ذلك ، في حين أن الرقاقة مجهزة بثلاثة آبار ، فإن التكامل مع الفحص المجهري متحد البؤر يحد من القياسات إلى بئر واحد في كل مرة ، مما يعني أن النسخ المتماثلة التقنية يجب أن تتم في سلسلة وليس بالتوازي. علاوة على ذلك ، فإن هذا النهج الحالي يشترك في تسجيل مضان الجزيرة الزائفة بالكامل مع مخرجات إفرازية خاصة بخلايا ألفا وبيتا. ومع ذلك ، يمكن تعديل هذا لقياس التغيرات في الأحداث داخل الخلايا لخلايا ألفا أو بيتا مباشرة باستخدام الاستهداف الخاص بالخلية لأجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا. بينما تم تقييم إفراز الأنسولين والجلوكاجون فقط في هذا البروتوكول ، يمكن للدراسات المستقبلية أيضا قياس إفراز هرمونات الجزيرة الأخرى ، مثل إفراز السوماتوستاتين من خلايا دلتا. تجدر الإشارة إلى أنه في هذا الوقت ، لا يمكن اكتشاف السوماتوستاتين إلا باستخدام هذه المنصة استجابة للإفرازات شديدة التحفيز مثل IBMX. أخيرا ، تفتقر الجزر الصغيرة المعزولة والجزر الزائفة إلى البنية الوعائية العصبية للجزر في الجسم الحي ، والتي ثبت أنها تؤثر بشكل مباشر على وظيفة الجزيرة.
في الختام ، توفر المنصة الموصوفة استراتيجية لمزامنة تقييم أحداث الإشارات داخل الخلايا باستخدام المستشعر الحيوي وإفراز الهرمونات. يمكن تكييف هذا النظام بشكل أكبر لفحص الاضطرابات الوظيفية الناتجة عن تداخل الحمض النووي الريبي (siRNA أو shRNA) أو استراتيجيات استهداف الجينات بوساطة كريسبر. يمكن استخدام هذه الطرق لتحديد التأثيرات البيولوجية للمسارات ذات الأهمية على العديد من الأحداث داخل الخلايا أو خارج الخلية باستخدام أجهزة استشعار حيوية مشفرة وراثيا خارج cADDis ، كما تم توضيحه سابقا ل GCaMP6f7. بالإضافة إلى ذلك ، فإن النقل الانتقائي لنوع معين من الخلايا و / أو التعرض لمحفزات خاصة بالخلية سيسمح بالاستجواب المستهدف لأحداث الإشارات داخل الخلايا لنوع معين من الخلايا في سياق الجزيرة البشرية. على سبيل المثال ، يمكن تنقية خلايا ألفا في جزر البنكرياس البشرية باستخدام علامات سطح الخلية وتحويلها لاحقا باستخدام مستشعر الكالسيوم الحيوي المشفر وراثيا GCaMP الشائع الاستخدام لتقييم ديناميكيات الكالسيوم داخل الخلايا. يمكن بعد ذلك إعادة دمج هذه الخلايا المنقولة فيروسيا مع خلايا جزرية أخرى غير محولة لتشكيل جزر زائفة أو تركها لإعادة تجميعها من تلقاء نفسها لتوليد جزر كاذبة غنية بخلايا ألفا تشبه تركيبيا الجزر الصغيرة في مرض السكري من النوع 1. يختلف هذا النهج عن التقنيات التقليدية ، حيث يتم قياس الجزيئات داخل الخلايا مثل Ca 2+ باستخدام أصباغ حساسة Ca2+ محملة ويتم تحديد هوية الخلية بعد تصوير الخلايا الحية عن طريق التلوين المناعي أو وسائل أخرى15. بدلا من ذلك ، يتم إجراء القياسات في حالة الخلية الواحدة ، حيث يتم فقدان تأثير إشارات paracrine على وظيفة خلية الجزيرة15. وبالتالي ، فإن هذا التصوير بالخلايا الحية المتكامل مع نظام الجزر الزائفة ومنصة microperifusion يتغلب على التحديات السابقة في بيولوجيا الجزيرة مع توسيع المعرفة بالعمليات الخلوية المتكاملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يتم تقدير المتبرعين بالأعضاء وعائلاتهم لتبرعاتهم التي لا تقدر بثمن ، ويتم الاعتراف بالمعهد الدولي لمنظمات شراء الأعضاء ، وتقدم الطب (IIAM) والتبادل الوطني لأبحاث الأمراض (NDRI) لشراكتهم في جعل أنسجة البنكرياس البشرية متاحة للبحث. تم دعم هذا العمل من قبل شبكة أبحاث الجزر البشرية (RRID: SCR_014393) ، وبرنامج تحليل البنكرياس البشري (RRID: SCR_016202) ، DK106755 ، DK123716 ، DK123743 ، DK120456 ، DK104211 ، DK108120 ، DK112232 ، DK117147 ، DK112217 ، EY032442 ، و DK20593 (مركز فاندربيلت لأبحاث وتدريب مرض السكري) ، صندوق ليونا إم وهاري بي هيلمسلي الخيري ، JDRF ، وزارة شؤون المحاربين القدامى الأمريكية (BX000666) ، NIGMS من المعاهد الوطنية للصحة (T32GM007347) ، F30DK134041 ، F30DK118830 ، وزمالة أبحاث الدراسات العليا لمؤسسة العلوم الوطنية (1937963).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
| 0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
| 1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
| 10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
| 190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
| 200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
| Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
| Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
| Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
| P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
| Peristaltic pump | Instech | P720 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
| Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
References
- Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. The cell biology of systemic insulin function. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).
- Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alpha cells. Diabetologia. 62 (7), 1212-1224 (2019).
- Hughes, J. W., Ustione, A., Lavagnino, Z., Piston, D. W. Regulation of islet glucagon secretion: Beyond calcium. Diabetes, Obesity and Metabolism. 20, 127-136 (2018).
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Halban, P. A., et al. β-cell failure in type 2 diabetes: Postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (6), 1983-1992 (2014).
- Brissova, M., et al. α cell function and gene expression are compromised in type 1 diabetes. Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).
- Walker, J. T., et al. Integrated human pseudoislet system and microfluidic platform demonstrate differences in GPCR signaling in islet cells. JCI Insight. 5 (10), e06990 (2020).
- Giannoukakis, N., et al. Infection of intact human islets by a lentiviral vector. Gene Therapy. 6 (9), 1545-1551 (1999).
- Curran, M. A., et al. Efficient transduction of pancreatic islets by feline immunodeficiency virus vectors1. Transplantation. 74 (3), 299-306 (2002).
- Kayton, N. S., et al. Human islet preparations distributed for research exhibit a variety of insulin-secretory profiles. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (7), E592-E602 (2015).
- Cabrera, O., et al. high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function. Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2007).
- Lenguito, G., et al. Resealable, optically accessible, PDMS-free fluidic platform for ex vivo interrogation of pancreatic islets. Lab on a Chip. 17 (5), 772-781 (2017).
- Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New DAG and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. Journal of Biomolecular Screening. 21 (3), 298-305 (2015).
- Tengholm, A. Cyclic AMP dynamics in the pancreatic β-cell. Upsala Journal of Medical Sciences. 117 (4), 355-369 (2012).
- Klemen, M. S., Dolenšek, J., Rupnik, M. S., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).
