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Biology

Generación de podocitos derivados de pacientes a partir de biopsias de piel

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65364
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Nephrology and Hypertension, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander University (FAU) Erlangen-Nürnberg, 2Research Center on Rare Kidney Diseases (RECORD), University Hospital Erlangen

Summary

Este manuscrito describe un protocolo de dos pasos para generar podocitos específicos del paciente a partir de fibroblastos dérmicos a través de la reprogramación episomal en células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) y la posterior diferenciación en podocitos.

Abstract

Los podocitos son células epiteliales que se encuentran en el sitio urinario de la barrera de filtración glomerular que contribuyen a la función de filtro selectivo del glomérulo. Las mutaciones en genes específicos de podocitos pueden causar glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GFS), y los podocitos también se ven afectados en muchas otras nefropatías primarias y secundarias. Debido a su naturaleza diferenciada, los modelos de cultivo celular primario son limitados para los podocitos. Por lo tanto, comúnmente se utilizan células inmortalizadas condicionalmente. Sin embargo, estos podocitos inmortalizados condicionalmente (cipodocitos) tienen varias limitaciones: las células pueden desdiferenciarse en cultivo, especialmente cuando alcanzan la confluencia, y varios marcadores específicos de podocitos son solo ligeramente o no se expresan en absoluto. Esto pone en tela de juicio el uso de cipodocitos y su aplicabilidad para el alcance fisiológico, fisiopatológico y clínico. Aquí, describimos un protocolo para la generación de podocitos humanos, incluidos los podocitos específicos del paciente, a partir de una biopsia por punción cutánea mediante la reprogramación episomal de fibroblastos dérmicos en hiPSC y la posterior diferenciación en podocitos. Estos podocitos se parecen mucho mejor a los podocitos in vivo en términos de características morfológicas, como el desarrollo de procesos del pie y la expresión del marcador específico de podocitos. Finalmente, pero importante, estas células mantienen las mutaciones de los pacientes, lo que resulta en un modelo ex vivo mejorado para estudiar enfermedades de podocitos y posibles sustancias terapéuticas en un enfoque individualizado.

Introduction

Los podocitos son células epiteliales renales postmitóticas especializadas que forman la barrera de filtración glomerular del riñón junto con la membrana basal glomerular (GBM), las células endoteliales glomerulares y el glicocálix. Fenotípicamente, los podocitos consisten en un cuerpo celular y extensiones primarias de membrana impulsadas por microtúbulos, así como extensiones secundarias llamadas procesos del pie 1,2. La barrera de filtración glomerular que filtra la orina de la sangre está construida de endotelio fenestrado, GBM, y un tipo especializado de unión intercelular que conecta los procesos vecinos del pie de podocitos, llamado diafragma de hendidura de podoctyes3. En condiciones saludables, las proteínas más grandes que la albúmina son retenidas de la barrera de filtración debido a su tamaño y carga4.

Se sabe que las mutaciones en genes citoesqueléticos o específicos de podocitos, así como los factores circulantes que afectan las vías de señalización de los podocitos, inducen borramiento, desprendimiento o apoptosis de podocitos, lo que resulta en proteinuria y esclerosis glomerular. En particular, el reordenamiento citoesquelético, los cambios en la polaridad de los podocitos o el daño de los procesos del pie con una pérdida asociada de las uniones de hendidura son fundamentales5. Debido a su estado terminalmente diferenciado, los podocitos difícilmente pueden ser reemplazados después del desprendimiento del GBM. Sin embargo, si los podocitos están unidos al GBM, aún pueden recuperarse de la borración y reformar los procesos interdigitados del pie 6,7,8. Una mayor comprensión de los eventos que conducen al daño de los podocitos en diversos trastornos glomerulares puede proporcionar nuevos objetivos terapéuticos que ayudarán a desarrollar tratamientos para estas enfermedades. El daño de los podocitos es un sello distintivo de diferentes enfermedades glomerulares, incluyendo la glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GFS), la nefropatía diabética, la enfermedad de cambios mínimos y la glomerulonefropatía membranosa, que requieren modelos fiables de podocitos ex vivo para estudiar los mecanismos patológicos y los posibles enfoques de tratamiento para estas enfermedades 9,10. Los podocitos pueden ser estudiados ex vivo por cultivo celular primario clásico basado en el aislamiento de glomérulos por tamizado diferencial11. Sin embargo, debido al estado terminalmente diferenciado con capacidad de proliferación limitada, la mayoría de los investigadores utilizan líneas celulares de cipodocitos de ratón o humanos que expresan variantes sensibles a la temperatura del antígeno T grande SV40. Alternativamente, los cipodocitos se aíslan de ratones transgénicos que albergan el gen inmortalizador SV40 Tag 1,12.

Los cipodocitos proliferan a 33 °C, pero entran en detención del crecimiento y comienzan a diferenciarse a 37 °C13,14. Hay que tener en cuenta que los datos experimentales obtenidos con estas células deben interpretarse con cierta cautela, ya que las células se generan utilizando una inserción génica antinatural15. Como estas células albergan un gen inmortalizante, la fisiología celular se altera debido a la proliferación en curso12. Las líneas celulares de podocitos generadas por este enfoque han sido cuestionadas recientemente, ya que los cipodocitos de ratón, humanos y ratas expresan menos del 5% de sinaptopodina y nefrina a nivel de proteína, así como NPHS1 y NPHS2 a nivel de ARNm en comparación con la expresión glomerular16. Además, la mayoría de las líneas celulares de podocitos no expresan nefrina17,18. Chittiprol et al. también describieron una diferencia significativa en la motilidad celular y las respuestas a la puromicina y doxorrubicina en cipodocitos16. Los podocitos se pueden encontrar en la orina después del desprendimiento del GBM en diferentes enfermedades glomerulares 19,20,21,22. Los podocitos urinarios viables pueden cultivarse ex vivo hasta por 2-3 semanas, pero la mayoría de las células sufren apoptosis23,24. Curiosamente, los podocitos no sólo se encuentran en la orina de pacientes con enfermedad glomerular, sino también en la orina de sujetos sanos, muy probablemente cuando son senescentes de nuevo con un potencial limitado de replicación en cultivo24. Además, el número de podocitos derivados de la orina es limitado, y las células se desdiferencian en cultivo, muestran menos procesos del pie, cambian la morfología y, lo que es más importante, tienen una capacidad de proliferación limitada. La expresión de genes específicos de podocitos está ausente, desaparece en unas pocas semanas o varía entre estos clones celulares. Algunas células positivas para el marcador específico de podocitos co-expresaron el marcador de células epiteliales tubulares o miofibroblastos y células mesangiales, lo que sugiere desdiferenciación y/o transdiferenciación de los podocitos urinarios cultivados24,25.

Recientemente, se ha descrito la generación de líneas celulares de cipodocitos derivadas de la orina de pacientes y voluntarios sanos por transducción con un antígeno T grande SV40 termosensible y hTERT26. Se detectó la expresión de ARNm para sinaptopodina, nestina y proteína asociada a CD2, pero el ARNm de podocina estuvo ausente en todos los clones. Además de los problemas con los podocitos urinarios, estas células también contienen el gen inmortalizador insertado, lo que resulta en las desventajas discutidas anteriormente.

Por el contrario, las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) tienen una enorme capacidad para autorrenovarse y diferenciarse en múltiples tipos de células en condiciones adecuadas. Se ha demostrado antes que las hiPSCs pueden servir como una fuente casi ilimitada de podocitos27,28.

Aquí, se describe un protocolo de dos pasos para generar podocitos específicos del paciente a partir de fibroblastos dérmicos de biopsias de punción cutánea con posterior reprogramación episomal en hiPSC y una diferenciación final en podocitos derivados de hiPSC (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: Protocolo para generar podocitos derivados de hiPSC específicos del paciente. Resumen gráfico del protocolo para generar podocitos específicos del paciente a partir de fibroblastos dérmicos de una biopsia de piel mediante la reprogramación en hiPSCs y la diferenciación en podocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Como primer paso, los fibroblastos dérmicos somáticos se superaron a partir de una biopsia por punción cutánea y se reprogramaron en hiPSCs utilizando un método libre de integración por electroporación con plásmidos que expresan los factores de transcripción OCT3/4, KLF4, SOX2 y c-MYC 29,30,31. Las colonias hiPSC emergentes fueron posteriormente seleccionadas y expandidas. La diferenciación comenzó con la inducción del linaje mesodérmico mediante la activación de la vía de señalización WNT, seguida de la generación de células progenitoras de nefronas que aún podían proliferar. Finalmente, las células se diferenciaron en podocitos. En este procedimiento, modificamos y combinamos protocolos previamente publicados para la reprogramación episomal para la generación de hiPSCs por Bang et al.32 y Okita et al.33, así como un protocolo para la diferenciación de hiPSCs en podocitos por Musah et al.28,34,35.

De hecho, los podocitos generados por nuestro protocolo tenían un fenotipo más cercano a los podocitos in vivo, con respecto al desarrollo de una red distinta de procesos primarios y secundarios del pie y la expresión de marcadores específicos de podocitos, como sinaptopodina, podocina y nefrina. Con el uso de podocitos derivados de hiPSC, los antecedentes genéticos del paciente se mantienen durante la reprogramación y diferenciación. Esto permite el modelado de la enfermedad de los podocitos específicos del paciente y el descubrimiento de posibles sustancias terapéuticas ex vivo en un número de células casi ilimitado. Además, este protocolo es mínimamente invasivo, rentable, éticamente aceptable y puede facilitar nuevas vías para el desarrollo de fármacos.

Protocol

El protocolo fue aprobado por el comité de ética de la Universidad Friedrich-Alexander de Erlangen-Nuremberg (251_18B), y todos los pacientes y probandos dieron su consentimiento por escrito. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y reglamentos pertinentes. Para la composición de todos los medios y soluciones utilizados aquí, consulte la Tabla 1.

1. Crecimiento de fibroblastos dérmicos de una biopsia por punción cutánea

  1. Transfiera la biopsia por punción cutánea a un tubo cónico estéril de 15 ml con 10 ml de medio de fibroblastos precalentado.
  2. Retire el medio y lave la biopsia por punción cutánea tres veces con 5 ml de solución salina estéril precalentada 1x tamponada con fosfato (PBS). Transfiera la biopsia por punción cutánea con fórceps estériles a una placa de cultivo celular de 10 cm y córtela a lo ancho en tres o cuatro piezas con un bisturí estéril, dejando la epidermis y la dermis.
  3. Transfiera cada pieza a una placa estéril de cultivo celular de plástico de 35 mm y presiónela suavemente sobre la placa de cultivo. Retire el exceso de medio alrededor de las piezas de la biopsia. Dejar secar durante 5-10 minutos hasta que el líquido se evapore y la biopsia se adhiera al plástico de cultivo celular.
  4. Añadir 1 ml de medio de fibroblastos gota a gota con una pipeta de 1.000 μL alrededor de la biopsia y llenar cuidadosamente hasta un volumen final de 3 ml. Cultivar a 37 °C, 5%CO2 durante 7 días sin alimentar y mover el plato. Cambie cuidadosamente el medio a un medio de fibroblastos fresco y precalentado. Después de 7 días, los fibroblastos en forma de huso superados pueden ser monitoreados alrededor de la biopsia de piel usando un microscopio de contraste de fase36.
    NOTA: Cuando los fibroblastos superados alcancen el borde de la placa, proceda de nuevo desde el paso 1.3 para generar otro lote de fibroblastos.
  5. Para la expansión de los fibroblastos superados, lavar con 2 ml de PBS 1x precalentado, disociar los fibroblastos con 1 ml de 1x ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) e incubar durante 5 min a 37 °C, 5% deCO2. Transfiera las células desprendidas a un tubo cónico de 15 ml y lave la placa de cultivo celular con 2 ml de medio de fibroblastos fresco precalentado.
  6. Agrupar el medio de lavado en el tubo para neutralizar el agente de disociación y centrifugar a 200 x g durante 5 min a 20 °C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular con 1 ml de medio de fibroblastos fresco precalentado. Contar las células con una cámara Neubauer o un contador celular automatizado utilizando azul de tripano y sembrar 2,5 x 103 3 fibroblastos porcm2 en matraces de cultivo celular fresco.
  7. Vuelva a colocar los matraces en la incubadora y distribuya las células uniformemente moviendo los matraces tres veces en cada dirección. Al día siguiente, reemplace el medio con medio de fibroblastos fresco y precalentado. Cambiar el medio dos veces por semana y dividir cuando los fibroblastos alcancen alrededor del 80% de confluencia.

2. Congelación de fibroblastos dérmicos

  1. Para congelar los fibroblastos, lávelos con 5 ml de PBS precalentado. Aspirar el PBS y disociar los fibroblastos con 4 mL de 1x tripsina-EDTA. Volver a colocar el matraz en la incubadora e incubar durante 5-7 min a 37 °C al 5% deCO2. Controle el desprendimiento con un microscopio de contraste de fase y golpee contra el costado del matraz para desprender las células.
  2. Transfiera las células desprendidas a un tubo cónico de 15 ml. Lavar el matraz de cultivo celular con 5 ml de medio de fibroblastos fresco precalentado. Agrupar el medio de lavado en el tubo cónico y centrifugar a 200 x g durante 5 min a 20 °C.
  3. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular con 2 ml de medio de fibroblastos fresco precalentado. Cuente las células y transfiera 1 x 106 células a un nuevo tubo cónico. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 20 °C.
  4. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular con 1 ml de medio de congelación de fibroblastos fríos que consiste en 90% de suero fetal de ternera y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Transfiera a un criovial, colóquelo en un recipiente de congelación y congele durante la noche a -80 ° C. Para el almacenamiento a largo plazo, coloque el criovial en un tanque de nitrógeno líquido al día siguiente.

3. Reprogramación episomal de fibroblastos para generar hiPSCs

  1. Para la reprogramación episomal, use fibroblastos 1.5 x 106 desde el pasaje 4 hasta el 8. Para alcanzar este número celular, use de dos a tres matraces de 250 ml con una confluencia de alrededor del 70%.
  2. El día antes de la reprogramación, dividir los fibroblastos en una proporción de 1:2 para asegurar su estado proliferativo. Por lo tanto, aspirar el medio y lavar los matraces con 5 ml de PBS precalentado por matraz. Aspirar el PBS y disociar los fibroblastos con 4 mL de 1x tripsina-EDTA. Volver a colocar los matraces en la incubadora e incubar durante 5-7 min a 37 °C y 5% deCO2. Controle el desprendimiento con un microscopio de contraste de fase y golpee contra el costado del matraz para separar las células de la superficie plástica.
  3. Transfiera las células desprendidas a un tubo cónico de 50 ml y lave los matraces de cultivo celular con 5 ml de medio de fibroblastos fresco precalentado. Agrupar el medio de lavado en el tubo cónico y centrifugar a 200 x g durante 5 min a 20 °C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 6 ml de medio de fibroblastos fresco precalentado.
  4. Preparar seis nuevos matraces de cultivo celular añadiendo 5 ml de medio de fibroblastos fresco precalentado por matraz. Añadir 1 ml de suspensión de células fibroblásticas. Vuelva a colocar los matraces en la incubadora y distribuya las células uniformemente moviendo los matraces tres veces en cada dirección.
  5. Para la reprogramación episomal, cubra dos placas de cultivo celular de 10 cm adecuadas para el cultivo de hiPSC con 4 ml de solución de recubrimiento en frío por placa. Incubar las placas durante 1 h a 37 °C.
    NOTA: Para cultivar hiPSCs, se requieren diferentes plásticos de cultivo celular y recubrimiento adicional de matriz extracelular (ver Tabla de materiales).
  6. Retirar el medio de los fibroblastos y lavar con 10 ml de PBS precalentado por matraz. Aspirar el PBS y disociar los fibroblastos con 4 ml de 1x tripsina-EDTA por matraz incubando durante 5-7 min a 37 °C. Controle el desprendimiento con un microscopio de contraste de fase y, si es necesario, golpee contra el costado del matraz para separar las células de la superficie plástica.
  7. Transfiera las células desprendidas a un tubo cónico de 50 ml. Lave los matraces vacíos con 6 ml de medio de fibroblastos precalentado para recoger las células restantes y agruparlas en el tubo cónico. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 20 °C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 3 ml de 1x PBS fresco y precalentado.
  8. Contar las células y transferir 1,5 x 106 fibroblastos en un nuevo tubo cónico. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 20 °C. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 5 mL de medio de electroporación y centrifugar de nuevo. Mientras tanto, aspire la solución de recubrimiento de las placas de cultivo celular recubiertas de 10 cm y agregue 7 ml de medio de fibroblastos precalentado.
  9. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender el pellet de celda en medio de electroporación con una concentración de 1,5 x 106 células en 250 μL. Transfiera la suspensión de celda de 250 μL a una cubeta de electroporación con una distancia de espacio de 4 mm (ver Tabla de materiales).
  10. Preparar una mezcla de transfección de plásmidos añadiendo 4 μg de cada plásmido (pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK, pCXLE-hMLN) a un volumen total de 50 μL de medio de electroporación. Transfiera a la cubeta y mezcle moviendo suavemente. Electroporar con un pulso a 280 V.
  11. Cortar una punta de pipeta con tijeras estériles y transferir 125 μL de los fibroblastos electroporados a cada una de las placas de cultivo celular de 10 cm preparadas. Distribuya las células agitando las placas tres veces en todas las direcciones y colóquelas de nuevo en la incubadora. Incubar durante la noche a 37 °C con 5% deCO2 sin perturbaciones.
  12. Para eliminar las células muertas, reemplace el medio al día siguiente con 7 ml de medio de fibroblastos fresco precalentado. Cambie el medio a medio de cultivo hiPSC 2 días después de la electroporación y reemplácelo cada dos días durante los próximos 20 días.

4. Selección, expansión y control de calidad de las hiPSC generadas

  1. Monitoree las células diariamente durante al menos 20 días usando un microscopio de contraste de fase con un objetivo de 10x o 20x para observar la formación de colonias de hiPSC después de la electroporación. Si las colonias de hiPSC tienen un tamaño de alrededor de 300 μm de diámetro con bordes distintos y las hiPSC muestran una alta relación núcleo-cuerpo, las colonias de hiPSC están listas para la selección mediante selección (Figura 2B, C y Figura 3).
  2. Antes de la recolección, cubra una placa de 96 pocillos adecuada para el cultivo de hiPSC con 100 μL de solución de recubrimiento por pocillo e incube durante 1 h a 37 °C. Durante la incubación, marque las colonias de interés en el fondo de la placa de cultivo celular con un bolígrafo. Para la preparación final de la placa de 96 pocillos, retire la solución de recubrimiento y agregue 100 μL de medio de cultivo hiPSC precalentado que contenga 10 μM inhibidor de ROCK Y27632 a cada pocillo.
  3. Lave las células con 1x PBS precalentado y agregue un medio de cultivo hiPSC fresco y precalentado que contenga el inhibidor de ROCK de 10 μM Y27632 antes de recoger para eliminar las células muertas. Para elegir colonias hiPSC, use una aguja calibradora y divida las colonias hiPSC en trozos pequeños dibujando una cuadrícula en cada colonia.
  4. Usando un microscopio de contraste de fase, verifique que las colonias se dividan con éxito en pedazos. Transfiéralos con una pipeta de 100 μL a la placa de 96 pocillos preparada. Mantenga la pipeta en posición vertical sobre la colonia sin tocar las células para evitar arañazos y pérdida de la colonia.
  5. Coloque la placa de 96 pocillos en la incubadora a 37 °C con 5% deCO2 y deje que las células se adhieran durante la noche sin perturbaciones. Mantenga los platos con la mezcla de fibroblastos e hiPSC, en caso de que la recolección no tenga éxito. Por lo tanto, retire el inhibidor de ROCK Y27632 cambiando el medio a medio de cultivo hiPSC y vuelva a colocar las placas en la incubadora.
  6. Al día siguiente, cambie el medio de la placa de 96 pocillos a 200 μL de medio de cultivo hiPSC fresco y cámbielo cada dos días. Monitoree la placa de 96 pocillos al día siguiente y marque los pozos con clones seleccionados con éxito.
    NOTA: Si los clones de hiPSC seleccionados no están completamente seleccionados después del primer intento y los fibroblastos se pueden encontrar en el pozo, repita la recolección del pocillo 96 o raspe los fibroblastos de la placa.

5. Expansión de clones hiPSC seleccionados

  1. Monitoree los clones de hiPSC usando un microscopio de contraste de fase. Si las hiPSC seleccionadas alcanzan alrededor del 70% de confluencia, los clones hiPSC están listos para la expansión.
  2. Cubra una placa de 48 pocillos adecuada para el cultivo de hiPSC con 250 μL de solución de recubrimiento por pocillo durante 1 h a 37 °C. Sustituir la solución de recubrimiento por 200 μL de medio de cultivo hiPSC fresco y precalentado que contenga 10 μM inhibidor de ROCK Y27632.
  3. Para separar las hiPSC de la placa de 96 pocillos, raspe la superficie de plástico con una punta de pipeta de 1.000 μL. Transfiera las hiPSC separadas de la placa de 96 pocillos a una placa de 48 pocillos. Cambie el medio al día siguiente a un medio de cultivo hiPSC fresco y precalentado para eliminar las células muertas y el inhibidor de ROCK Y27632.
  4. Si los clones de hiPSC alcanzan alrededor del 70% de confluencia, transfiera las hiPSC a una placa de 24 pocillos. Por lo tanto, cubra una placa de 24 pocillos adecuada para el cultivo de hiPSC con 400 μL de solución de recubrimiento por pocillo durante 1 h a 37 °C. Sustituir la solución de recubrimiento por 400 μL de medio de cultivo hiPSC fresco y precalentado que contenga 10 μM inhibidor de ROCK Y27632. Aspirar el medio de los 48 pocillos y lavar con 500 μL de 1x PBS precalentado.
  5. Sustituir el PBS por 100 μL de solución de desprendimiento celular enzimático que contenga 10 μM inhibidor de ROCK Y27632 e incubar a 37 °C durante 4 min. Enjuague las hiPSC de la placa con una pipeta de 1.000 μL. Transfiera las células disociadas a un tubo cónico de 15 ml. Lave la placa vacía de 48 pocillos con medio de cultivo hiPSC que contenga 10 μM inhibidor de ROCK Y27632 y mezcle en el tubo cónico.
  6. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 20 °C. Aspirar el sobrenadante y resuspender las hiPSC en 1 ml de medio de cultivo hiPSC que contenga 10 μM inhibidor de ROCK Y27632 y transferir a una placa de 24 pocillos. Colocar la placa en la incubadora a 37 °C al 5% deCO2 y distribuir las células agitando la placa tres veces en todas las direcciones. Deje que las células se adhieran durante la noche sin perturbación.
  7. Al día siguiente, cambie el medio a medio de cultivo hiPSC sin inhibidor de ROCK Y27632.
    NOTA: Si los clones de hiPSC alcanzan alrededor del 70% de confluencia, transfiera las hiPSC a una placa de 12 pocillos repitiendo los pasos 5.4 a 5.7 con volúmenes aumentados adecuados para un formato de 12 pocillos. Si las hiPSC de la placa de 12 pocillos alcanzan alrededor del 70% de confluencia, transfiera los clones de hiPSC a una placa de 6 pocillos con volúmenes aumentados para un formato de 6 pocillos.

6. Congelación de clones hiPSC seleccionados

  1. Para congelar clones hiPSC seleccionados, aspire el medio desde una placa de 6 pocillos. Lave los pocillos con 2 ml de 1x PBS. Aspirar y disociar las hiPSCs con 1 mL de solución de desprendimiento de células enzimáticas que contenga 10 μM Y27632. Vuelva a colocar la placa en la incubadora e incubar durante 4 min a 37 °C y 5% deCO2.
  2. Enjuague las hiPSC de la placa con una pipeta de 1.000 μL y transfiera las células desprendidas a un tubo cónico de 15 ml. Lave el plato con 2 ml de medio de cultivo hiPSC fresco precalentado que contenga 10 μM inhibidor de ROCK Y27632. Piscina en el tubo cónico y centrífuga a 200 x g durante 5 min a 20 °C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular con 2 ml de medio de cultivo hiPSC fresco precalentado que contenga 10 μM inhibidor de ROCK Y27632.
  3. Cuente las células y transfiera 1 x 106 células a un nuevo tubo cónico. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 20 °C. Aspirar el sobrenadante, resuspender el pellet celular en 1 ml de medio de congelación hiPSC frío y sin suero, y congelar en un criovial usando un recipiente de congelación durante la noche a -80 °C. Para el almacenamiento a largo plazo, coloque el criovial en un tanque de nitrógeno líquido al día siguiente.

7. Control de calidad HiPSC

  1. Caracterización de la morfología de hiPSC
    1. Compruebe la morfología característica de hiPSC utilizando un microscopio de contraste de fase con un objetivo de 20x. Después de la reprogramación, la morfología celular cambia de fibroblastos largos en forma de huso a hiPSC pequeñas y redondas, presentando una alta relación núcleo-cuerpo que crece en colonias con bordes distintos (Figura 2C).
    2. Si las colonias de hiPSC crecen demasiado densas y se produce una diferenciación espontánea, raspe las partes diferenciadas de la placa con una punta de pipeta (Figura 3). Dado que las hiPSC tienen una alta tasa de proliferación, alimente los cultivos de hiPSC todos los días con un medio de alimentación de hiPSC fresco y precalentado.
  2. Caracterización de marcadores de pluripotencia mediante tinción por inmunofluorescencia
    1. Para comprobar el marcador de pluripotencia de las hiPSC generadas mediante tinción por inmunofluorescencia, coloque los cubreobjetos de plástico en una placa de 24 pocillos y cúbralos con 250 μL de solución de recubrimiento durante 1 h a 37 °C y 5% deCO2. Reemplace la solución de recubrimiento con 1 ml de medio de cultivo hiPSC precalentado que contenga 10 μM inhibidor de ROCK Y27632.
    2. Semilla 1.9 x 104 hiPSCs disociadas por 24-pocillos. Deje que las hiPSC se adhieran durante la noche a 37 °C y al 5% deCO2 sin perturbaciones. Consulte los pasos 5.4 a 5.6 para la disociación de las hiPSC. Reemplace el medio al día siguiente con medio de cultivo hiPSC sin inhibidor de ROCK Y27632.
    3. Para la tinción, lavar las células con 1 ml de PBS 1x precalentado y posteriormente fijar las hiPSC con paraformaldehído al 4% durante 10 min a temperatura ambiente. Lave las hiPSC fijas con 1x PBS y bloquee los sitios de unión inespecíficos con 200 μL de solución de preincubación por pocillo durante 1 h a temperatura ambiente. Diluir anticuerpos primarios Ki67 (1:300), OCT3/4 (1:200), SSEA4 (1:100) en diluyente de anticuerpos.
    4. Limpie una lámina de plástico con etanol al 70% y colóquela en una cámara de tinción llena con un depósito de agua. Coloque gotas de diluciones de anticuerpos primarios de 30 μL en la lámina. Colocar las muestras fijas boca abajo en la dilución e incubar durante la noche a 4 °C.
    5. Al día siguiente, lave las muestras tres veces con 1x PBS durante 5 min y coloque 30 μL de diluciones de anticuerpos secundarios (1:1.000) en puntos limpios de la lámina. Coloque las guías de la cubierta boca abajo en la dilución. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
    6. Después de la incubación, lavar tres veces con 1x PBS durante 5 min. Monte las muestras en portaobjetos de vidrio en el medio de montaje que contiene DAPI. Dejar secar durante la noche a temperatura ambiente y en la oscuridad y obtener imágenes de las muestras con un microscopio confocal (Figura 4).
  3. Exclusión de la contaminación por bacterias y micoplasmas
    1. Para excluir la contaminación bacteriana, transfiera 500 μL de hiPSCs disociadas a 5 mL de medio Luria-Bertani (LB) precalentado. Consulte los pasos 5.4 a 5.6 para la disociación de las hiPSC. Incubar durante la noche a 37 °C. Si el medio LB parece turbio, es probable que se haya producido contaminación bacteriana. Deseche las celdas.
    2. Para excluir la contaminación por micoplasma, recolecte el medio que no haya sido reemplazado durante 2 días de 6 pocillos con alrededor del 90% de hiPSC confluentes. Utilice la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para detectar la contaminación por micoplasma. Muchos kits comerciales de detección de micoplasma están disponibles para este propósito.

8. Diferenciación de hiPSCs en podocitos

  1. Preparación y almacenamiento de factores de crecimiento
    1. Para preparar una concentración madre de 10 mM Y27632, reconstituir 10 mg de Y27632 (peso molecular de 320,26 g/mol) en 3,12 ml de agua estéril. Almacenar 100 μL de alícuotas a -20 °C y diluir 1:1.000 en medio de cultivo celular hasta alcanzar una concentración final de 10 μM.
    2. Para preparar una concentración madre de 30 mM CHIR99021, reconstituir 5 mg de CHIR99021 (peso molecular de 465,34 g/mol) en 358,2 μL de DMSO estéril. Almacenar 50 μL de alícuotas a -20 °C y diluir 1:10.000 en medio de cultivo celular para alcanzar una concentración final de 3 μM.
    3. Para preparar una concentración madre de 100 μg/ml de activina A, reconstituir 100 μg de activina A en 1 ml de 1x PBS que contenga 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA). Almacenar 100 μL de alícuotas a -20 °C y diluir 1:2.000 en medio de cultivo celular hasta alcanzar una concentración final de 50 ng/ml.
    4. Para preparar una concentración madre de 100 μg/ml de proteína morfogénica ósea 7 (BMP7), reconstituir 100 μg de BMP7 en 1 ml de agua estéril que contenga 0,1% de BSA. Almacenar 100 μL de alícuotas a -20 °C y diluir 1:2.000 en medio de cultivo celular hasta alcanzar una concentración final de 50 ng/ml.
    5. Para preparar una concentración madre de 100 μg/ml de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), reconstituir 100 μg de VEGF en 1 ml de agua estéril. Almacenar 100 μL de alícuotas a -20 °C y diluir 1:4.000 en medio de cultivo celular hasta alcanzar una concentración final de 25 ng/ml.
    6. Para preparar una concentración madre de 10 mM de ácido transretinoico todo, reconstituir 10 mg de ácido transretinoico todo-trans en 3,33 ml de DMSO estéril. Almacenar 100 μL de alícuotas a -20 °C y diluir 1:100 en medio de cultivo celular para alcanzar una concentración final de 0,5 μM.
  2. Activación de la vía de señalización WNT para inducir el linaje del mesodermo
    1. Para la diferenciación de hiPSCs en podocitos derivados de hiPSC, recubra las placas o matraces de cultivo celular adecuados para el cultivo de hiPSC con solución de recubrimiento durante 1 h a 37 °C y 5% deCO2. El volumen total de la solución de recubrimiento es de 1 ml por placa de cultivo de 6 pocillos o 4 ml por placa de cultivo celular de 10 cm.
    2. Aspirar el medio y lavar las hiPSCs con 1x PBS precalentado. Aspirar el PBS y añadir una solución de desprendimiento celular enzimático que contenga 10 μM Y27632 a un volumen total de 1 ml por placa de cultivo de 6 pocillos o 4 ml por placa de cultivo celular de 10 cm.
    3. Vuelva a colocar la placa en la incubadora e incubar durante 4 min a 37 °C y 5% deCO2. Enjuague las hiPSC de la placa con una pipeta de 1.000 μL. Transfiera las células separadas a un tubo cónico.
    4. Lave la placa con un medio de cultivo hiPSC fresco y precalentado que contenga el inhibidor de ROCK Y27632 de 10 μM. Agrupe el medio de lavado en el tubo cónico para neutralizar el reactivo de disociación. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 20 °C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular con 2 ml de medio de cultivo hiPSC fresco precalentado que contenga 10 μM inhibidor de ROCK Y27632.
    5. Contar las células y sembrar 1 x 104 hiPSCs/cm2. Distribuya las células agitando tres veces en todas las direcciones. Deje que las hiPSC se adhieran durante la noche a 37 °C con un 5% deCO2 sin perturbaciones.
    6. Al día siguiente, reemplace el medio con 2 ml de medio de diferenciación de mesodermo precalentado que contenga 1x suplemento de B27, 1% de penicilina-estreptomicina, 3 μM CHIR99021, 50 ng / ml activina A y 10 μM inhibidor de ROCK Y27632.
  3. Diferenciación en células progenitoras de nefronas
    1. Después de 2 días, cambie el medio mesodermo a 2 ml de medio de diferenciación de progenitores de nefronas precalentado que contenga 1x suplemento de B27, 1% de penicilina-estreptomicina, 3 μM CHIR99021, 50 ng/ml de activina A y 50 ng/ml de BMP7 por placa de cultivo de 6 pocillos o 6 ml por placa de cultivo celular de 10 cm. Cambie el medio cada dos días durante los próximos 14 días.
      NOTA: Las células progenitoras de nefronas proliferan y pueden pasar y congelarse después de 7 días de diferenciación en el medio de expansión progenitora de nefronas.
    2. Para dividir las células progenitoras de nefronas, cubra los plásticos de cultivo celular adecuados para el cultivo de hiPSC con una solución de recubrimiento durante 1 h a 37 °C. Reemplace la solución de recubrimiento con medio de expansión progenitor de nefronas. Aspirar el medio y lavar las células con 1x PBS precalentado. Eliminar el PBS y disociar las células con 1x tripsina-EDTA.
    3. Incubar durante 5 min a 37 °C y 5% deCO2. Monitoree el desprendimiento de las células con un microscopio de contraste de fase. Si es necesario, golpee contra el costado del plástico para separar las celdas de la superficie. Enjuague las células de la placa y transfiéralas a un tubo cónico. Lavar el matraz o la placa vacíos con el mismo volumen de medio de expansión progenitor de nefronas precalentado que el reactivo de disociación.
    4. Agrupe el medio de lavado en el tubo cónico. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 20 °C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular con 2 ml de medio de expansión progenitor de nefronas fresco y precalentado. Contar las células y sembrar 1,5 x 104 células progenitoras de nefronas porcm2 para una mayor diferenciación.
      NOTA: Para congelar las células progenitoras de nefronas, resuspender 1 x 106 células en 1 ml de medio de criopreservación sin suero frío y transferirlo a un criovial. Congelar en un recipiente de congelación a -80 °C durante la noche y transferir a un tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
    5. Coloque las placas de nuevo en la incubadora y distribuya las células uniformemente mediante agitación tres veces en todas las direcciones. Cambie el medio al día siguiente a un medio fresco de diferenciación de progenitores de nefronas precalentadas. Reemplace el medio cada dos días hasta que las células se diferencien durante 14 días en el medio de diferenciación progenitora de nefronas.
  4. Diferenciación terminal en podocitos derivados de hiPSC
    1. Aspirar el medio y añadir 2 ml de medio de diferenciación de podocitos precalentado que contenga 1x suplemento de B27, 1% de penicilina-estreptomicina, 3 μM CHIR99021, 50 ng/ml activina A, 50 ng/ml BMP7, 25 ng/μL de VEGF y 0,5 μM de ácido totalmente transretinoico por placa de cultivo de 6 pocillos o 6 ml por placa de cultivo celular de 10 cm. Vuelva a colocar las placas en la incubadora a 37 °C y al 5% deCO2. Cambie el medio cada dos días durante 4 días con un medio de diferenciación de podocitos fresco y precalentado.
    2. Para mantener los podocitos hiPSC en cultivo después de la diferenciación, alimente las células dos veces por semana con medio de mantenimiento de podocitos que contenga 10% de suero fetal de ternera, 1% de penicilina-estreptomicina y 0,1% de insulina-transferrina-selenio.
      NOTA: Los podocitos hiPSC diferenciados terminales ya no proliferan. Sin embargo, es posible mantenerlos en cultivo celular hasta por 4 semanas.
  5. Descongelación y expansión de células progenitoras de nefronas congeladas
    1. Encubrir un nuevo matraz de plástico de cultivo celular adecuado para el cultivo de hiPSC con una solución de recubrimiento durante 1 h a 37 °C y un 5% deCO2. Reemplace la solución de recubrimiento con 5 ml de medio de expansión progenitor de nefrona.
    2. Preparar un tubo cónico de 15 ml con 7 ml de medio de expansión progenitor de nefronas precalentado. Descongelar las celdas congeladas a 37 °C en un baño maría sin movimiento durante aproximadamente 20 s. Saque el criovial del baño de agua cuando la mitad de las células se descongelen y quede algo de hielo.
    3. Rocíe el criovial con etanol al 70% y colóquelo en un gabinete de bioseguridad. Transfiera las células descongeladas al tubo cónico con el medio de expansión progenitor de nefronas precalentado. Use una pipeta de 1.000 μL y deje que las células corran por la pared del tubo muy lentamente.
    4. Lave el criovial vacío con 1 ml de medio de expansión progenitora de nefronas para recoger las células restantes y agruparlas en el tubo cónico. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 20 °C y resuspender el pellet celular en medio de expansión progenitor de nefronas fresco y precalentado.
    5. Transfiera las células descongeladas al matraz recubierto y cambie el medio al día siguiente a un medio de expansión progenitor de nefronas fresco y precalentado. Antes de una mayor diferenciación, deje que las células proliferen en el medio de expansión progenitora de nefronas cambiando el medio cada dos días, y proceda del paso 8.3.5.

9. Caracterización de podocitos derivados de hiPSC mediante tinción de inmunofluorescencia

  1. Para verificar los podocitos diferenciados para el marcador específico de podocitos mediante tinción de inmunofluorescencia, coloque los cubreobjetos de plástico en una placa de 24 pocillos y cubra con 250 μL de solución de recubrimiento durante 1 h a 37 °C y 5% de CO2. Reemplace la solución de recubrimiento con 1 ml de medio de expansión progenitor de nefronas precalentado. Semilla de 2,5 x 104 células progenitoras de nefronas disociadas por placa de 24 pocillos. Ver pasos 8.3.2 a 8.3.4 para la disociación de las células progenitoras de nefronas.
  2. Deje que las células se adhieran durante la noche a 37 ° C y 5% de CO2 sin perturbaciones. Reemplace el medio al día siguiente con medio de diferenciación progenitora de nefronas precalentado.
  3. Termine la diferenciación cambiando el medio cada dos días hasta que las células se diferencien durante un total de 14 días en el medio de diferenciación progenitora de nefronas y 5 días adicionales en el medio de diferenciación de podocitos.
  4. Después de la diferenciación final, lavar las células con 1 ml de PBS precalentado. Fijar los podocitos hiPSC con paraformaldehído al 4% durante 10 min a temperatura ambiente. Lavar las celdas fijas con 1x PBS y bloquear los sitios de unión inespecíficos con 200 μL de solución de preincubación por pocillo durante 1 h a temperatura ambiente.
  5. Diluir los anticuerpos primarios sinaptopodina (1:200), podocina (1:100) y nefrina (1:25) en diluyente de anticuerpos y colocar gotitas de dilución de anticuerpos primarios de 30 μL en una lámina de plástico limpia en una cámara de tinción que contenga un depósito de agua.
  6. Coloque los portaobjetos de cubierta con podocitos hiPSC fijos boca abajo en la dilución. Incubar durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, lavar tres veces con 1x PBS durante 5 min. Diluir los anticuerpos secundarios (1:1.000) en 1x PBS y colocar gotitas de 30 μL de dilución de anticuerpos secundarios en puntos limpios de la lámina. Coloque las guías de la cubierta boca abajo en la dilución.
  7. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación, lavar tres veces con 1x PBS durante 5 min. Monte las muestras en portaobjetos de vidrio en un medio de montaje que contenga DAPI. Dejar secar durante la noche a temperatura ambiente y en la oscuridad. Obtener imágenes de las muestras con un microscopio confocal.

Representative Results

Con este protocolo paso a paso que combina la reprogramación episomal y la diferenciación, es posible generar podocitos portadores de la mutación de un paciente en un gen relevante para los podocitos. Esto permite el análisis ex vivo de alteraciones de podocitos específicas de la enfermedad. Los antecedentes genéticos del paciente se conservan durante el protocolo durante todas las diferentes etapas celulares. Además, la limitación del número insuficiente de células de podocitos no proliferantes terminalmente diferenciados puede superarse mediante el uso de podocitos derivados de hiPSC. Aunque se necesitan varios meses hasta que los podocitos hiPSC se generan a partir de fibroblastos dérmicos superados a través de la reprogramación en hiPSC y la posterior diferenciación en podocitos, es posible congelar células en tres pasos diferentes del protocolo (Figura 2). La congelación es posible para fibroblastos, hiPSCs y células progenitoras de nefronas después de la diferenciación en medio de diferenciación progenitora de nefronas durante 7 días. Por lo tanto, es posible la generación de bancos de células funcionales y experimentos a gran escala.

Figure 2
Figura 2: Pasos individuales del protocolo a través de un microscopio de contraste de fase. (A) Fibroblastos dérmicos superados. (B) formación de colonias hiPSC después de la reprogramación. (C) Cultura hiPSC seleccionada. (D) Células del mesodermo después de 2 días de diferenciación. (E) Células progenitoras de nefronas después de 14 días de diferenciación en medio de diferenciación progenitora de nefronas. (F) Podocitos terminales diferenciados derivados de hiPSC. Las barras de escala representan 300 μm (A, B, D-F) y 150 μm (C). El copo de nieve resalta los posibles pasos de congelación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Como los podocitos derivados de hiPSC generados atraviesan un protocolo largo con cambios drásticos con respecto al tipo de célula y la morfología, la caracterización celular es obligatoria. La morfología celular, como el tamaño y la forma de la célula, así como el comportamiento de crecimiento, se pueden monitorear usando un microscopio de contraste de fase. Los fibroblastos presentan un fenotipo largo en forma de huso con un tamaño de 150 μm a 300 μm (Figura 2A). Después de la reprogramación, se producen colonias con hiPSCs pequeñas de 50 μm. Estas colonias muestran fronteras distintas e hiPSCs distinguidas con una alta relación núcleo-cuerpo y una mayor tasa de proliferación (Figura 2C). Dado que los podocitos son células terminalmente diferenciadas, la tasa de proliferación disminuye con la diferenciación progresiva, y la morfología celular cambia a podocitos grandes en forma de estrella de 300 μm con procesos prominentes del pie (Figura 2F).

La confluencia es un punto crítico del cultivo hiPSC, y la diferenciación espontánea puede aparecer cuando las colonias crecen demasiado densas (Figura 3). Estas colonias deben eliminarse antes de pasar raspando las partes afectadas de la placa de cultivo.

Figure 3
Figura 3: Ejemplos de hiPSCs de diferente calidad. Imágenes de contraste de fase de (A) colonias de hiPSC reprogramadas con éxito y (B) hiPSC seleccionadas, así como (C) diferenciación espontánea, (D,E) colonias no hiPSC y (F) un cultivo hiPSC demasiado denso. Las barras de escala representan 300 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los diferentes tipos celulares de este protocolo deben ser validados en cuanto a la expresión de un marcador específico. Después de la reprogramación, las hiPSCs recuperan la capacidad de pluripotencia y expresan marcadores de proliferación y pluripotencia como SSEA4, OCT3/4 y Ki67 (Figura 4)38,39,40. Se sabe que la reprogramación, así como el largo cultivo de hiPSCs y diferenciación, pueden conducir a un cariotipo anormal, o más bien inducir mutaciones41. Por lo tanto, los antecedentes genéticos de las células cultivadas deben ser monitoreados a lo largo del tiempo y en diferentes pasajes mediante banda g y secuenciación del exoma completo.

Figure 4
Figura 4: Caracterización de las hiPSCs generadas por tinción por inmunofluorescencia. Caracterización de hiPSCs generadas mediante tinción para (A) el marcador proliferativo Ki67, así como los marcadores de pluripotencia (B) OCT3/4 y (C) SSEA4. Las barras de escala representan 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Morfológicamente, los podocitos derivados de hiPSC aparecen en forma de estrella y expresan una red distinta de largos procesos primarios y secundarios del pie en comparación con los cipodocitos (Figura 5). Los podocitos derivados de HiPSC expresan proteínas marcadoras específicas de podocitos como sinaptopodina, nefrina y podocina (Figura 6A-C)42.

Figure 5
Figura 5: Morfología de los podocitos derivados de hiPSC en comparación con los cipodocitos. Comparación de podocitos derivados de (A,B) hiPSC de un donante sano con (C,D) ciPodocitos con respecto a la morfología celular y filopodios mediante el uso de un microscopio de contraste de fase (A,C) y un microscopio electrónico de barrido (B,D). Las barras de escala representan 150 μm (A,C) y 20 μm (B,D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Por lo tanto, la comparación de podocitos derivados de hiPSC no solo de donantes sanos, sino también de pacientes con mutaciones en genes específicos de podocitos, permite la caracterización individualizada de la mutación del paciente ex vivo.

Figure 6
Figura 6: Caracterización de un marcador específico de podocitos en podocitos y cipodocitos derivados de hiPSC. Comparación de podocitos derivados de hiPSC (A-C) de un donante sano con (D-F) ciPodocitos con respecto a las proteínas marcadoras específicas de podocitos sinaptopodina (A, D), nefrina (B, E) y podocina (C, F). Las barras de escala representan 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Composición de todos los medios de cultivo celular y soluciones utilizadas en el estudio. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discussion

Este protocolo basado en cultivo celular combina la reprogramación episomal de fibroblastos dérmicos humanos en hiPSC específicas del paciente y la posterior diferenciación en podocitos derivados de hiPSC. Esto nos permite estudiar las alteraciones relacionadas con mutaciones de los podocitos de pacientes con enfermedad glomerular genética con respecto a la lesión de los podocitos. El protocolo para reprogramar fibroblastos dérmicos con un método libre de integración por electroporación está adaptado del trabajo publicado de Bang et al.32 y Okita et al.33. El protocolo para diferenciar los podocitos de las hiPSCs está adaptado del protocolo publicado de Musah et al.28,34,35. Ya existen publicaciones disponibles que describen la generación de podocitos a partir de hiPSCs 27,34,35. Sin embargo, el protocolo proporcionado aquí está optimizado y es menos costoso con respecto a la diferenciación de hiPSC en podocitos. En comparación con el protocolo publicado de Musah et al., probamos este protocolo en diferentes reactivos de recubrimiento, como vitronectina, laminina seda-511 y matriz de membrana basal solubilizada. Las concentraciones de vitronectina y laminina seda-511 podrían reducirse a 2,5 μg/ml en lugar de 5 μg/ml 28,34,35. Además, fue posible disminuir las concentraciones de BMP7 y activina A, dos factores de crecimiento muy caros, en un 50%, de 100 ng / ml a 50 ng / ml.

Esto permite una diferenciación menos costosa. Las células progenitoras de nefronas desde el día 7 seguían proliferando, y la posibilidad de congelación se demostró antes. Expandimos estas células después de la descongelación y antes de la diferenciación final en medio básico que contiene el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y B27 durante varios días, disminuyendo aún más los costos. Además de los pasos de diferenciación, este protocolo describe el crecimiento de fibroblastos de biopsias de piel con la posterior generación de hiPSC específicas del paciente a través de la reprogramación episomal. La combinación de estos dos métodos permite la generación de podocitos específicos del paciente. Por lo tanto, aquí se proporciona un protocolo completo paso a paso para generar podocitos derivados de hiPSC específicos del paciente que no se describió antes con tanto detalle.

Como el protocolo general incluye varios tipos de células diferentes, es crucial caracterizar los tipos de células generadas en diferentes pasos. Las células están en cultivo durante un período prolongado de tiempo, por lo que el control de calidad debe realizarse en diferentes pasajes. Cuando se trabaja con hiPSCs, es necesaria la alimentación diaria, así como el comportamiento celular y el monitoreo de la morfología. La esterilidad de los medios de diferenciación debe garantizarse mediante la esterilización del filtro a través de un filtro de 0,2 μm. Todo el protocolo, desde la biopsia de piel hasta los podocitos derivados de hiPSC, lleva varios meses, pero es posible congelar las células en distintas etapas del proceso. Los fibroblastos, los clones de hiPSC seleccionados y las células progenitoras proliferativas de nefronas después de 7 días en el medio de diferenciación progenitora de nefronas se pueden congelar y se puede generar un banco de células funcional.

A pesar de que los podocitos sanos derivados de hiPSC desarrollan una red distinta de procesos primarios y secundarios del pie (Figura 5A, B) y expresan un marcador típico específico de podocitos (Figura 6A-C), los diafragmas característicos de hendidura, como se ve in vivo, son difíciles de imitar en los modelos clásicos de cultivo celular bidimensional. Además, la comunicación intercelular con otros tipos de células glomerulares no es posible en este entorno de monocultivo.

Debido a su estado terminal diferenciado y la falta de capacidad de proliferación, es difícil estudiar los podocitos ex vivo. Con la ayuda de la inmortalización condicional de podocitos primarios, es posible superar esta limitación mediante la inserción de un interruptor termosensible, lo que resulta en un modelo de cultivo celular donde las células proliferan a 33 °C y se diferencian a 37 °C13,14. A pesar de que estos cipodocitos tienen un alto potencial para la investigación de podocitos, existen limitaciones, como la falta de expresión del marcador, la morfología desdiferenciada y la falta de formación de procesos del pie15,16.

La diferenciación de podocitos de células somáticas derivadas de pacientes permite la generación y comparación de podocitos enfermos con células de control sanas ex vivo. Esto nos permite estudiar el daño de los podocitos debido a mutaciones en genes específicos de podocitos. Además, trabajar con hiPSCs tiene el potencial de crear modelos tridimensionales de enfermedades de cultivo celular, o más bien organoides43,44. El cocultivo de podocitos derivados de hiPSC con otras células glomerulares, como las células endoteliales glomerulares o las células mesangiales, podría conducir a nuevos conocimientos sobre la comunicación intercelular en la salud y la enfermedad glomerular.

Además, la caracterización y el tratamiento de los podocitos específicos del paciente se pueden realizar ex vivo en análisis de alto rendimiento. El enfoque individualizado abre la oportunidad de investigar nuevos objetivos terapéuticos para mutaciones específicas y realizar medicina individualizada en el futuro.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF) de la Universidad Friedrich-Alexander de Erlangen-Nürnberg con el número de subvención M4-IZKF-F009 otorgado a Janina Müller-Deile, y por Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) bajo el nombre de proyecto STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS, número de subvención 01GM2202D otorgado a Janina Müller-Deile. Agradecemos a Annalena Kraus por el apoyo en la toma de imágenes SEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm sterile filter Rotilab P668.1 for sterilization of differentiation medium
all-trans retinoic acid Stem Cell Technologies 72262 supplement for differentiation
B27 supplement (50 x), serum free Gibco 17504044 supplement for serum-free differentiation medium
BG iMatrix-511 Silk biogems RL511S additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture
Bovine serum albumin (BSA)  Roth 8076.4
CELLSTAR Filter Cap Cell Culture Flasks, T75, 250 mL Greiner bio-one 82050-856 cell culture plastics suitable for fibroblast culture
CHIR99021 (5 mg) Sigma-Aldrich 252917-06-9  supplement for differentiation
Corning Matrigel hESC qualified matrix  Corning 354277 additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture (solubilized basement membrane matrix)
countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10283 to count cells
countess II FL  Automated Cell Counter Invitrogen to count cells
cryoPure tubes, 2 ml, QuickSeal screw cap, white Sarstedt 72380 cryovials for freezing of cells
dimethyl sulfoxide (DMSO)  Roth A994.1 for fibroblast freezing medium
DMEM/F12 (1:1) (1 x) Gibco 11320074 basic medium for differentiation
DMEM/F12 + Glutamax Gibco 10565018 basic medium for fibroblast medium
EVOS M5000 Imaging System Thermo Fisher Scientific AMF5000 phase contrast microscope
fetal bovine serum premium, inactivated (FCS) PAN Biotech P301902 serum for fibroblast medium, fibroblast freezing medium and podocyte maintenance medium
fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm gap, 800 µL capacity, sterile Fisherbrand FB104 cuvette used for electroporation/episomal reprogramming of fibroblasts (4mm gap)
fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI Invitrogen 00-4959-52 mounting medium containing dapi
gauge needle (0.6 x 30 mm) BD Microlance3 300700 for separation of hiPSC colonies into small pieces
human Recombinant Activin A Protein 78001.1 Stem cell technologies supplement for differentiation
human recombinant bone morphogenetic protein 7 (BMP7) Peprotech 120-03P supplement for differentiation
human VEGF-165 Recombinant Protein Thermo Scientific PHC9394 supplement for differentiation
insulin-transferrin-selenium (ITS -G) (100 x) Gibco 41400045 supplement for podocyte maintenance medium
LB medium Roth X964.1 for sterility test of hiPSC culture
lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit Sigma Aldrich MP0035-1KT commercial mycoplasma detection kit
microscope slides Diagonal GmbH & Co.KG 21,102
microtube 1.5 mL  Sarstedt 72706400
mTeSR1 Complete Kit Stem Cell Technologies 85850 basic medium for serum-free hiPSC culture medium
nalgene freezing container Mr.Frosty Roth AC96.1  to ensure optimal freezing conditions
normal goat serum abcam ab 7481 for preincubation solution and antibody diluent
nunc 24 well plates Thermo Scientific 142485 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc 48 well plates  Thermo Scientific 152640 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc 6 well plates  Thermo Scientific 140685 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc EasYDish Dishes 100 mm Thermo Scientific 150466 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate Thermo Scientific 167008 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nutriFreez D10 Cryopreservation Medium Sartorius 05-713-1E  serum-free cryopreservation medium for cryopreservation of hiPSC and nephron progenitor cells
Opti-MEM Gibco 11058021 electroporation medium 
pCXLE-hMLN Addgene #27079 plasmid for episomal reprogramming
pCXLE-hOCT3/4 plasmid Addgene #27077 plasmid for episomal reprogramming
pCXLE-hSK plasmid Addgene #27078 plasmid for episomal reprogramming
penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich P4333-100ML to avoid bacterial contamination
plastic coverslips Sarstedt   83.1840.002 for immunofluorescent stainings of hiPSCs and hiPSC-derived podocytes
ROTI Histofix Roth P087.3 commercial paraformaldehyde (4 %) for fixation of cells
RPMI 1640 + L-Glutamine Gibco 21875034 basic medium for podocyte maintenance medium
staining chamber StainTray Black lid Roth HA51.1
stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco A1110501 enzymatic cell detachment solution used for dissociation of hiPSCs
sterile phosphate buffered saline (PBS) (1 x) Gibco 14190094 used for washing and coating
sterile water Roth T1432
syringe without needle 20 mL BD Plastipak 300629 to filter sterilize differentiation medium
TC dish 100 mm Sarstedt 8,33,902 sterile cell culture plastics used for cutting the skin biopsy and fibroblast culture
TC dish 35 mm Sarstedt 8,33,900 sterile cell culture plastics used for outgrowing fibroblasts from skin biopsy
triton X 100 Roth 3051.3 for preincubation solution 
trypan Blue Stain (0.4 %) for use with the Countess Automated Cell Counter Invitrogen T10282 to count cells
trypsin-EDTA (10 x)  Biowest X0930-100 dissociation reagent used for fibroblasts and nephron progenitor cells
tube 15 mL Greiner bio-one 188271-N
tube 50 mL Greiner bio-one 227261
vitronectin ACF Sartorius 05-754-0002 extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture
Y-27632 dihydrochloride (10 mg) Tocris 1254 to avoid apoptosis of hiPSCs during splitting
Primary antibodies
OCT4  Stem Cell Technologies 60093.1 pluripotency marker, dilution 1:200
SSEA-4 Stem Cell Technologies 60062FI.1 pluripotency marker, dilution 1:100
Ki67 Abcam ab15580 proliferation marker, dilution 1:300
synaptopodin Proteintech 21064-1-AP podocyte-specific marker, dilution 1:200
nephrin Progen GP-N2 podocyte-specific marker, dilution 1:25
podocin proteintech 20384-1-AP podocyte-specific marker, dilution 1:100
Secondary antibodies
goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21435 secondary anditbody, dilution 1:1000
alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, highly cross-adsorbed Invitrogen A31634 secondary anditbody, dilution 1:1000
donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A21206 secondary anditbody, dilution 1:1000
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21422 secondary anditbody, dilution 1:1000
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 secondary anditbody, dilution 1:1000

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References

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Biología Número 195
Generación de podocitos derivados de pacientes a partir de biopsias de piel
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Rose, V., Müller-Deile, J.… More

Rose, V., Müller-Deile, J. Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies. J. Vis. Exp. (195), e65364, doi:10.3791/65364 (2023).

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