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Biology

त्वचा बायोप्सी से रोगी-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स की पीढ़ी

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65364
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Nephrology and Hypertension, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander University (FAU) Erlangen-Nürnberg, 2Research Center on Rare Kidney Diseases (RECORD), University Hospital Erlangen

Summary

यह पांडुलिपि मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (एचआईपीएससी) में एपिसोमल रीप्रोग्रामिंग के माध्यम से त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट से रोगी-विशिष्ट पोडोसाइट्स उत्पन्न करने और पोडोसाइट्स में बाद में भेदभाव करने के लिए दो-चरणीय प्रोटोकॉल का वर्णन करती है।

Abstract

पोडोसाइट्स ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा के मूत्र स्थल पर बैठे उपकला कोशिकाएं हैं जो ग्लोमेरुलस के चयनात्मक फ़िल्टर फ़ंक्शन में योगदान करती हैं। पोडोसाइट्स-विशिष्ट जीन में उत्परिवर्तन फोकल सेगमेंट ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस (एफएसजीएस) का कारण बन सकता है, और पोडोसाइट्स कई अन्य प्राथमिक और माध्यमिक नेफ्रोपैथी में भी प्रभावित होते हैं। उनकी विभेदित प्रकृति के कारण, प्राथमिक सेल कल्चर मॉडल पोडोसाइट्स के लिए सीमित हैं। इसलिए, आमतौर पर सशर्त रूप से अमर कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है। हालांकि, इन सशर्त रूप से अमर पोडोसाइट्स (सिपोडोसाइट्स) की कई सीमाएं हैं: कोशिकाएं संस्कृति में अंतर कर सकती हैं, खासकर जब वे सामंजस्य तक पहुंचती हैं, और कई पोडोसाइट्स-विशिष्ट मार्कर या तो केवल थोड़ा या बिल्कुल भी व्यक्त नहीं होते हैं। यह शारीरिक, पैथोफिजियोलॉजिकल और नैदानिक पहुंच के लिए सिपोडोसाइट्स के उपयोग और उनकी प्रयोज्यता को सवाल में लाता है। यहां, हम मानव पोडोसाइट्स की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं- जिसमें रोगी-विशिष्ट पोडोसाइट्स शामिल हैं- त्वचा पंच बायोप्सी से त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट के एपिसोमल रीप्रोग्रामिंग द्वारा एचआईपीएससी में और बाद में पोडोसाइट्स में विभेदन। ये पोडोसाइट्स विवो पोडोसाइट्स में रूपात्मक विशेषताओं के मामले में बहुत बेहतर दिखते हैं, जैसे पैर प्रक्रियाओं का विकास और पोडोसाइट्स-विशिष्ट मार्कर की अभिव्यक्ति। अंत में, फिर भी महत्वपूर्ण रूप से, ये कोशिकाएं रोगियों के उत्परिवर्तन को बनाए रखती हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक व्यक्तिगत दृष्टिकोण में पोडोसाइट्स रोगों और संभावित चिकित्सीय पदार्थों का अध्ययन करने के लिए एक बेहतर पूर्व विवो मॉडल होता है।

Introduction

पोडोसाइट्स विशेष, पोस्ट-माइटोटिक रीनल एपिथेलियल कोशिकाएं हैं जो ग्लोमेरुलर बेसमेंट झिल्ली (जीबीएम), ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं और ग्लाइकोकैलिक्स के साथ गुर्दे के ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा का निर्माण करती हैं। फेनोटाइपिक रूप से, पोडोसाइट्स में एक कोशिका शरीर और प्राथमिक, सूक्ष्मनलिका-संचालित झिल्ली एक्सटेंशन होते हैं, साथ ही द्वितीयक एक्सटेंशन होते हैं जिन्हें पैर प्रक्रिया 1,2 कहा जाता है। ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा जो रक्त से मूत्र को फ़िल्टर करती है, फेनेस्टेड एंडोथेलियम, जीबीएम और एक विशेष प्रकार के इंटरसेलुलर जंक्शन से बनी होती है जो पड़ोसी पोडोसाइट्स पैर प्रक्रियाओं को जोड़ती है, जिसे पोडोक्टीज3 का स्लिट डायाफ्राम कहा जाता है। स्वस्थ परिस्थितियों में, एल्ब्यूमिन से बड़े प्रोटीन को उनके आकार और चार्ज4 के कारण निस्पंदन बाधा से बरकरार रखा जाता है।

साइटोस्केलेटल- या पोडोसाइट-विशिष्ट जीन में उत्परिवर्तन, साथ ही पोडोसाइट्स सिग्नलिंग मार्गों को प्रभावित करने वाले परिसंचारी कारक, पोडोसाइट्स प्रभाव, अलगाव या एपोप्टोसिस को प्रेरित करने के लिए जाने जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीनमेह और ग्लोमेरुलर स्केलेरोसिस होता है। विशेष रूप से, साइटोस्केलेटल पुनर्व्यवस्था, पोडोसाइट्स ध्रुवीयता में परिवर्तन या स्लिट जंक्शनों के संबंधित नुकसान के साथ पैर की प्रक्रियाओं की क्षति निर्णायकहैं। उनकी टर्मिनल विभेदित स्थिति के कारण, जीबीएम की टुकड़ी के बाद पोडोसाइट्स को शायद ही बदला जा सकता है। हालांकि, अगर पोडोसाइट्स जीबीएम से जुड़े होते हैं, तो वे अभी भी प्रभाव से उबर सकते हैं और पैर प्रक्रियाओंको 6,7,8 में सुधार कर सकते हैं। विभिन्न ग्लोमेरुलर विकारों में पोडोसाइट्स क्षति का कारण बनने वाली घटनाओं की आगे की समझ नए चिकित्सीय लक्ष्य प्रदान कर सकती है जो इन बीमारियों के लिए उपचार विकसित करने में सहायता करेंगे। पोडोसाइट्स क्षति विभिन्न ग्लोमेरुलर रोगों की एक पहचान है, जिसमें फोकल सेगमेंट ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस (एफएसजीएस), डायबिटिक नेफ्रोपैथी, न्यूनतम परिवर्तन रोग, और झिल्लीदार ग्लोमेरुलोनेफ्रोपैथी शामिल हैं, जिन्हेंइन बीमारियों के लिए पैथोलॉजिकल तंत्र और संभावित उपचार दृष्टिकोण का अध्ययन करने के लिए विश्वसनीय पोडोसाइट्स एक्स विवो मॉडल की आवश्यकता होती है। ग्लोमेरुली के अलगाव के आधार पर शास्त्रीय प्राथमिक कोशिका संस्कृति द्वारा पोडोसाइट्स का अध्ययन किया जा सकताहै। हालांकि, सीमित प्रसार क्षमता के साथ टर्मिनल रूप से विभेदित स्थिति के कारण, अधिकांश शोधकर्ता माउस या मानव सिपोडोसाइट्स सेल लाइनों का उपयोग करते हैं जो एसवी 40 बड़े टी एंटीजन के तापमान-संवेदनशील वेरिएंट को व्यक्त करते हैं। वैकल्पिक रूप से, सिपोडोसाइट्स को ट्रांसजेनिक चूहों से अलग किया जाता है जो एसवी 40 टैग अमर जीन 1,12 को परेशान करते हैं।

सिपोडोसाइट्स 33 डिग्री सेल्सियस पर प्रसार करते हैं, लेकिन विकास गिरफ्तारी में प्रवेश करते हैं और 37 डिग्री सेल्सियस13,14 पर अंतर करना शुरू करते हैं। यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि इन कोशिकाओं के साथ प्राप्त प्रयोगात्मक डेटा की व्याख्या कुछ सावधानी के साथ की जानी चाहिए, क्योंकि कोशिकाएं अप्राकृतिक जीन सम्मिलन15 का उपयोग करके उत्पन्न होती हैं। चूंकि ये कोशिकाएं एक अमर जीन को आश्रय देती हैं, इसलिए चल रहे प्रसार12 के कारण सेलुलर फिजियोलॉजी बदल जाती है। इस दृष्टिकोण द्वारा उत्पन्न पोडोसाइट्स सेल लाइनों पर हाल ही में सवाल उठाया गया है, क्योंकि माउस, मानव और चूहा सिपोडोसाइट्स प्रोटीन स्तर पर 5% से कम सिनैप्टोपोडिन और नेफ्रिन व्यक्त करते हैं, साथ ही ग्लोमेरुलर अभिव्यक्ति16 की तुलना में एमआरएनए स्तर पर एनपीएचएस 1 और एनपीएचएस 2। इसके अलावा, अधिकांश पोडोसाइट्स सेल लाइनें नेफ्रिन17,18 को व्यक्त नहीं करती हैं। चिट्टीप्रोल एट अल ने कोशिका गतिशीलता और सिपोडोसाइट्स16 में प्यूरोमाइसिन और डॉक्सोर्यूबिसिन की प्रतिक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण अंतर का भी वर्णन किया। पोडोसाइट्स विभिन्न ग्लोमेरुलर रोगों19,20,21,22 में जीबीएम से अलगाव के बाद मूत्र में पाए जा सकते हैं। व्यवहार्य मूत्र पोडोसाइट्स की खेती 2-3 सप्ताह तक की जा सकती है, लेकिन अधिकांश कोशिकाएं एपोप्टोसिस23,24 से गुजरती हैं। दिलचस्प बात यह है कि पोडोसाइट्स न केवल ग्लोमेरुलर रोग वाले रोगियों के मूत्र में पाए जाते हैं, बल्कि स्वस्थ लोगों के मूत्र में भी पाए जाते हैं, सबसे अधिक संभावना है जबवे संस्कृति में प्रतिकृति की सीमित क्षमता के साथ फिर से संवेदनशील होते हैं। इसके अलावा, मूत्र-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स संख्या सीमित है, और कोशिकाएं संस्कृति में अंतर करती हैं, कम पैर प्रक्रियाएं दिखाती हैं, आकृति विज्ञान बदलती हैं, और सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि सीमित प्रसार क्षमता है। पोडोसाइट्स-विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति अनुपस्थित है, कुछ हफ्तों के भीतर गायब हो जाती है, या इन सेल क्लोनों के बीच भिन्न होती है। पोडोसाइट्स-विशिष्ट मार्कर के लिए सकारात्मक कुछ कोशिकाओं ने ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं या मायोफाइब्रोब्लास्ट और मेसांगियल कोशिकाओं के मार्कर को सह-व्यक्त किया, जो सुसंस्कृत मूत्र पोडोसाइट्स24,25 के डिडिफरेंटेशन और / या ट्रांसडिफरेंटेशन का सुझाव देता है।

हाल ही में, थर्मो-संवेदनशील एसवी 40 बड़े टी एंटीजन और एचटीआरटी के साथ पारगमन द्वारा रोगियों और स्वस्थ स्वयंसेवकों के मूत्र से प्राप्त सिपोडोसाइट्स सेल लाइनों की पीढ़ीका वर्णन किया गया है। सिनैप्टोपोडिन, नेस्टिन, और सीडी 2 से जुड़े प्रोटीन के लिए एमआरएनए अभिव्यक्ति का पता लगाया गया था, लेकिन सभी क्लोनों में पोडोसिन एमआरएनए अनुपस्थित था। मूत्र पोडोसाइट्स के साथ समस्याओं के अलावा, इन कोशिकाओं में सम्मिलित अमर जीन भी होता है, जिसके परिणामस्वरूप ऊपर चर्चा की गई हानि होती है।

इसके विपरीत, मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (HIPSC) में उपयुक्त परिस्थितियों में कई सेल प्रकारों में आत्म-नवीनीकरण और अंतर करने की एक बड़ी क्षमता होती है। यह पहले दिखाया गया है कि HIPSC पोडोसाइट्स27,28 के लगभग असीमित स्रोत के रूप में काम कर सकते हैं।

यहां, त्वचा पंच बायोप्सी के त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट से रोगी-विशिष्ट पोडोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए एक दो-चरण यी प्रोटोकॉल बाद में एपिसोमल रीप्रोग्रामिंग के साथ एचआईपीएससी में और एचआईपीएससी-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स में अंतिम भेदभाव का वर्णन किया गया है (चित्रा 1)।

Figure 1
चित्रा 1: रोगी-विशिष्ट हाईपीएससी-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल। "एचआईपीएससी में पुन: प्रोग्रामिंग और पोडोसाइट्स में भेदभाव करके त्वचा बायोप्सी के त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट से रोगी-विशिष्ट पोडोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल का ग्राफिकल अवलोकन"। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पहले चरण के रूप में, दैहिक त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट ्स को त्वचा पंच बायोप्सी से बाहर निकाला गया और प्रतिलेखन कारकों OCT3/4, KLF4, SOX2 और c-MYC 29,30,31 को व्यक्त करने वाले प्लास्मिड के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा एकीकरण-मुक्त विधि का उपयोग करके HIPSC में पुन: प्रोग्राम किया गया। बाद में उत्पन्न होने वाली एचआईपीएस कॉलोनियों का चयन और विस्तार किया गया। डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्ग के सक्रियण द्वारा मेसोडर्मल वंश के प्रेरण के साथ भेदभाव शुरू हुआ, इसके बाद नेफ्रॉन पूर्वज कोशिकाओं की पीढ़ी हुई जो अभी भी प्रसार करने में सक्षम थे। अंत में, कोशिकाओं को पोडोसाइट्स में विभेदित किया गया था। इस प्रक्रिया में, हमने बैंग एट अल.32 और ओकिता एट अल.33 द्वारा एचपीएससी की पीढ़ी के लिए एपिसोमल रीप्रोग्रामिंग के लिए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल को संशोधित और संयोजित किया, साथ ही मुसाह एट अल.28,34,35 द्वारा पोडोसाइट्स में एचपीएससी के भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल।

दरअसल, हमारे प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न पोडोसाइट्स में विवो में पोडोसाइट्स के करीब एक फेनोटाइप था, प्राथमिक और माध्यमिक पैर प्रक्रियाओं के एक अलग नेटवर्क के विकास और पोडोसाइट्स-विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति के बारे में, जैसे सिनैप्टोपोडिन, पोडोसिन और नेफ्रिन। एचआईपीएस-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स के उपयोग के साथ, रोगी की आनुवंशिक पृष्ठभूमि को रीप्रोग्रामिंग और भेदभाव के दौरान बनाए रखा जाता है। यह रोगी-विशिष्ट पोडोसाइट्स रोग मॉडलिंग और लगभग असीमित सेल संख्या में संभावित चिकित्सीय पदार्थों की खोज को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल न्यूनतम आक्रामक, लागत-कुशल, नैतिक रूप से स्वीकार्य है और दवा के विकास के लिए नए रास्ते की सुविधा प्रदान कर सकता है।

Protocol

प्रोटोकॉल को फ्रेडरिक-अलेक्जेंडर विश्वविद्यालय एर्लांगेन-नूर्नबर्ग (251_18B) की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, और सभी रोगियों और प्रोबैंड ने लिखित सहमति दी थी। सभी प्रयोग प्रासंगिक दिशानिर्देशों और नियमों के अनुसार किए गए थे। यहां उपयोग किए जाने वाले सभी मीडिया और समाधानों की संरचना के लिए तालिका 1 देखें।

1. त्वचा पंच बायोप्सी से त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट ्स का आउटग्रोथ

  1. त्वचा पंच बायोप्सी को 10 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड फाइब्रोब्लास्ट माध्यम के साथ एक बाँझ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. माध्यम को हटा दें और त्वचा पंच बायोप्सी को 5 मिलीलीटर बाँझ, पहले से गर्म 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ तीन बार धोएं। बाँझ बल के साथ त्वचा पंच बायोप्सी को 10 सेमी सेल कल्चर प्लेट में स्थानांतरित करें और एपिडर्मिस और डर्मिस को छोड़ते हुए इसे बाँझ स्केलपेल के साथ तीन या चार टुकड़ों में चौड़ाई में काट लें।
  3. प्रत्येक टुकड़े को एक बाँझ 35 मिमी प्लास्टिक सेल कल्चर डिश में स्थानांतरित करें और इसे संस्कृति पकवान में धीरे से दबाएं। बायोप्सी के टुकड़ों के आसपास अतिरिक्त माध्यम को हटा दें। 5-10 मिनट के लिए सूखने दें जब तक कि तरल वाष्पित न हो जाए और बायोप्सी सेल कल्चर प्लास्टिक से जुड़ी हो।
  4. बायोप्सी के चारों ओर 1,000 μL पिपेट के साथ 1 मिलीलीटर फाइब्रोब्लास्ट मीडियम ड्रॉपवाइज जोड़ें और 3 एमएल की अंतिम मात्रा तक सावधानीपूर्वक भरें। पकवान को खिलाए और स्थानांतरित किए बिना 7 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर खेती करें। सावधानीपूर्वक माध्यम को ताजा, गर्म फाइब्रोब्लास्ट माध्यम में बदलें। 7 दिनों के बाद, एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप36 का उपयोग करके त्वचा बायोप्सी के चारों ओर आउटग्रोन स्पिंडल जैसी फाइब्रोब्लास्ट की निगरानी की जा सकती है।
    नोट: जब आउटग्रोन फाइब्रोब्लास्ट डिश के रिम तक पहुंचते हैं, तो फाइब्रोब्लास्ट का एक और बैच उत्पन्न करने के लिए चरण 1.3 से फिर से आगे बढ़ें।
  5. आउटग्रोन फाइब्रोब्लास्ट्स के विस्तार के लिए, प्रीवार्म्ड 1x पीबीएस के 2 मिलीलीटर से धोएं, फाइब्रोब्लास्ट को 1 एमएल 1 x ट्रिप्सिन-एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) के साथ अलग करें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। अलग की गई कोशिकाओं को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और सेल कल्चर डिश को 2 एमएल ताजा, प्रीवार्म्ड फाइब्रोब्लास्ट माध्यम से धो लें।
  6. पृथक्करण एजेंट को बेअसर करने के लिए ट्यूब में धोने के माध्यम को पूल करें और 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और 1 मिलीलीटर ताजा, पहले से गर्म फाइब्रोब्लास्ट माध्यम के साथ सेल गोली को फिर से निलंबित करें। ताजा सेल कल्चर फ्लास्क में ट्राइपैन ब्लू और बीज 2.5 x 10 3से 5 x 103 फाइब्रोब्लास्ट प्रति सेमी2 का उपयोग करके न्यूबॉयर चैंबर या स्वचालित सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की गणना करें।
  7. फ्लास्क को वापस इनक्यूबेटर में रखें और फ्लास्क को प्रत्येक दिशा में तीन बार ले जाकर कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करें। अगले दिन, माध्यम को ताजा, गर्म फाइब्रोब्लास्ट माध्यम से बदलें। सप्ताह में दो बार माध्यम बदलें और विभाजित करें जब फाइब्रोब्लास्ट लगभग 80% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाएं।

2. ठंड त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट

  1. फाइब्रोब्लास्ट ्स को फ्रीज करने के लिए, उन्हें 5 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड 1एक्स पीबीएस के साथ धो लें। पीबीएस को एस्पिरेट करें और फाइब्रोब्लास्ट को 1x ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 4 मिलीलीटर के साथ अलग करें। फ्लास्क को इनक्यूबेटर में वापस रखें और 5% सीओ2 पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-7 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके डिटेचमेंट की निगरानी करें और कोशिकाओं को अलग करने के लिए फ्लास्क के किनारे पर टैप करें।
  2. अलग की गई कोशिकाओं को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। सेल कल्चर फ्लास्क को ताजा, पहले से गर्म फाइब्रोब्लास्ट माध्यम के 5 मिलीलीटर से धोएं। शंक्वाकार ट्यूब में धोने के माध्यम को पूल करें और 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें और 2 मिलीलीटर ताजा, पहले से गर्म फाइब्रोब्लास्ट माध्यम के साथ सेल गोली को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं की गणना करें और 1 x 106 कोशिकाओं को एक नई शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  4. सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें और सेल गोली को 1 मिलीलीटर ठंडे फाइब्रोब्लास्ट फ्रीजिंग माध्यम के साथ फिर से निलंबित करें जिसमें 90% भ्रूण बछड़ा सीरम और 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) शामिल हैं। क्रायोवियल में स्थानांतरित करें, एक ठंड कंटेनर में रखें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर फ्रीज करें। लंबे समय तक भंडारण के लिए, क्रायोवियल को अगले दिन एक तरल नाइट्रोजन टैंक में रखें।

3. हाईपीएससी उत्पन्न करने के लिए फाइब्रोब्लास्ट ्स की एपिसोमल रीप्रोग्रामिंग।

  1. एपिसोमल रीप्रोग्रामिंग के लिए, मार्ग 4 से 8 तक 1.5 x 106 फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करें। इस सेल नंबर तक पहुंचने के लिए, लगभग 70% कंफ्लुएंसी के साथ दो से तीन 250 एमएल फ्लास्क का उपयोग करें।
  2. रीप्रोग्रामिंग से एक दिन पहले, फाइब्रोब्लास्ट ्स को उनकी प्रोलिफेरेटिव स्थिति सुनिश्चित करने के लिए 1: 2 अनुपात में विभाजित करें। इसलिए, माध्यम को एस्पिरेट करें और फ्लास्क को प्रति फ्लास्क 5 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड 1 x पीबीएस के साथ धो लें। पीबीएस को एस्पिरेट करें और फाइब्रोब्लास्ट को 1x ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 4 मिलीलीटर के साथ अलग करें। फ्लास्क को इनक्यूबेटर में वापस रखें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 5-7 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके डिटेचमेंट की निगरानी करें और प्लास्टिक की सतह से कोशिकाओं को अलग करने के लिए फ्लास्क के किनारे पर टैप करें।
  3. अलग की गई कोशिकाओं को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और सेल कल्चर फ्लास्क को 5 एमएल ताजा, प्रीवार्म्ड फाइब्रोब्लास्ट माध्यम से धोएं। शंक्वाकार ट्यूब में धोने के माध्यम को पूल करें और 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और ताजा, पहले से गर्म फाइब्रोब्लास्ट माध्यम के 6 मिलीलीटर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  4. प्रति फ्लास्क ताजा, प्रीवार्म्ड फाइब्रोब्लास्ट माध्यम के 5 एमएल जोड़कर छह नए सेल कल्चर फ्लास्क तैयार करें। प्रत्येक फ्लास्क में फाइब्रोब्लास्ट सेल निलंबन के 1 एमएल जोड़ें। फ्लास्क को वापस इनक्यूबेटर में रखें और फ्लास्क को प्रत्येक दिशा में तीन बार ले जाकर कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करें।
  5. एपिसोमल रीप्रोग्रामिंग के लिए, प्रति प्लेट 4 एमएल कोल्ड कोटिंग समाधान के साथ एचआईपीएस संस्कृति के लिए उपयुक्त दो 10 सेमी सेल कल्चर प्लेटों को कोट करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: HIPSC को कल्चर करने के लिए, विभिन्न सेल कल्चर प्लास्टिक और अतिरिक्त बाह्य मैट्रिक्स कोटिंग की आवश्यकता होती है ( सामग्री की तालिका देखें)।
  6. फाइब्रोब्लास्ट ्स से मीडिया को निकालें और प्रति फ्लास्क 10 एमएल प्रीवार्म्ड 1 x पीबीएस से धो लें। पीबीएस को एस्पिरेट करें और फाइब्रोब्लास्ट ्स को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-7 मिनट के लिए इंजेक्ट करके प्रति फ्लास्क 1x ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 4 मिलीलीटर के साथ अलग करें। फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके डिटेचमेंट की निगरानी करें और यदि आवश्यक हो, तो प्लास्टिक की सतह से कोशिकाओं को अलग करने के लिए फ्लास्क के किनारे टैप करें।
  7. अलग की गई कोशिकाओं को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। खाली फ्लास्क को 6 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड फाइब्रोब्लास्ट माध्यम से धोएं ताकि शेष कोशिकाओं को इकट्ठा किया जा सके और शंक्वाकार ट्यूब में पूल किया जा सके। 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें और सेल गोली को 3 मिलीलीटर ताजा, पहले से गर्म 1 x पीबीएस में फिर से निलंबित करें।
  8. कोशिकाओं की गणना करें और एक नई शंक्वाकार ट्यूब में 1.5 x 106 फाइब्रोब्लास्ट स्थानांतरित करें। 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और सेल गोली को 5 मिलीलीटर इलेक्ट्रोपोरेशन माध्यम और सेंट्रीफ्यूज में फिर से निलंबित करें। इस बीच, लेपित 10 सेमी सेल कल्चर प्लेटों से कोटिंग समाधान को एस्पिरेट करें और 7 एमएल प्रीवार्म्ड फाइब्रोब्लास्ट माध्यम जोड़ें।
  9. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और 250 μL में 1.5 x 106 कोशिकाओं की एकाग्रता के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन माध्यम में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। 250 μL सेल निलंबन को 4 मिमी अंतराल दूरी के साथ एक इलेक्ट्रोपोरेशन क्यूवेट में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  10. इलेक्ट्रोपोरेशन माध्यम के 50 μL की कुल मात्रा में प्रत्येक प्लास्मिड (pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK, pCXLE-hMLN) के 4 μg को जोड़कर एक प्लास्मिड अभिकर्मक मिश्रण तैयार करें। क्यूवेट में स्थानांतरित करें और धीरे से फ्लिक करके मिलाएं। 280 वोल्ट पर एक पल्स के साथ इलेक्ट्रोपोरेट।
  11. बाँझ कैंची का उपयोग करके एक पिपेट टिप काटें और तैयार 10 सेमी सेल कल्चर प्लेटों में से प्रत्येक में इलेक्ट्रोपोरेटेड फाइब्रोब्लास्ट के 125 μL को स्थानांतरित करें। प्लेटों को सभी दिशाओं में तीन बार घुमाकर कोशिकाओं को वितरित करें और उन्हें इनक्यूबेटर में वापस रखें। बिना किसी गड़बड़ी के 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  12. मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए, अगले दिन माध्यम को 7 एमएल ताजा, पहले से गर्म फाइब्रोब्लास्ट माध्यम से बदलें। इलेक्ट्रोपोरेशन के 2 दिन बाद माध्यम को HIPSC कल्चर माध्यम में बदलें और अगले 20 दिनों के लिए हर दूसरे दिन इसे बदलें।

4. उत्पन्न HIPSC का चयन, विस्तार और गुणवत्ता नियंत्रण

  1. इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद एचआईपीएससी कॉलोनियों के गठन का निरीक्षण करने के लिए 10x या 20x उद्देश्य के साथ एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कम से कम 20 दिनों के लिए प्रतिदिन कोशिकाओं की निगरानी करें। यदि HIPSC कॉलोनियां अलग-अलग सीमाओं के साथ आकार में लगभग 300 μm व्यास की हैं और HIPSC एक उच्च नाभिक-से-शरीर अनुपात दिखाते हैं, तो HIPSC कॉलोनियां चुनकर चयन के लिए तैयार हैं (चित्रा 2B, C और चित्रा 3)।
  2. चुनने से पहले, HIPSC संस्कृति के लिए उपयुक्त 96-अच्छी प्लेट को प्रति अच्छी तरह से 100 μL कोटिंग समाधान के साथ कोट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन दौरान, सेल कल्चर डिश के निचले भाग में रुचि की कॉलोनियों को एक पेन के साथ चिह्नित करें। 96-वेल प्लेट की अंतिम तैयारी के लिए, कोटिंग समाधान को हटा दें और प्रत्येक कुएं में 10 μM ROCK अवरोधक Y27632 युक्त 100 μml प्रीवार्म्ड HIPSC कल्चर माध्यम जोड़ें।
  3. कोशिकाओं को पहले से गर्म 1x पीबीएस के साथ धोएं और मृत कोशिकाओं को हटाने से पहले 10 μM ROCK अवरोधक Y27632 युक्त ताजा, पहले से गर्म HIPSC कल्चर माध्यम जोड़ें। HIPSC कॉलोनियों को चुनने के लिए, एक गेज सुई का उपयोग करें और प्रत्येक कॉलोनी में एक ग्रिड खींचकर HIPSC कॉलोनियों को छोटे टुकड़ों में विभाजित करें।
  4. एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, जांचें कि कॉलोनियों को सफलतापूर्वक टुकड़ों में विभाजित किया गया है। उन्हें तैयार 96-वेल प्लेट में 100 μL पिपेट के साथ स्थानांतरित करें। कॉलोनी के खरोंच और नुकसान से बचने के लिए कोशिकाओं को छूने के बिना कॉलोनी के ऊपर पिपेट को सीधा रखें।
  5. इनक्यूबेटर में 96-वेल प्लेट को 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें और कोशिकाओं को बिना किसी गड़बड़ी के रात भर संलग्न होने दें। व्यंजन ों को फाइब्रोब्लास्ट और हाईपीएससी मिश्रण के साथ रखें, यदि चुनना सफल नहीं है। इसलिए, माध्यम को HIPSC संस्कृति माध्यम में बदलकर रॉक अवरोधक Y27632 को हटा दें और प्लेटों को इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  6. अगले दिन, 96-वेल प्लेट के माध्यम को 200 μL ताजा HIPSC कल्चर माध्यम में बदलें और इसे हर दूसरे दिन बदलें। अगले दिन 96-वेल प्लेट की निगरानी करें और सफलतापूर्वक चुने गए क्लोन के साथ कुओं को चिह्नित करें।
    नोट: यदि पहली कोशिश के बाद चुने गए हाईपीएससी क्लोन पूरी तरह से चयनित नहीं हैं और फाइब्रोब्लास्ट कुएं में पाए जा सकते हैं, तो 96-वेल से चुनें या प्लेट से फाइब्रोब्लास्ट को खुरचें।

5. चयनित HIPSC क्लोन का विस्तार

  1. एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके HIPSC क्लोन की निगरानी करें। यदि चयनित HIPSC लगभग 70% कॉन्फ्लुएंसी तक पहुंचते हैं, तो HIPSC क्लोन विस्तार के लिए तैयार हैं।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए प्रति कुएं 250 μL कोटिंग समाधान के साथ HIPSC संस्कृति के लिए उपयुक्त 48-अच्छी प्लेट कोट करें। कोटिंग समाधान को 200 μL ताजा, प्रीवार्म्ड HIPSC कल्चर माध्यम के साथ बदलें जिसमें 10 μM ROCK अवरोधक Y27632 शामिल हैं।
  3. 96-वेल प्लेट से HIPSC को अलग करने के लिए, प्लास्टिक की सतह को 1,000 μL पिपेट टिप के साथ खुरचें। अलग किए गए HIPSC को 96-वेल प्लेट से 48-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। मृत कोशिकाओं और रॉक अवरोधक वाई 27632 को हटाने के लिए अगले दिन माध्यम को ताजा, पहले से गर्म एचआईपीएस संस्कृति माध्यम में बदलें।
  4. यदि HIPSC क्लोन लगभग 70% कंफ्लुएंसी तक पहुंचते हैं, तो HIPSC को 24-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। इसलिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए प्रति कुएं 400 μL कोटिंग समाधान के साथ HIPSC संस्कृति के लिए उपयुक्त 24-अच्छी प्लेट को कोट करें। कोटिंग समाधान को 400 μL ताजा, प्रीवार्म्ड HIPSC कल्चर माध्यम के साथ बदलें जिसमें 10 μM ROCK अवरोधक Y27632 शामिल हैं। 48 कुओं से माध्यम को एस्पिरेट करें और 500 μL प्रीवार्म्ड 1x PBS से धो लें।
  5. पीबीएस को 100 μL एंजाइमेटिक सेल डिटेचमेंट समाधान के साथ बदलें जिसमें 10 μM ROCK अवरोधक Y27632 शामिल हैं और 4 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 1,000 μL पिपेट का उपयोग करके प्लेट से HIPSC को कुल्ला करें। विघटित कोशिकाओं को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। खाली 48-वेल प्लेट को 10 μM ROCK अवरोधक Y27632 युक्त HIPSC कल्चर माध्यम से धोएं और शंक्वाकार ट्यूब में पूल करें।
  6. 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और 10 μM ROCK अवरोधक Y27632 युक्त HIPSC कल्चर माध्यम के 1 mL में HIPSC को फिर से निलंबित करें और 24-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। इनक्यूबेटर में प्लेट को 5% सीओ2 पर 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें और प्लेट को सभी दिशाओं में तीन बार उत्तेजित करके कोशिकाओं को वितरित करें। कोशिकाओं को बिना किसी गड़बड़ी के रात भर संलग्न होने दें।
  7. अगले दिन, रॉक अवरोधक वाई 27632 के बिना माध्यम को हाईपीएससी संस्कृति माध्यम में बदलें।
    नोट: यदि HIPSC क्लोन लगभग 70% कंफ्लुएंसी तक पहुंचते हैं, तो 12-वेल प्रारूप के लिए उपयुक्त बढ़े हुए वॉल्यूम के साथ चरण 5.4 से 5.7 को दोहराकर HIPSC को 12-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। यदि 12-वेल प्लेट से HIPSC लगभग 70% कंफ्लुएंसी तक पहुंचते हैं, तो HIPSC क्लोन को 6-वेल प्रारूप के लिए बढ़ी हुई मात्रा के साथ 6-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें।

6. चयनित HIPSC क्लोन ों को फ्रीज करना

  1. चयनित HIPSC क्लोन को फ्रीज करने के लिए, 6-वेल प्लेट से माध्यम को एस्पिरेट करें। कुओं को 2 मिलीलीटर 1x पीबीएस से धो लें। 10 μM Y27632 युक्त 1 mL एंजाइमेटिक सेल डिटेचमेंट समाधान के साथ HIPSC को एस्पिरेट और अलग करें। प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस रखें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 4 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. 1,000 μL पिपेट का उपयोग करके प्लेट से HIPSC को कुल्ला करें और अलग कोशिकाओं को 15 mL शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। प्लेट को 2 मिलीलीटर ताजा, प्रीवार्म्ड हाईपीएससी कल्चर माध्यम के साथ धोएं जिसमें 10 μM ROCK अवरोधक Y27632 शामिल हैं। शंक्वाकार ट्यूब में पूल और सेंट्रीफ्यूज 200 x g पर 5 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर। सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें और सेल गोली को 2 मिलीलीटर ताजा, प्रीवार्म्ड एचपीएससी कल्चर माध्यम के साथ पुन: निलंबित करें जिसमें 10 μM ROCK अवरोधक Y27632 शामिल हैं।
  3. कोशिकाओं की गणना करें और 1 x 106 कोशिकाओं को एक नई शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें, सेल गोली को 1 मिलीलीटर ठंडे, सीरम-मुक्त हाईपीएससी फ्रीजिंग माध्यम में फिर से निलंबित करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर फ्रीजिंग कंटेनर का उपयोग करके क्रायोवियल में फ्रीज करें। लंबे समय तक भंडारण के लिए, क्रायोवियल को अगले दिन एक तरल नाइट्रोजन टैंक में रखें।

7. एचआईपीएससी गुणवत्ता नियंत्रण

  1. HIPSC आकृति विज्ञान का लक्षण वर्णन।
    1. 20x उद्देश्य के साथ एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके विशेषता HIPSC आकृति विज्ञान की जांच करें। रीप्रोग्रामिंग के बाद, सेल आकृति विज्ञान लंबे, स्पिंडल जैसे फाइब्रोब्लास्ट से छोटे, गोल एचपीएससी में बदल जाता है, जो अलग-अलग सीमाओं वाली कॉलोनियों में बढ़ने वाले उच्च नाभिक-से-शरीर अनुपात को प्रस्तुत करता है (चित्रा 2 सी)।
    2. यदि हाईपीएससी कॉलोनियां बहुत घनी हो जाती हैं और सहज भेदभाव होता है, तो पिपेट टिप (चित्रा 3) का उपयोग करके प्लेट से विभेदित भागों को खुरचें। चूंकि HIPSC में उच्च प्रसार दर होती है, इसलिए हर दिन HIPSC संस्कृतियों को ताजा, गर्म HIPSC फीडिंग माध्यम के साथ खिलाएं।
  2. "इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा प्लूरिपोटेंसी मार्करों का लक्षण वर्णन"।
    1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के माध्यम से प्लूरिपोटेंसी मार्कर के लिए उत्पन्न एचपीएससी की जांच करने के लिए, 24-वेल प्लेट में प्लास्टिक कवरलिप्स रखें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 1 घंटे के लिए 250 μL कोटिंग समाधान के साथ कोट करें। कोटिंग समाधान को 10 μM ROCK अवरोधक Y27632 युक्त 1 mL प्रीवार्म्ड HIPSC कल्चर माध्यम के साथ बदलें।
    2. बीज 1.9 x 104 अलग-अलग HIPSC प्रति 24-कुआं। HIPSC को बिना किसी गड़बड़ी के 37 °C और 5%CO2 पर रात भर संलग्न होने दें। HIPSC के पृथक्करण के लिए चरण 5.4 से 5.6 देखें। अगले दिन माध्यम को रॉक अवरोधक वाई 27632 के बिना एचआईपीएस संस्कृति माध्यम से बदलें।
    3. धुंधला करने के लिए, कोशिकाओं को 1 एमएल प्रीवार्म्ड 1एक्स पीबीएस के साथ धोएं और बाद में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ हाईपीएससी को ठीक करें। 1x PBS के साथ निश्चित HIPSC को धोएं और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्रति कुएं 200 μL प्रीइन्क्यूबेशन समाधान के साथ अनिर्दिष्ट बाइंडिंग साइटों को ब्लॉक करें। एंटीबॉडी डिल्यूनेट में प्राथमिक एंटीबॉडी Ki67 (1:300), OCT3/4 (1:200), SSEA4 (1:100) को पतला करें।
    4. 70% इथेनॉल के साथ एक प्लास्टिक पन्नी को साफ करें और इसे पानी के जलाशय से भरे धुंधला कक्ष में रखें। पन्नी पर 30 μL प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की बूंदें रखें। निश्चित नमूने को कमजोर पड़ने में उल्टा रखें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    5. अगले दिन, 5 मिनट के लिए 1x PBS के साथ तीन बार नमूने धोएं और पन्नी पर साफ स्थानों पर द्वितीयक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने (1: 1,000) की 30 μL बूंदें रखें। कवर स्लाइड ्स को कमजोर पड़ने में उल्टा रखें। अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. इनक्यूबेशन बाद, 5 मिनट के लिए 1x PBS के साथ तीन बार धो लें। DAPI युक्त बढ़ते माध्यम में ग्लास स्लाइड पर नमूने माउंट करें। कमरे के तापमान पर और अंधेरे में रात भर सूखने दें और एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (चित्रा 4) का उपयोग करके नमूनों की छवि बनाएं।
  3. बैक्टीरिया और माइकोप्लाज्मा संदूषण का बहिष्करण
    1. बैक्टीरिया संदूषण को बाहर करने के लिए, 500 μL अलग किए गए HIPSC को 5 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड लुरिया-बर्टानी (एलबी) माध्यम में स्थानांतरित करें। HIPSC के पृथक्करण के लिए चरण 5.4 से 5.6 देखें। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। यदि एलबी माध्यम मैलापन दिखाई देता है, तो बैक्टीरिया संदूषण होने की संभावना है। कोशिकाओं को छोड़ दें।
    2. माइकोप्लाज्मा संदूषण को बाहर करने के लिए, 6 कुओं से लगभग 90% कॉन्फ्लुएंट एचआईपीएस के साथ 2 दिनों से प्रतिस्थापित नहीं किए गए माध्यम को इकट्ठा करें। माइकोप्लाज्मा संदूषण का पता लगाने के लिए मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) का उपयोग करें। इस उद्देश्य के लिए कई वाणिज्यिक माइकोप्लाज्मा डिटेक्शन किट उपलब्ध हैं।

8. पोडोसाइट्स में एचआईपीएससी का भेदभाव।

  1. विकास कारकों की तैयारी और भंडारण
    1. 10 mM Y27632 की स्टॉक एकाग्रता तैयार करने के लिए, 3.12 mL बाँझ पानी में 10 मिलीग्राम Y27632 (320.26 ग्राम / mol का आणविक भार) का पुनर्गठन करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 100 μL एलिकोट स्टोर करें और 10 μM की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए सेल कल्चर माध्यम में 1: 1,000 पतला करें।
    2. 30 mM CHIR99021 की स्टॉक एकाग्रता तैयार करने के लिए, बाँझ DMSO के 358.2 μL में CHIR99021 (465.34 ग्राम / mol का आणविक भार) के 5 मिलीग्राम का पुनर्गठन करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 50 μL एलिकोट स्टोर करें और 3 μM की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए सेल कल्चर माध्यम में 1: 10,000 पतला करें।
    3. 100 μg / mL activin A की स्टॉक एकाग्रता तैयार करने के लिए, 0.1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) युक्त 1x PBS के 1 mL में 100 μg एक्टिविन A का पुनर्गठन करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 100 μL एलिकोट स्टोर करें और 50 ng / mL की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए सेल कल्चर माध्यम में 1: 2,000 पतला करें।
    4. 100 μg / mL बोन मॉर्फोजेनिक प्रोटीन 7 (BMP7) की स्टॉक एकाग्रता तैयार करने के लिए, 0.1% बीएसए युक्त बाँझ पानी के 1 मिलीलीटर में BMP7 के 100 μg का पुनर्गठन करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 100 μL एलिकोट स्टोर करें और 50 ng / mL की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए सेल कल्चर माध्यम में 1: 2,000 पतला करें।
    5. 100 μg / mL संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) की स्टॉक एकाग्रता तैयार करने के लिए, बाँझ पानी के 1 मिलीलीटर में 100 μg वीईजीएफ का पुनर्गठन करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 100 μL एलिकोट स्टोर करें और 25 ng / mL की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए सेल कल्चर माध्यम में 1: 4,000 पतला करें।
    6. ऑल-ट्रांस रेटिनोइक एसिड की 10 एमएम स्टॉक एकाग्रता तैयार करने के लिए, 3.33 एमएल बाँझ डीएमएसओ में 10 मिलीग्राम ऑल-ट्रांस रेटिनोइक एसिड का पुनर्गठन करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 100 μL एलिकोट स्टोर करें और 0.5 μM की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए सेल कल्चर माध्यम में 1:100 पतला करें।
  2. मेसोडर्म वंश को प्रेरित करने के लिए डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्ग का सक्रियण
    1. HIPSC-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स में HIPSC के विभेदन के लिए, 37 °C और 5%CO2 पर 1 घंटे के लिए कोटिंग समाधान के साथ HIPSC संस्कृति के लिए उपयुक्त कोट सेल कल्चर प्लेट्स या फ्लास्क। कोटिंग समाधान की कुल मात्रा 1 एमएल प्रति 6-वेल कल्चर प्लेट या 4 एमएल प्रति 10 सेमी सेल कल्चर प्लेट है।
    2. माध्यम को एस्पिरेट करें और पहले से गर्म 1x पीबीएस के साथ हाईपीएससी को धो लें। पीबीएस को एस्पिरेट करें और 10 μM Y27632 युक्त एंजाइमेटिक सेल डिटेचमेंट समाधान जोड़ें जिसमें 1 एमएल प्रति 6-वेल कल्चर प्लेट या 4 एमएल प्रति 10 सेमी सेल कल्चर प्लेट की कुल मात्रा हो।
    3. प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस रखें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 4 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 1,000 μL पिपेट का उपयोग करके प्लेट से HIPSC को कुल्ला करें। अलग की गई कोशिकाओं को शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. प्लेट को ताजा, गर्म HIPSC कल्चर माध्यम से धोएं जिसमें 10 μM ROCK अवरोधक Y27632 शामिल हैं। पृथक्करण अभिकर्मक को बेअसर करने के लिए शंक्वाकार ट्यूब में धोने के माध्यम को पूल करें। 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें और सेल गोली को 2 मिलीलीटर ताजा, प्रीवार्म्ड एचपीएससी कल्चर माध्यम के साथ पुन: निलंबित करें जिसमें 10 μM ROCK अवरोधक Y27632 शामिल हैं।
    5. कोशिकाओं की गणना करें और बीज 1 x 104 HIPSC/cm2 बोलें। सभी दिशाओं में तीन बार आंदोलन करके कोशिकाओं को वितरित करें। HIPSC को बिना किसी गड़बड़ी के 5%CO2 के साथ 37 °C पर रात भर संलग्न होने दें।
    6. अगले दिन, माध्यम को 2 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड मेसोडर्म भेदभाव माध्यम के साथ बदलें जिसमें 1x B27 पूरक, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 3 μM CHIR99021, 50 ng / mL एक्टिविन ए और 10 μM रॉक अवरोधक Y27632 शामिल हैं।
  3. नेफ्रॉन पूर्वज कोशिकाओं में भेदभाव।
    1. 2 दिनों के बाद, मेसोडर्म माध्यम को 1x B27 पूरक, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 3 μM CHIR99021, 50 ng / mL एक्टिविन A, और 50 ng / mL BMP7 प्रति 6-वेल कल्चर प्लेट या 6 एमएल प्रति 10 सेमी सेल कल्चर प्लेट वाले प्रीवार्म्ड नेफ्रॉन पूर्वज भेदभाव माध्यम के 2 मिलीलीटर में बदलें। अगले 14 दिनों के लिए हर दूसरे दिन माध्यम बदलें।
      नोट: नेफ्रॉन पूर्वज कोशिकाएं प्रसार करती हैं और नेफ्रॉन पूर्वज विस्तार माध्यम में भेदभाव के 7 दिनों के बाद पारित और जमी हुई हो सकती हैं।
    2. नेफ्रॉन पूर्वज कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कोटिंग समाधान के साथ एचआईपीएस संस्कृति के लिए उपयुक्त सेल कल्चर प्लास्टिक को कोट करें। कोटिंग समाधान को नेफ्रॉन पूर्वज विस्तार माध्यम से बदलें। मीडिया को एस्पिरेट करें और पहले से गर्म 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं। पीबीएस को हटा दें और कोशिकाओं को 1x ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ अलग करें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं की टुकड़ी की निगरानी करें। यदि आवश्यक हो, तो सतह से कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्लास्टिक के किनारे पर टैप करें। प्लेट से कोशिकाओं को कुल्ला करें और शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। खाली फ्लास्क या प्लेट को पहले से गर्म नेफ्रॉन पूर्वज विस्तार माध्यम की समान मात्रा के साथ धोएं जो पृथक्करण अभिकर्मक है।
    4. शंक्वाकार ट्यूब में धोने के माध्यम को पूल करें। 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और 2 मिलीलीटर ताजा, पहले से गर्म नेफ्रॉन पूर्वज विस्तार माध्यम के साथ सेल गोली को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं की गणना करें और आगे के भेदभाव के लिए प्रति सेमी 2 प्रति सेमी1.5 x 104 नेफ्रॉन पूर्वज कोशिकाओं की गणना करें।
      नोट: नेफ्रॉन पूर्वज कोशिकाओं को फ्रीज करने के लिए, ठंडे सीरम-मुक्त क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम के 1 एमएल में 1 x 106 कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और क्रायोवियल में स्थानांतरित करें। रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रीजिंग कंटेनर में फ्रीज करें और दीर्घकालिक भंडारण के लिए एक तरल नाइट्रोजन टैंक में स्थानांतरित करें।
    5. प्लेटों को इनक्यूबेटर में वापस रखें और सभी दिशाओं में तीन बार आंदोलन करके कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करें। अगले दिन माध्यम को ताजा, पहले से गर्म नेफ्रॉन पूर्वज भेदभाव माध्यम में बदलें। हर दूसरे दिन माध्यम को बदलें जब तक कि कोशिकाओं को नेफ्रॉन पूर्वज भेदभाव माध्यम में 14 दिनों के लिए विभेदित नहीं किया जाता है।
  4. "एचआईपीएस-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स में टर्मिनल भेदभाव"।
    1. माध्यम को एस्पिरेट करें और 1x B27 पूरक, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 3 μM CHIR99021, 50 ng/mL एक्टिविन A, 50 ng/mL BMP7, 25 ng/μL VEGF, और 0.5 μM ऑल-ट्रांस रेटिनोइक एसिड प्रति 6-वेल कल्चर प्लेट या 6 एमएल प्रति 10 सेमी सेल कल्चर प्लेट से युक्त 2 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड पोडोसाइट्स विभेदन माध्यम जोड़ें। प्लेटों को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर वापस रखें। ताजा, पहले से गर्म पोडोसाइट्स भेदभाव माध्यम के साथ 4 दिनों के लिए हर दूसरे दिन माध्यम बदलें।
    2. भेदभाव के बाद संस्कृति में एचआईपीएस-पोडोसाइट्स को रखने के लिए, कोशिकाओं को सप्ताह में दो बार पोडोसाइट्स रखरखाव माध्यम के साथ खिलाएं जिसमें 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और 0.1% इंसुलिन-ट्रांसफरिन-सेलेनियम शामिल हैं।
      नोट: टर्मिनल विभेदित हाइपीएससी-पोडोसाइट्स अब प्रसार नहीं करते हैं। हालांकि, उन्हें 4 सप्ताह तक सेल कल्चर में रखना संभव है।
  5. जमे हुए नेफ्रॉन पूर्वज कोशिकाओं का पिघलना और विस्तार।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 1 घंटे के लिए कोटिंग समाधान के साथ एचआईपीएससी संस्कृति के लिए उपयुक्त एक नया सेल कल्चर प्लास्टिक फ्लास्क कोट करें। कोटिंग समाधान को नेफ्रॉन पूर्वज विस्तार माध्यम के 5 एमएल के साथ बदलें।
    2. 7 एमएल प्रीवार्म्ड नेफ्रॉन पूर्वज विस्तार माध्यम के साथ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब तैयार करें। लगभग 20 सेकंड के लिए आंदोलन के बिना पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए कोशिकाओं को पिघलाएं। क्रायोवियल को पानी के स्नान से बाहर निकालें जब आधी कोशिकाएं पिघल जाती हैं, और कुछ बर्फ शेष होती है।
    3. 70% इथेनॉल के साथ क्रायोवियल स्प्रे करें और जैव सुरक्षा कैबिनेट में रखें। पिघली हुई कोशिकाओं को पहले से गर्म नेफ्रॉन पूर्वज विस्तार माध्यम के साथ शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। 1,000 μL पिपेट का उपयोग करें और कोशिकाओं को ट्यूब की दीवार से बहुत धीरे-धीरे चलने दें।
    4. शंक्वाकार ट्यूब में शेष कोशिकाओं और पूल को इकट्ठा करने के लिए खाली क्रायोवियल को 1 एमएल नेफ्रॉन पूर्वज विस्तार माध्यम से धोएं। 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और ताजा, पहले से गर्म नेफ्रॉन पूर्वज विस्तार माध्यम में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
    5. पिघली हुई कोशिकाओं को लेपित फ्लास्क में स्थानांतरित करें और अगले दिन माध्यम को ताजा, गर्म नेफ्रॉन पूर्वज विस्तार माध्यम में बदलें। आगे के भेदभाव से पहले, कोशिकाओं को हर दूसरे दिन माध्यम को बदलकर नेफ्रॉन पूर्वज विस्तार माध्यम में प्रसार करने दें, और चरण 8.3.5 से आगे बढ़ें।

9. इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा एचआईपीएस-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स का लक्षण वर्णन।

  1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के माध्यम से पोडोसाइट्स-विशिष्ट मार्कर के लिए विभेदित पोडोसाइट्स की जांच करने के लिए, 24-वेल प्लेट में प्लास्टिक कवरलिप्स रखें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 1 घंटे के लिए 250 μL कोटिंग समाधान के साथ कोट करें। कोटिंग समाधान को 1 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड नेफ्रॉन पूर्वज विस्तार माध्यम से बदलें। बीज 2.5 x 104 अलग नेफ्रॉन पूर्वज कोशिकाएं प्रति 24-वेल प्लेट। नेफ्रॉन पूर्वज कोशिकाओं के पृथक्करण के लिए चरण 8.3.2 से 8.3.4 देखें।
  2. कोशिकाओं को बिना किसी गड़बड़ी के 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर रात भर संलग्न होने दें। अगले दिन माध्यम को पहले से गर्म नेफ्रॉन पूर्वज भेदभाव माध्यम से बदलें।
  3. हर दूसरे दिन माध्यम को बदलकर भेदभाव समाप्त करें जब तक कि कोशिकाओं को नेफ्रॉन पूर्वज भेदभाव माध्यम में कुल 14 दिनों और पोडोसाइट्स भेदभाव माध्यम में अतिरिक्त 5 दिनों के लिए विभेदित नहीं किया जाता है।
  4. अंतिम भेदभाव के बाद, कोशिकाओं को 1 एमएल प्रीवार्म्ड 1 एक्स पीबीएस के साथ धो लें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ हाईपीएससी-पोडोसाइट्स को ठीक करें। 1x PBS के साथ निश्चित कोशिकाओं को धोएं और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्रति कुएं 200 μL प्रीइन्क्यूबेशन समाधान के साथ अनिर्दिष्ट बाइंडिंग साइटों को अवरुद्ध करें।
  5. एंटीबॉडी डिल्यूनेट में प्राथमिक एंटीबॉडी सिनैप्टोपोडिन (1: 200), पोडोसिन (1: 100), और नेफ्रिन (1: 25) को पतला करें और पानी के जलाशय वाले धुंधला कक्ष में एक साफ प्लास्टिक पन्नी पर 30 μL प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की बूंदों को रखें।
  6. कमजोर पड़ने में ऊपर की ओर फिक्स्ड हाईपीएससी-पोडोसाइट्स के साथ कवर स्लाइड रखें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। अगले दिन, 5 मिनट के लिए 1x PBS के साथ तीन बार धोएं। 1x PBS में द्वितीयक एंटीबॉडी (1: 1,000) को पतला करें और पन्नी पर साफ धब्बे पर 30 μL द्वितीयक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की बूंदों को रखें। कवर स्लाइड ्स को कमजोर पड़ने में उल्टा रखें।
  7. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन बाद, 5 मिनट के लिए 1x PBS के साथ तीन बार धो लें। नमूने को DAPI युक्त बढ़ते माध्यम में ग्लास स्लाइड पर माउंट करें। कमरे के तापमान पर और अंधेरे में रात भर सूखने दें। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके नमूने की छवि बनाएं।

Representative Results

इस चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल के साथ जो एपिसोमल रीप्रोग्रामिंग और भेदभाव को जोड़ता है, पोडोसाइट्स-प्रासंगिक जीन में रोगी के उत्परिवर्तन को ले जाने वाले पोडोसाइट्स उत्पन्न करना संभव है। यह रोग-विशिष्ट पोडोसाइट्स परिवर्तनों के विश्लेषण को सक्षम बनाता है। सभी विभिन्न सेल चरणों के दौरान प्रोटोकॉल के दौरान रोगी की आनुवंशिक पृष्ठभूमि संरक्षित है। इसके अलावा, टर्मिनल रूप से विभेदित गैर-प्रसार पोडोसाइट्स की अपर्याप्त सेल संख्या की सीमा को एचआईपीएससी-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स का उपयोग करके दूर किया जा सकता है। यद्यपि एचआईपीएससी-पोडोसाइट्स को एचआईपीएससी में रीप्रोग्रामिंग और बाद में पोडोसाइट्स में भेदभाव के माध्यम से आउटग्रोन त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट से उत्पन्न होने में कई महीने लगते हैं, प्रोटोकॉल के तीन अलग-अलग चरणों में कोशिकाओं को फ्रीज करना संभव है (चित्रा 2)। 7 दिनों के लिए नेफ्रॉन पूर्वज भेदभाव माध्यम में भेदभाव के बाद फाइब्रोब्लास्ट, एचआईपीएससी और नेफ्रॉन पूर्वज कोशिकाओं के लिए ठंड संभव है। इसलिए, कामकाजी सेल बैंकों और बड़े पैमाने पर प्रयोगों की पीढ़ी संभव है।

Figure 2
चित्रा 2: एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के माध्यम से प्रोटोकॉल के व्यक्तिगत चरण। (ए) आउटग्रोन त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट। (बी) रीप्रोग्रामिंग के बाद एचआईपीएस कॉलोनी का गठन। (सी) चयनित एचआईपीएस संस्कृति। (डी) भेदभाव के 2 दिनों के बाद मेसोडर्म कोशिकाएं। (ई) नेफ्रॉन पूर्वज विभेदन माध्यम में भेदभाव के 14 दिनों के बाद नेफ्रॉन पूर्वज कोशिकाएं। (एफ) टर्मिनल विभेदित हिपीएससी-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स। स्केल बार 300 μm (A, B, D-F) और 150 μm (C) का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्नोफ्लेक संभावित ठंड चरणों पर प्रकाश डालता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चूंकि उत्पन्न एचआईपीएस-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स सेल प्रकार और आकृति विज्ञान के बारे में भारी बदलाव के साथ एक लंबे प्रोटोकॉल को पार करते हैं, इसलिए सेल लक्षण वर्णन अनिवार्य है। सेल आकृति विज्ञान, जैसे आकार और सेल आकार, साथ ही विकास व्यवहार, एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके निगरानी की जा सकती है। फाइब्रोब्लास्ट ्स 150 μm से 300 μm (चित्रा 2A) के आकार के साथ एक लंबा स्पिंडल जैसा फेनोटाइप प्रस्तुत करते हैं। रीप्रोग्रामिंग के बाद, 50 μm छोटे HIPSC वाली कॉलोनियां होती हैं। ये उपनिवेश अलग-अलग सीमाओं और HIPSC को प्रदर्शित करते हैं जो उच्च नाभिक-से-शरीर अनुपात और बढ़ी हुई प्रसार दर (चित्रा 2 सी) के साथ प्रतिष्ठित हैं। चूंकि पोडोसाइट्स टर्मिनल रूप से विभेदित कोशिकाएं हैं, इसलिए प्रसार दर प्रगतिशील भेदभाव के साथ कम हो जाती है, और कोशिका आकृति विज्ञान प्रमुख पैर प्रक्रियाओं के साथ 300 μm बड़े स्टार के आकार के पोडोसाइट्स में बदल जाता है (चित्रा 2 एफ)।

कॉन्फ्लुएंसी एचआईपीएस संस्कृति का एक महत्वपूर्ण बिंदु है, और सहज भेदभाव तब दिखाई दे सकता है जब कॉलोनियां बहुत घनी हो जाती हैं (चित्रा 3)। संस्कृति पकवान के प्रभावित हिस्सों को स्क्रैप करके गुजरने से पहले इन कॉलोनियों को हटा दिया जाना चाहिए।

Figure 3
चित्रा 3: विभिन्न गुणवत्ता के HIPSC के उदाहरण। सफलतापूर्वक (ए) पुन: प्रोग्राम किए गए एचआईपीएस कालोनियों और (बी) चयनित एचपीएससी की चरण विपरीत छवियां, साथ ही (सी) सहज भेदभाव, (डी, ई) गैर-एचआईपीएस सी कॉलोनियां, और (एफ) एक बहुत घनी एचआईपीएससी संस्कृति। स्केल बार 300 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इस प्रोटोकॉल के विभिन्न सेल प्रकारों को एक विशिष्ट मार्कर की अभिव्यक्ति के बारे में मान्य किया जाना चाहिए। रीप्रोग्रामिंग के बाद, HIPSC प्लूरिपोटेंसी क्षमता हासिल करते हैं और SSEA4, OCT3/4, और Ki67 (चित्रा 4) 38,39,40 जैसे प्रसार और प्लूरिपोटेंसी मार्करों को व्यक्त करते हैं। यह ज्ञात है कि रीप्रोग्रामिंग, साथ ही साथ HIPSC और भेदभाव की लंबी संस्कृति, एक असामान्य कैरियोटाइप को जन्म दे सकती है, या बल्कि उत्परिवर्तन41 को प्रेरित कर सकती है। इसलिए, सुसंस्कृत कोशिकाओं की आनुवंशिक पृष्ठभूमि की निगरानी समय के साथ और जी-बैंडिंग और पूरे एक्सोम अनुक्रमण द्वारा विभिन्न मार्गों पर की जानी चाहिए।

Figure 4
चित्रा 4: इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा उत्पन्न एचपीएससी का लक्षण वर्णन। (ए) प्रोलिफेरेटिव मार्कर केआई 67, साथ ही प्लूरिपोटेंसी मार्कर (बी) ओसीटी 3/4 और (सी) एसएसईए 4 के लिए धुंधला करके उत्पन्न एचपीएससी का लक्षण वर्णन। स्केल बार 100 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

रूपात्मक रूप से, एचआईपीएस-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स स्टार के आकार के दिखाई देते हैं और सिपोडोसाइट्स की तुलना में लंबी प्राथमिक और माध्यमिक पैर प्रक्रियाओं का एक अलग नेटवर्क व्यक्त करते हैं (चित्रा 5)। एचआईपीएससी-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स पोडोसाइट-विशिष्ट मार्कर प्रोटीन जैसे सिनैप्टोपोडिन, नेफ्रिन और पोडोसिन (चित्रा 6 ए-सी)42 को व्यक्त करते हैं।

Figure 5
चित्रा 5: सिपोडोसाइट्स की तुलना में एचआईपीएस-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स की आकृति विज्ञान। फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप (ए, सी) और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (बी, डी) का उपयोग करके सेल आकृति विज्ञान और फिलोपोडिया के बारे में एक स्वस्थ दाता से (ए, बी) एचआईपीएस-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स की तुलना (सी, डी) सिपोडोसाइट्स से की जाती है। स्केल बार 150 μm (A, C) और 20 μm (B, D) का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इसलिए, न केवल स्वस्थ दाताओं से, बल्कि पोडोसाइट्स-विशिष्ट जीन में उत्परिवर्तन वाले रोगियों से भी एचआईपीएस-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स की तुलना, रोगी के उत्परिवर्तन एक्स विवो के व्यक्तिगत लक्षण वर्णन की अनुमति देती है।

Figure 6
चित्रा 6: एचआईपीएस-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स और सिपोडोसाइट्स में एक पोडोसाइट्स-विशिष्ट मार्कर का लक्षण वर्णन। पोडोसाइट्स-विशिष्ट मार्कर प्रोटीन सिनैप्टोपोडिन (ए, डी), नेफ्रिन (बी, ई), और पोडोसिन (सी, एफ) के संबंध में एक स्वस्थ दाता से (डी-एफ) सिपोडोसाइट्स के लिए (ए-सी) एचआईपीएस-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स की तुलना। स्केल बार 50 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1. अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले सभी सेल कल्चर मीडिया और समाधानों की संरचना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

यह सेल संस्कृति-आधारित प्रोटोकॉल मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट के एपिसोमल रीप्रोग्रामिंग को रोगी-विशिष्ट एचपीएससी में जोड़ता है और बाद में एचआईपीएससी-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स में भेदभाव करता है। यह हमें पोडोसाइट्स चोट के संबंध में आनुवंशिक ग्लोमेरुलर रोग वाले रोगियों से पोडोसाइट्स के उत्परिवर्तन से संबंधित परिवर्तनों का अध्ययन करने की अनुमति देता है। इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा एकीकरण-मुक्त विधि के साथ त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट को पुन: प्रोग्राम करने का प्रोटोकॉल बैंग एट अल.32 और ओकिता एट अल.33 के प्रकाशित काम से अनुकूलित है। HIPSC से पोडोसाइट्स को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल को Musah et al.28,34,35 से प्रकाशित प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया है। पहले से ही एचआईपीएस 27,34,35 से पोडोसाइट्स की पीढ़ी का वर्णन करने वाले प्रकाशन उपलब्ध हैं। हालांकि, यहां प्रदान किया गया प्रोटोकॉल पोडोसाइट्स में एचआईपीएससी के भेदभाव के बारे में अनुकूलित और कम खर्चीला है। मुसाह एट अल से प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना में, हमने इस प्रोटोकॉल का परीक्षण विभिन्न कोटिंग अभिकर्मकों, जैसे विट्रोनेक्टिन, लैमिनिन सिल्क -511, और घुलनशील तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर किया। विट्रोनेक्टिन और लेमिनिन सिल्क -511 की सांद्रता को 5 μg / mL 28,34,35 के बजाय 2.5 μg / mL तक कम किया जा सकता है। इसके अलावा, बीएमपी 7 और एक्टिविन ए -दो बहुत महंगे विकास कारकों की सांद्रता को 50% तक कम करना संभव था- 100 एनजी / एमएल से 50 एनजी / एमएल तक।

यह कम खर्चीले भेदभाव को सक्षम बनाता है। 7 वें दिन से नेफ्रॉन पूर्वज कोशिकाएं अभी भी बढ़ रही थीं, और ठंड की संभावना पहले दिखाई गई थी। हमने पिघलने के बाद और कई दिनों तक डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) और बी 27 युक्त मूल माध्यम में अंतिम भेदभाव से पहले इन कोशिकाओं का विस्तार किया, जिससे लागत और भी कम हो गई। भेदभाव चरणों के अलावा, यह प्रोटोकॉल एपिसोमल रीप्रोग्रामिंग के माध्यम से रोगी-विशिष्ट एचपीएससी की बाद की पीढ़ी के साथ त्वचा बायोप्सी से फाइब्रोब्लास्ट ्स के आउटग्रोथ का वर्णन करता है। इन दो विधियों का संयोजन रोगी-विशिष्ट पोडोसाइट्स की पीढ़ी को सक्षम बनाता है। इसलिए, रोगी-विशिष्ट एचआईपीएस-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए एक पूर्ण चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल यहां प्रदान किया गया है जिसे पहले इतने विस्तार से वर्णित नहीं किया गया था।

जैसा कि समग्र प्रोटोकॉल में कई अलग-अलग सेल प्रकार शामिल हैं, विभिन्न चरणों में उत्पन्न सेल प्रकारों को चिह्नित करना महत्वपूर्ण है। कोशिकाएं एक विस्तारित अवधि के लिए संस्कृति में हैं, इसलिए गुणवत्ता नियंत्रण विभिन्न मार्गों पर किया जाना चाहिए। HIPSC के साथ काम करते समय, दैनिक भोजन के साथ-साथ सेल व्यवहार और आकृति विज्ञान की निगरानी आवश्यक है। 0.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर नसबंदी द्वारा भेदभाव मीडिया की बाँझपन सुनिश्चित किया जाना चाहिए। त्वचा बायोप्सी से लेकर एचआईपीएस-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स तक पूरे प्रोटोकॉल में कई महीने लगते हैं, लेकिन प्रक्रिया के अलग-अलग चरणों में कोशिकाओं को फ्रीज करना संभव है। फाइब्रोब्लास्ट्स, चयनित एचपीएससी क्लोन, और प्रोलिफेरेटिव नेफ्रॉन पूर्वज कोशिकाएं नेफ्रॉन पूर्वज भेदभाव माध्यम में 7 दिनों के बाद जमे हुए हो सकते हैं, और एक कामकाजी सेल बैंक उत्पन्न किया जा सकता है।

भले ही एचआईपीएस-व्युत्पन्न स्वस्थ पोडोसाइट्स प्राथमिक और माध्यमिक पैर प्रक्रियाओं (चित्रा 5 ए, बी) का एक अलग नेटवर्क विकसित करते हैं और विशिष्ट पोडोसाइट-विशिष्ट मार्कर (चित्रा 6 ए-सी) व्यक्त करते हैं, विशिष्ट स्लिट डायाफ्राम, जैसा कि विवो में देखा गया है, शास्त्रीय दो-आयामी सेल संस्कृति मॉडल में नकल करना मुश्किल है। इसके अलावा, इस मोनो-कल्चर सेटिंग में अन्य ग्लोमेरुलर सेल प्रकारों के साथ इंटरसेल संचार संभव नहीं है।

उनके टर्मिनल विभेदित स्थिति और प्रसार क्षमता की कमी के कारण, पोडोसाइट्स एक्स विवो का अध्ययन करना मुश्किल है। सशर्त रूप से अमर प्राथमिक पोडोसाइट्स की मदद से, थर्मोसेंसिटिव स्विच के सम्मिलन द्वारा इस सीमा को दूर करना संभव है, जिसके परिणामस्वरूप एक सेल कल्चर मॉडल होता है जहां कोशिकाएं 33 डिग्री सेल्सियस पर प्रसार करती हैं और 37 डिग्री सेल्सियस13,14 पर अंतर करती हैं। यद्यपि इन सिपोडोसाइट्स में पोडोसाइट्स अनुसंधान के लिए उच्च क्षमता है, लेकिन सीमाएं हैं, जैसे मार्कर अभिव्यक्ति की कमी, विभेदित आकृति विज्ञान, और पैर प्रक्रियाओं को बनाने में विफलता15,16।

रोगी-व्युत्पन्न दैहिक कोशिकाओं से पोडोसाइट्स का भेदभाव स्वस्थ नियंत्रण कोशिकाओं के साथ रोगग्रस्त पोडोसाइट्स की पीढ़ी और तुलना को सक्षम बनाता है। यह हमें पोडोसाइट्स-विशिष्ट जीन में उत्परिवर्तन के कारण पोडोसाइट्स क्षति का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, HIPSC के साथ काम करने से त्रि-आयामी सेल कल्चर रोग मॉडल, या बल्कि ऑर्गेनोइड्स43,44 बनाने की क्षमता है। ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं या मेसांगियल कोशिकाओं जैसे अन्य ग्लोमेरुलर कोशिकाओं के साथ एचआईपीएस-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स की सह-संस्कृति, स्वास्थ्य और ग्लोमेरुलर रोग में इंटरसेल संचार के बारे में नई अंतर्दृष्टि पैदा कर सकती है।

इसके अलावा, रोगी-विशिष्ट पोडोसाइट्स के लक्षण वर्णन और उपचार को उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण में पूर्व विवो किया जा सकता है। व्यक्तिगत दृष्टिकोण विशिष्ट उत्परिवर्तन के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्यों की जांच करने और भविष्य में व्यक्तिगत चिकित्सा करने का अवसर खोलता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को फ्रेडरिक-अलेक्जेंडर विश्वविद्यालय एर्लांगेन-नुर्नबर्ग के इंटरडिसिप्लिनरी सेंटर फॉर क्लिनिकल रिसर्च (आईजेडकेएफ) द्वारा जेनिना मुलर-डेली को दिए गए अनुदान संख्या एम 4-आईजेडकेएफ-एफ 009 के साथ वित्त पोषित किया गया था, और बुंडेसमिनिस्टरियम फर बिलडुंग एंड फोर्सचुंग (बीएमबीएफ) द्वारा परियोजना नाम के तहत स्टॉप-एफएसजीएस-स्पीड ट्रांसलेशन-ओरिएंटेड प्रोग्रेस टू ट्रीट एफएसजीएस, अनुदान संख्या 01जीएम 2202 डी को दिया गया था। हम एसईएम छवियों को लेने में समर्थन के लिए एनालेना क्रॉस को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm sterile filter Rotilab P668.1 for sterilization of differentiation medium
all-trans retinoic acid Stem Cell Technologies 72262 supplement for differentiation
B27 supplement (50 x), serum free Gibco 17504044 supplement for serum-free differentiation medium
BG iMatrix-511 Silk biogems RL511S additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture
Bovine serum albumin (BSA)  Roth 8076.4
CELLSTAR Filter Cap Cell Culture Flasks, T75, 250 mL Greiner bio-one 82050-856 cell culture plastics suitable for fibroblast culture
CHIR99021 (5 mg) Sigma-Aldrich 252917-06-9  supplement for differentiation
Corning Matrigel hESC qualified matrix  Corning 354277 additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture (solubilized basement membrane matrix)
countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10283 to count cells
countess II FL  Automated Cell Counter Invitrogen to count cells
cryoPure tubes, 2 ml, QuickSeal screw cap, white Sarstedt 72380 cryovials for freezing of cells
dimethyl sulfoxide (DMSO)  Roth A994.1 for fibroblast freezing medium
DMEM/F12 (1:1) (1 x) Gibco 11320074 basic medium for differentiation
DMEM/F12 + Glutamax Gibco 10565018 basic medium for fibroblast medium
EVOS M5000 Imaging System Thermo Fisher Scientific AMF5000 phase contrast microscope
fetal bovine serum premium, inactivated (FCS) PAN Biotech P301902 serum for fibroblast medium, fibroblast freezing medium and podocyte maintenance medium
fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm gap, 800 µL capacity, sterile Fisherbrand FB104 cuvette used for electroporation/episomal reprogramming of fibroblasts (4mm gap)
fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI Invitrogen 00-4959-52 mounting medium containing dapi
gauge needle (0.6 x 30 mm) BD Microlance3 300700 for separation of hiPSC colonies into small pieces
human Recombinant Activin A Protein 78001.1 Stem cell technologies supplement for differentiation
human recombinant bone morphogenetic protein 7 (BMP7) Peprotech 120-03P supplement for differentiation
human VEGF-165 Recombinant Protein Thermo Scientific PHC9394 supplement for differentiation
insulin-transferrin-selenium (ITS -G) (100 x) Gibco 41400045 supplement for podocyte maintenance medium
LB medium Roth X964.1 for sterility test of hiPSC culture
lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit Sigma Aldrich MP0035-1KT commercial mycoplasma detection kit
microscope slides Diagonal GmbH & Co.KG 21,102
microtube 1.5 mL  Sarstedt 72706400
mTeSR1 Complete Kit Stem Cell Technologies 85850 basic medium for serum-free hiPSC culture medium
nalgene freezing container Mr.Frosty Roth AC96.1  to ensure optimal freezing conditions
normal goat serum abcam ab 7481 for preincubation solution and antibody diluent
nunc 24 well plates Thermo Scientific 142485 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc 48 well plates  Thermo Scientific 152640 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc 6 well plates  Thermo Scientific 140685 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc EasYDish Dishes 100 mm Thermo Scientific 150466 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate Thermo Scientific 167008 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nutriFreez D10 Cryopreservation Medium Sartorius 05-713-1E  serum-free cryopreservation medium for cryopreservation of hiPSC and nephron progenitor cells
Opti-MEM Gibco 11058021 electroporation medium 
pCXLE-hMLN Addgene #27079 plasmid for episomal reprogramming
pCXLE-hOCT3/4 plasmid Addgene #27077 plasmid for episomal reprogramming
pCXLE-hSK plasmid Addgene #27078 plasmid for episomal reprogramming
penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich P4333-100ML to avoid bacterial contamination
plastic coverslips Sarstedt   83.1840.002 for immunofluorescent stainings of hiPSCs and hiPSC-derived podocytes
ROTI Histofix Roth P087.3 commercial paraformaldehyde (4 %) for fixation of cells
RPMI 1640 + L-Glutamine Gibco 21875034 basic medium for podocyte maintenance medium
staining chamber StainTray Black lid Roth HA51.1
stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco A1110501 enzymatic cell detachment solution used for dissociation of hiPSCs
sterile phosphate buffered saline (PBS) (1 x) Gibco 14190094 used for washing and coating
sterile water Roth T1432
syringe without needle 20 mL BD Plastipak 300629 to filter sterilize differentiation medium
TC dish 100 mm Sarstedt 8,33,902 sterile cell culture plastics used for cutting the skin biopsy and fibroblast culture
TC dish 35 mm Sarstedt 8,33,900 sterile cell culture plastics used for outgrowing fibroblasts from skin biopsy
triton X 100 Roth 3051.3 for preincubation solution 
trypan Blue Stain (0.4 %) for use with the Countess Automated Cell Counter Invitrogen T10282 to count cells
trypsin-EDTA (10 x)  Biowest X0930-100 dissociation reagent used for fibroblasts and nephron progenitor cells
tube 15 mL Greiner bio-one 188271-N
tube 50 mL Greiner bio-one 227261
vitronectin ACF Sartorius 05-754-0002 extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture
Y-27632 dihydrochloride (10 mg) Tocris 1254 to avoid apoptosis of hiPSCs during splitting
Primary antibodies
OCT4  Stem Cell Technologies 60093.1 pluripotency marker, dilution 1:200
SSEA-4 Stem Cell Technologies 60062FI.1 pluripotency marker, dilution 1:100
Ki67 Abcam ab15580 proliferation marker, dilution 1:300
synaptopodin Proteintech 21064-1-AP podocyte-specific marker, dilution 1:200
nephrin Progen GP-N2 podocyte-specific marker, dilution 1:25
podocin proteintech 20384-1-AP podocyte-specific marker, dilution 1:100
Secondary antibodies
goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21435 secondary anditbody, dilution 1:1000
alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, highly cross-adsorbed Invitrogen A31634 secondary anditbody, dilution 1:1000
donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A21206 secondary anditbody, dilution 1:1000
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21422 secondary anditbody, dilution 1:1000
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 secondary anditbody, dilution 1:1000

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References

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त्वचा बायोप्सी से रोगी-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स की पीढ़ी
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Rose, V., Müller-Deile, J.… More

Rose, V., Müller-Deile, J. Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies. J. Vis. Exp. (195), e65364, doi:10.3791/65364 (2023).

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