Summary
この原稿では、ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)へのエピソームリプログラミングとその後のポドサイトへの分化 を介して 、皮膚線維芽細胞から患者固有のポドサイトを生成するための2段階のプロトコルについて説明しています。
Abstract
足細胞は、糸球体濾過バリアの尿部位に位置する上皮細胞であり、糸球体の選択的フィルター機能に寄与する。足細胞特異的遺伝子の変異は、限局性分節性糸球体硬化症(FSGS)を引き起こす可能性があり、足細胞は他の多くの原発性および二次性腎症でも影響を受けます。分化した性質のため、初代細胞培養モデルは足細胞には限られています。したがって、一般的に条件付きで不死化された細胞が使用されます。しかし、これらの条件付き不死化足細胞(ciPodocytes)にはいくつかの制限があります:細胞は培養中に脱分化する可能性があり、特にコンフルエントに達すると、いくつかの足細胞特異的マーカーはわずかにしか発現しないか、まったく発現しません。これにより、ciPodocytesの使用と、生理学的、病態生理学的、および臨床的リーチへのそれらの適用性が疑問視されます。ここでは、皮膚パンチ生検から皮膚線維芽細胞をiPS細胞にエピソームリプログラミングし、その後ポドサイトへと分化させることで、患者特異的ポドサイトを含むヒトポドサイトを作製するためのプロトコルについて述べる。これらの足細胞は、足突起の発達や足細胞特異的マーカーの発現などの形態学的特徴の点で、 in vivo 足細胞にはるかによく似ています。最後に、しかし重要なことに、これらの細胞は患者の突然変異を維持し、個別のアプローチで足細胞疾患と潜在的な治療物質を研究するための改良された ex vivo モデルをもたらします。
Introduction
足細胞は、糸球体基底膜(GBM)、糸球体内皮細胞、およびグリコカリックスとともに腎臓の糸球体濾過バリアを形成する特殊な有糸分裂後腎上皮細胞です。表現型的には、足細胞は細胞体と一次微小管駆動膜伸長、および足突起と呼ばれる二次伸長で構成されています1,2。血液から尿をろ過する糸球体濾過バリアは、開窓内皮、GBM、およびポドクティのスリット横隔膜と呼ばれる隣接するポドサイトの足突起を接続する特殊なタイプの細胞間接合部で構成されています3。健康な条件下では、アルブミンよりも大きいタンパク質は、そのサイズと電荷のためにろ過バリアから保持されます4。
細胞骨格細胞またはポドサイト特異的遺伝子の変異、およびポドサイトシグナル伝達経路に影響を与える循環因子は、ポドサイトの消失、剥離、またはアポトーシスを誘発し、タンパク尿および糸球体硬化症を引き起こすことが知られています。特に、細胞骨格の再配列、足細胞の極性の変化、またはスリット接合の関連する喪失を伴う足突起の損傷は極めて重要です5。それらの最終分化状態のために、足細胞はGBMの剥離後にほとんど置換することができない。しかし、足細胞がGBMに付着している場合でも、それらは消失から回復し、足の突起を改革することができます6,7,8。さまざまな糸球体障害における足細胞損傷につながるイベントのさらなる理解は、これらの疾患の治療法の開発に役立つ新しい治療標的を提供する可能性があります。足球損傷は、限局性分節性糸球体硬化症(FSGS)、糖尿病性腎症、微小変化疾患、膜性糸球体腎症などのさまざまな糸球体疾患の特徴であり、これらの疾患の病理学的メカニズムと潜在的な治療アプローチを研究するために信頼性の高い足球ex vivoモデルが必要です9,10。足細胞は、示差ふるい11による糸球体の単離に基づく古典的な初代細胞培養によってex vivoで研究することができる。しかし、増殖能力が制限された最終分化状態のため、ほとんどの研究者は、SV40大型T抗原の温度感受性変異体を発現するマウスまたはヒトciPodocyte細胞株を使用しています。あるいは、ciPodocytesは、SV40 Tag不死化遺伝子1,12を保持するトランスジェニックマウスから単離される。
CiPodocytesは33°Cで増殖するが、増殖停止に入り、37°Cで分化を開始する13,14。これらの細胞で得られた実験データは、細胞が不自然な遺伝子挿入15を使用して生成されるため、特定の注意を払って解釈する必要があることに留意する必要があります。これらの細胞は不死化遺伝子を持っているため、進行中の増殖のために細胞生理機能が変化します12。マウス、ヒト、ラットのciPodocサイトは、糸球体発現と比較して、タンパク質レベルでシナプトポジンとネフリン、mRNAレベルでNPHS1とNPHS2の発現が5%未満であるため、このアプローチによって生成されたポドサイト細胞株が最近疑問視されています16。さらに、ほとんどの足細胞細胞株はネフリン17、18を発現しない。Chittiprolらはまた、ciPodocytesにおける細胞運動性およびピューロマイシンおよびドキソルビシンに対する応答における有意差を記載した16。足細胞は、異なる糸球体疾患においてGBMから剥離した後の尿中に見出すことができる19,20,21,22。生存可能な尿中足細胞は、最大2〜3週間エクスビボで培養できますが、ほとんどの細胞はアポトーシスを起こします23,24。興味深いことに、足細胞は糸球体疾患患者の尿だけでなく、健康な被験者の尿にも見られ、おそらく老化しているときに見られます-培養での複製の可能性は限られています24。さらに、尿由来ポドサイト数は限られており、細胞は培養中に脱分化し、足突起が少なく、形態が変化し、そして最も重要なことに増殖能力が制限されています。ポドサイト特異的遺伝子の発現は存在しないか、数週間以内に消失するか、またはこれらの細胞クローン間で変化する。ポドサイト特異的マーカー陽性のいくつかの細胞は、尿細管上皮細胞または筋線維芽細胞とメサンギウム細胞のマーカーを共発現し、これは培養尿中ポドサイトの脱分化および/または分化形質転換を示唆している24,25。
最近、熱感受性SV40大型T抗原とhTERTによる形質導入による患者および健常ボランティアの尿に由来するciPodocite細胞株の作製が記載されている26。シナプトポジン、ネスチン、およびCD2関連タンパク質のmRNA発現は検出されましたが、ポドシンmRNAはすべてのクローンに存在しませんでした。尿足細胞の問題に加えて、これらの細胞には挿入された不死化遺伝子も含まれているため、上記の欠点が生じます。
対照的に、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)は、適切な条件下で自己複製し、複数の細胞型に分化する巨大な能力を持っています。hiPS細胞が足細胞のほぼ無制限の供給源として働くことができることは以前に示されました27,28。
ここでは、皮膚パンチ生検の皮膚線維芽細胞から患者固有の足細胞を生成し、その後のエピソームリプログラミングをhiPS細胞に再プログラミングし、最終的にhiPS細胞由来足細胞に分化させるための2段階のプロトコルについて説明します(図1)。
図1:患者特異的なiPS細胞由来足細胞を作製するためのプロトコル。 hiPS細胞へのリプログラミングとポドサイトへの分化により、皮膚生検の皮膚線維芽細胞から患者固有のポドサイトを生成するためのプロトコルのグラフィカルな概要。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
最初のステップとして、皮膚パンチ生検から体細胞線維芽細胞を増殖させ、転写因子OCT3/4、KLF4、SOX2、およびc-MYC29、30、31を発現するプラスミドとのエレクトロポレーションによる統合フリー法を使用してhiPS細胞に再プログラムしました。生じたhiPSCコロニーを引き続き選択し、拡大した。分化は、WNTシグナル伝達経路の活性化による中胚葉系譜の誘導から始まり、その後、まだ増殖できるネフロン前駆細胞の生成が続きました。最後に、細胞を足細胞に分化させた。この手順では、Bangら32および沖田らによるhiPS細胞生成のためのエピソームリプログラミングのための以前に公開されたプロトコル、およびMusahらによるiPS細胞を足細胞に分化させるためのプロトコル28,34,35を修正および組み合わせました。
実際、私たちのプロトコルによって生成された足細胞は、一次および二次足突起の明確なネットワークの開発と、シナプトポジン、ポドシン、ネフリンなどの足細胞特異的マーカーの発現に関して、 in vivoでポドサイトに近い表現型を持っていました。hiPS細胞由来の足細胞を使用すると、患者の遺伝的背景はリプログラミングおよび分化中に維持されます。これにより、患者固有の足細胞疾患モデリングと、ほぼ無制限の細胞数での潜在的な治療薬のex vivo での発見が可能になります。さらに、このプロトコルは低侵襲で、費用効果が高く、倫理的に受け入れられ、医薬品開発の新しい道を促進する可能性があります。
Protocol
プロトコルは、フリードリヒアレクサンダー大学エアランゲンニュルンベルク(251_18B)の倫理委員会によって承認され、すべての患者と発端者が書面による同意を与えました。すべての実験は、関連するガイドラインおよび規制に従って実施した。ここで使用するすべての培地および溶液の構成については 、表1を参照してください。
1.皮膚パンチ生検による皮膚線維芽細胞の増殖
- 皮膚パンチ生検を、10 mLの予熱した線維芽細胞培地を含む滅菌15 mLの円錐管に移します。
- 培地を取り出し、皮膚パンチ生検を滅菌済みの予熱した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)5 mLで3回洗浄します。滅菌鉗子による皮膚パンチ生検を10cmの細胞培養プレートに移し、滅菌メスで幅方向に3〜4個に切断し、表皮と真皮を残します。
- 各ピースを滅菌済みの35 mmプラスチック細胞培養皿に移し、培養皿に軽く押し付けます。生検片の周りの余分な培地を取り除きます。液体が蒸発し、生検が細胞培養プラスチックに付着するまで、5〜10分間乾燥させます。
- 生検の周りに1,000 μLのピペットで1 mLの線維芽細胞培地を滴下し、最終容量3 mLまで注意深く充填します。37°C、5%CO2 で7日間、皿に餌を与えたり動かしたりすることなく培養する。培地を新鮮で予熱した線維芽細胞培地に慎重に交換します。7日後、成長した紡錘状線維芽細胞は、位相差顕微鏡36を用いて皮膚生検の周囲をモニターすることができる。
注意: 成長した線維芽細胞が皿の縁に到達したら、手順1.3から再度進んで線維芽細胞の別のバッチを生成します。 - 成長した線維芽細胞を拡張するには、2 mLの予熱した1x PBSで洗浄し、線維芽細胞を1 mLの1xトリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)で解離させ、37°C、5%CO2で5分間インキュベートします。剥離した細胞を15 mLのコニカルチューブに移し、2 mLの新鮮な予温した線維芽細胞培地で細胞培養皿を洗浄します。
- 洗浄媒体をチューブにプールして解離剤を中和し、遠心分離機を200 x gで20°Cで5分間行います。 上清を吸引し、細胞ペレットを1 mLの新鮮な予温した線維芽細胞培地で再懸濁します。トリパンブルーを使用してノイバウアーチャンバーまたは自動セルカウンターで細胞をカウントし、新鮮な細胞培養フラスコに2.5 x 10 3〜5 x 103線維芽細胞を1cm2ずつシードします。
- フラスコをインキュベーターに戻し、フラスコを各方向に3回動かして細胞を均等に分配します。翌日、培地を新鮮で温めた線維芽細胞培地と交換します。 週に2回培地を交換し、線維芽細胞が約80%のコンフルエントに達したら分割します。
2.凍結皮膚線維芽細胞
- 線維芽細胞を凍結するには、5 mLの予熱した1x PBSで洗浄します。PBSを吸引し、線維芽細胞を4 mLの1xトリプシン-EDTAで解離させます。フラスコをインキュベーターに戻し、5%CO2で37°Cで5〜7分間インキュベートします。位相差顕微鏡を使用して剥離を監視し、フラスコの側面を軽くたたいて細胞を剥離します。
- 剥離した細胞を15 mLコニカルチューブに移します。細胞培養フラスコを、5 mLの新鮮な予熱した線維芽細胞培地で洗浄します。洗浄媒体をコニカルチューブにプールし、200 x g で20°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、細胞ペレットを2 mLの新鮮な予熱した線維芽細胞培地で再懸濁します。細胞を数え、1 x 106 個の細胞を新しい円錐形のチューブに移します。200 x g で20°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、90%ウシ胎児血清および10%ジメチルスルホキシド(DMSO)からなる1mLの冷線維芽細胞凍結培地で細胞ペレットを再懸濁します。クライオバイアルに移し、冷凍容器に入れ、-80°Cで一晩凍結します。 長期保存の場合は、翌日クライオバイアルを液体窒素タンクに入れます。
3. 線維芽細胞のエピソームリプログラミングによるhiPS細胞生成
- エピソームリプログラミングには、継代4から8までの1.5 x 106 線維芽細胞を使用します。この細胞数に達するには、約70%のコンフルエントで2〜3個の250 mLフラスコを使用します。
- 再プログラミングの前日に、線維芽細胞を1:2の比率に分割して増殖状態を確保します。したがって、培地を吸引し、フラスコあたり5 mLの予熱した1x PBSでフラスコを洗浄します。PBSを吸引し、線維芽細胞を4 mLの1xトリプシン-EDTAで解離させます。フラスコをインキュベーターに戻し、37°Cおよび5%CO2で5〜7分間インキュベートします。位相差顕微鏡を使用して剥離を監視し、フラスコの側面を軽くたたいて、プラスチック表面から細胞を剥離します。
- 剥離した細胞を50 mLのコニカルチューブに移し、5 mLの新鮮な予温した線維芽細胞培地で細胞培養フラスコを洗浄します。洗浄媒体をコニカルチューブにプールし、200 x g で20°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、細胞ペレットを6 mLの新鮮な予熱した線維芽細胞培地に再懸濁します。
- フラスコあたり5 mLの新鮮な予熱された線維芽細胞培地を加えて、6つの新しい細胞培養フラスコを準備します。線維芽細胞懸濁液1 mLを各フラスコに加えます。フラスコをインキュベーターに戻し、フラスコを各方向に3回動かして細胞を均等に分配します。
- エピソームリプログラミングの場合は、hiPS細胞培養に適した10 cm細胞培養プレート2枚を、プレートあたり4 mLのコールドコーティング溶液でコーティングします。プレートを37°Cで1時間インキュベートします。
注:hiPS細胞を培養するには、異なる細胞培養プラスチックと追加の細胞外マトリックスコーティングが必要です(材料表を参照)。 - 線維芽細胞から培地を取り除き、フラスコあたり10 mLの予熱した1x PBSで洗浄します。PBSを吸引し、37°Cで5〜7分間インキュベートすることにより、フラスコあたり4 mLの1xトリプシン-EDTAで線維芽細胞を解離させます。 位相差顕微鏡を使用して剥離を監視し、必要に応じてフラスコの側面を軽くたたいて、プラスチック表面から細胞を剥離します。
- 剥離した細胞を50 mLコニカルチューブに移します。空のフラスコを6 mLの予熱した線維芽細胞培地で洗浄し、残りの細胞を回収し、円錐管にプールします。200 x g で20°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、細胞ペレットを3 mLの新鮮な予熱した1x PBSに再懸濁します。
- 細胞を数え、1.5 x 106 線維芽細胞を新しい円錐管に移します。200 x g で20°Cで5分間遠心分離します。 上清を捨て、細胞ペレットを5 mLのエレクトロポレーション培地に再懸濁し、再度遠心分離します。その間に、コーティングした10 cm細胞培養プレートからコーティング溶液を吸引し、予熱した線維芽細胞培地7 mLを加えます。
- 遠心分離後、上清を捨て、細胞ペレットを250 μL中の1.5 x 106細胞の濃度のエレクトロポレーション培地に再懸濁します。 250 μLの細胞懸濁液を、ギャップ距離4 mmのエレクトロポレーションキュベットに移します(材料の表を参照)。
- 各プラスミド(pCXLE-hOCT3/4、pCXLE-hSK、pCXLE-hMLN)を総容量50 μLのエレクトロポレーション培地に4 μg添加して、プラスミドトランスフェクションミックスを調製します。キュベットに移し、軽くフリックして混ぜます。280 Vで1パルスでエレクトロポレーションします。
- 滅菌ハサミを使用してピペットチップを切断し、125 μLのエレクトロポレーション線維芽細胞を調製した10 cm細胞培養プレートのそれぞれに移します。プレートを全方向に3回攪拌して細胞を分配し、インキュベーターに戻します。37°Cで5%CO2 で一晩インキュベートします。
- 死細胞を除去するには、翌日、培地を7 mLの新鮮な予熱した線維芽細胞培地と交換します。 エレクトロポレーションの2日後に培地をhiPSC培地に変更し、その後20日間は1日おきに交換します。
4. 生成したヒジPS細胞の選定・増設・品質管理
- エレクトロポレーション後のhiPSCコロニーの形成を観察するために、10倍または20倍の対物レンズを備えた位相差顕微鏡を使用して、少なくとも20日間細胞を毎日監視します。hiPSCコロニーのサイズが直径約300 μmで境界がはっきりしていて、hiPSCが高い核対体比を示す場合、hiPSCコロニーはピックによって選択することができます(図2B、C、および図3)。
- ピッキングの前に、hiPSC培養に適した96ウェルプレートにウェルあたり100 μLのコーティング溶液をコーティングし、37°Cで1時間インキュベートします。 インキュベーション中に、細胞培養皿の底にある目的のコロニーをペンでマークします。96ウェルプレートの最終調製のために、コーティング溶液を取り出し、10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む100 μLの予熱したhiPS細胞培養液を各ウェルに加えます。
- 細胞を予温した1x PBSで洗浄し、10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む新鮮な予熱したhiPSc培養液を加えてから、死細胞を除去します。hiPSCコロニーをピックするには、ゲージ針を使用し、各コロニーにグリッドを描画してhiPSCコロニーを細かく分割します。
- 位相差顕微鏡を使用して、コロニーが正常に断片に分割されていることを確認します。それらを100 μLピペットで調製した96ウェルプレートに移します。細胞に触れずにピペットをコロニーの上に直立させて、コロニーの引っかき傷や損失を防ぎます。
- 96ウェルプレートを5%CO2 を含む37°Cのインキュベーターに入れ、細胞を乱すことなく一晩付着させます。ピッキングがうまくいかない場合に備えて、線維芽細胞とhiPSCを混ぜた皿を保管してください。したがって、培地をhiPSc培地に変更してROCK阻害剤Y27632を除去し、プレートをインキュベーターに戻します。
- 翌日、96ウェルプレートの培地を200 μLの新鮮なhiPS細胞培養培地に交換し、1日おきに交換します。翌日、96ウェルプレートを監視し、正常にピックされたクローンでウェルにマークを付けます。
注:ピックされたhiPSCクローンが最初の試行後に完全に選択されず、線維芽細胞がウェルで見つかった場合は、96ウェルからピッキングを繰り返すか、線維芽細胞をプレートからこすり落とします。
5. 選択されたhiPS細胞クローンの拡張
- 位相差顕微鏡を用いてhiPSCクローンをモニタリングする。選択したhiPS細胞が約70%のコンフルエント性に達すると、hiPSCクローンは増殖の準備が整います。
- hiPSC培養に適した48ウェルプレートに、ウェルあたり250 μLのコーティング溶液を37°Cで1時間コーティングします。 コーティング溶液を、10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む200 μLの新鮮な予熱したhiPS細胞培養液と交換します。
- 96ウェルプレートからhiPS細胞を取り外すには、1,000 μLのピペットチップでプラスチック表面をこすります。剥離したhiPS細胞を96ウェルプレートから48ウェルプレートに移します。翌日、培地を新鮮な予熱したhiPS細胞培養培地に変更し、死細胞とROCK阻害剤Y27632を除去します。
- hiPSCクローンが約70%のコンフルエンシーに達したら、hiPSCを24ウェルプレートに移します。そのため、hiPSC培養に適した24ウェルプレートに、1ウェルあたり400 μLのコーティング溶液を37°Cで1時間コーティングします。 コーティング溶液を、10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む400 μLの新鮮な予熱したhiPS細胞培養液と交換します。 48ウェルから培地を吸引し、500 μLの予熱した1x PBSで洗浄します。
- PBSを10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む100 μLの酵素細胞剥離溶液に交換し、37°Cで4分間インキュベートします。1,000 μLのピペットを使用してプレートからhiPS細胞を洗い流します。解離した細胞を15 mLコニカルチューブに移します。空の48ウェルプレートを10 μM ROCK阻害剤Y27632を含むhiPSC培地で洗浄し、円錐管にプールします。
- 200 x g で20°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む1 mLのhiPS細胞培養液にhiPS細胞を再懸濁し、24ウェルプレートに移します。プレートを5%CO2 で37°Cのインキュベーターに入れ、プレートを全方向に3回撹拌して細胞を分配する。細胞を邪魔することなく一晩付着させます。
- 翌日、ROCK阻害剤Y27632を含まないhiPS細胞培地に培地交換します。
注:hiPSCクローンが約70%のコンフルエントに達したら、手順5.4から5.7を繰り返し、12ウェルフォーマットに適した容量を増やして、hiPS細胞を12ウェルプレートに移します。12ウェルプレートからのhiPS細胞が約70%のコンフルエンシーに達したら、hiPSCクローンを6ウェルフォーマット用に容量を増やした6ウェルプレートに移します。
6. 選択したhiPS細胞クローンの凍結
- 選択したhiPSCクローンを凍結するには、6ウェルプレートから培地を吸引します。2 mLの1x PBSでウェルを洗浄します。10 μM Y27632を含む1 mLの酵素細胞剥離溶液でhiPS細胞を吸引し、解離します。プレートをインキュベーターに戻し、37°Cおよび5%CO2で4分間インキュベートします。
- 1,000 μLのピペットを使用してプレートからhiPS細胞を洗い流し、剥離した細胞を15 mLのコニカルチューブに移します。10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む2 mLの新鮮な予熱したhiPS細胞培養液でプレートを洗浄します。コニカルチューブにプールし、200 x g で20°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む2 mLの新鮮な予熱したhiPS細胞培養培地で細胞ペレットを再懸濁します。
- 細胞を数え、1 x 106 個の細胞を新しい円錐形のチューブに移します。200 x g で20°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、細胞ペレットを1 mLの冷無血清hiPSC凍結培地に再懸濁し、凍結容器を用いて-80°Cで一晩凍結した。 長期保存の場合は、翌日クライオバイアルを液体窒素タンクに入れます。
7. HiPS細胞の品質管理
- ヒジPS細胞形態のキャラクタリゼーション
- 20倍対物レンズの位相差顕微鏡を用いて特徴的なhiPSC形態を確認します。リプログラミング後、細胞形態は長い紡錘体状の線維芽細胞から小さな丸いhiPS細胞に変化し、明確な境界を持つコロニーで高い核対体比が成長します(図2C)。
- hiPSCコロニーが密になりすぎて自発的な分化が起こる場合は、ピペットチップを使用して分化した部分をプレートからこすり落とします(図3)。hiPS細胞は増殖率が高いため、hiPSC培養物には、新鮮で予熱したhiPSC供給培地を毎日給餌してください。
- 免疫蛍光染色による多能性マーカーの特性評価
- 生成されたhiPSCの多能性マーカーを免疫蛍光染色で確認するには、プラスチック製カバーガラスを24ウェルプレートに入れ、250 μLのコーティング溶液で37°C、5%CO2で1時間コーティングします。コーティング溶液を、10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む1 mLの予熱したhiPS細胞培養液と交換します。
- 24ウェルあたり1.9 x 104 個の解離したhiPS細胞をシードします。hiPS細胞を37°C、5%CO2 で一晩、乱すことなく取り付けます。hiPS細胞の解離については、手順5.4から5.6を参照してください。翌日、ROCK阻害剤Y27632を含まないhiPS細胞培地と培地を交換します。
- 染色するには、予熱した1 mLの1x PBSで細胞を洗浄し、続いてhiPS細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で10分間固定します。固定したhiPS細胞を1x PBSで洗浄し、ウェルあたり200 μLのプレインキュベーション溶液で室温で1時間、非特異的結合部位をブロックします。一次抗体Ki67(1:300)、OCT3/4(1:200)、SSEA4(1:100)を抗体希釈液で希釈します。
- 70%エタノールでプラスチックホイルをきれいにし、貯水池で満たされた染色室に入れます。30 μLの一次抗体希釈液の液滴をホイル上に置きます。固定サンプルを逆さまにして希釈液に入れ、4°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、サンプルを1x PBSで5分間3回洗浄し、30 μLの二次抗体希釈液(1:1,000)をホイルのきれいな場所に置きます。カバースライドを逆さまにして希釈液に入れます。暗所で室温で1時間インキュベートします。
- インキュベーション後、1x PBSで5分間3回洗浄します。DAPIを含む封入剤のスライドガラスにサンプルをマウントします。室温および暗所で一晩乾燥させ、共焦点顕微鏡を使用してサンプルを画像化します(図4)。
- 細菌とマイコプラズマ汚染の排除
- 細菌汚染を排除するために、500 μLの解離したhiPS細胞を5 mLの予熱したルリア・ベルターニ(LB)培地に移します。hiPS細胞の解離については、手順5.4から5.6を参照してください。37°Cで一晩インキュベートします。 LB培地が濁っているように見える場合は、細菌汚染が発生している可能性があります。セルを破棄します。
- マイコプラズマ汚染を排除するには、約90%のコンフルエントなhiPS細胞を含む6つのウェルから2日間交換されていない培地を収集します。定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を使用して、マイコプラズマ汚染を検出します。この目的のために、多くの市販のマイコプラズマ検出キットが入手可能です。
8. ヒプ細胞から足細胞への分化
- 成長因子の調製と保管
- ストック濃度10 mM Y27632を調製するには、3.12 mLの滅菌水中で10 mgのY27632(分子量320.26 g / mol)を再構成します。100 μLアリコートを-20°Cで保存し、細胞培養培地で1:1,000に希釈して最終濃度10 μMにします。
- 30 mM CHIR99021のストック濃度を調製するには、358.2 μLの滅菌DMSOで5 mgのCHIR99021(分子量465.34 g / mol)を再構成します。50 μLのアリコートを-20°Cで保存し、細胞培養培地で1:10,000に希釈して最終濃度3 μMにします。
- 100 μg/mLのアクチビンAのストック濃度を調製するには、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含む1x PBSの1 mL中に100 μgのアクチビンAを再構成します。100 μLのアリコートを-20°Cで保存し、細胞培養培地で1:2,000に希釈して、最終濃度50 ng/mLにします。
- 100 μg/mLのストック濃度の骨形態形成タンパク質7(BMP7)を調製するには、0.1%BSAを含む1 mLの滅菌水中で100 μgのBMP7を再構成します。100 μLのアリコートを-20°Cで保存し、細胞培養培地で1:2,000に希釈して、最終濃度50 ng/mLにします。
- 100 μg/mLの血管内皮増殖因子(VEGF)のストック濃度を調製するには、1 mLの滅菌水中で100 μgのVEGFを再構成します。100 μLアリコートを-20°Cで保存し、細胞培養培地で1:4,000に希釈して、最終濃度25 ng/mLにします。
- 10 mMのストック濃度のオールトランスレチノイン酸を調製するには、10 mgのオールトランスレチノイン酸を3.33 mLの滅菌DMSOで再構成します。100 μLアリコートを-20°Cで保存し、細胞培養培地で1:100に希釈して最終濃度0.5 μMにします。
- 中胚葉系譜を誘導するWNTシグナル伝達経路の活性化
- hiPSCをhiPS細胞由来ポドサイトへ分化させるには、hiPS細胞培養に適した細胞培養プレートまたはフラスコをコーティング溶液で37°C、5%CO2で1時間コーティングします。コーティング溶液の総容量は、6ウェル培養プレートあたり1 mL、または10 cm細胞培養プレートあたり4 mLです。
- 培地を吸引し、予熱した1x PBSでhiPS細胞を洗浄します。PBSを吸引し、10 μM Y27632を含む酵素細胞剥離溶液を、6ウェル培養プレートあたり1 mLまたは10 cm細胞培養プレートあたり4 mLの総容量で加えます。
- プレートをインキュベーターに戻し、37°Cおよび5%CO2で4分間インキュベートします。1,000 μLのピペットを使用してプレートからhiPS細胞を洗い流します。剥離したセルを円錐管に移します。
- 10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む新鮮な予熱したhiPS細胞培養液でプレートを洗浄します。洗浄媒体をコニカルチューブにプールして、解離試薬を中和します。200 x g で20°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む2 mLの新鮮な予熱したhiPS細胞培養培地で細胞ペレットを再懸濁します。
- 細胞を数え、1 x 104 hiPSC / cm2をシードします。全方向に3回攪拌して細胞を分配する。hiPS細胞を5%CO2 で37°Cで一晩、乱すことなく取り付けます。
- 翌日、培地を、1x B27サプリメント、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、3 μM CHIR99021、50 ng / mLアクチビンA、および10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む2 mLの予熱した中胚葉分化培地と交換します。
- ネフロン前駆細胞への分化
- 2日後、中胚葉培地を、1xB27サプリメント、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、3 μM CHIR99021、50 ng/mLアクチビンA、および50 ng/mL BMP7/6ウェル培養プレートまたは10 cm細胞培養プレートあたり6 mLを含む2 mLの予熱したネフロン前駆分化培地に変更します。次の14日間は、1日おきに培地を交換してください。
注:ネフロン前駆細胞は増殖し、ネフロン前駆細胞増殖培地で分化の7日後に継代および凍結することができる。 - ネフロン前駆細胞を分割するには、hiPS細胞培養に適した細胞培養プラスチックをコーティング溶液でコーティングし、37°Cで1時間コーティングします。 コーティング液をネフロン前駆細胞増殖培地と交換します。培地を吸引し、予熱した1x PBSで細胞を洗浄します。PBSを除去し、細胞を1xトリプシン-EDTAで解離させます。
- 37°C、5%CO2で5分間インキュベートします。位相差顕微鏡を用いて細胞の剥離をモニターする。必要に応じて、プラスチックの側面を軽くたたいて、セルを表面から切り離します。細胞をプレートから洗い流し、円錐形のチューブに移します。空のフラスコまたはプレートを、解離試薬と同じ量の予熱したネフロン前駆細胞増殖培地で洗浄する。
- 洗浄媒体を円錐形のチューブにプールします。200 x g で20°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、細胞ペレットを2 mLの新鮮な予熱したネフロン前駆細胞増殖培地で再懸濁します。さらなる分化のために細胞およびシード1.5 x 104 ネフロン前駆細胞をcm2 あたり1.5 x 10でカウントする。
注:ネフロン前駆細胞を凍結するには、1 x 106 細胞を1 mLの冷無血清凍結保存培地に再懸濁し、クライオバイアルに移します。-80°Cの冷凍容器で一晩凍結し、液体窒素タンクに移して長期保存します。 - プレートをインキュベーターに戻し、細胞を全方向に3回攪拌して均等に分配します。翌日、培地を新鮮で予熱したネフロン前駆分化培地に変更します。細胞がネフロン前駆分化培地で14日間分化するまで1日おきに培地を交換する。
- 2日後、中胚葉培地を、1xB27サプリメント、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、3 μM CHIR99021、50 ng/mLアクチビンA、および50 ng/mL BMP7/6ウェル培養プレートまたは10 cm細胞培養プレートあたり6 mLを含む2 mLの予熱したネフロン前駆分化培地に変更します。次の14日間は、1日おきに培地を交換してください。
- iPS細胞由来ポドサイトへの終末分化
- 培地を吸引し、6ウェル培養プレートあたり1xB27サプリメント、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、3 μM CHIR99021、50 ng/mLアクチビンA、50 ng/mL BMP7、25 ng/μL VEGF、および0.5 μMオールトランスレチノイン酸を含む2 mLの予温した足細胞分化培地を6ウェル培養プレートまたは6 mL/10 cm細胞培養プレートに追加します。プレートを37°Cおよび5%CO2のインキュベーターに戻します。新鮮で予温した足細胞分化培地で4日間、1日おきに培地を交換します。
- 分化後の培養液にhiPSC-ポドサイトを保持するには、10%のウシ胎児血清、1%のペニシリン-ストレプトマイシン、および0.1%のインスリン-トランスフェリン-セレンを含むポドサイト維持培地を週に2回細胞に与えます。
注:終末分化型hiPSC足細胞は増殖しなくなります。ただし、最大4週間細胞培養に保存することは可能です。
- 凍結ネフロン前駆細胞の融解と増殖
- hiPSC培養に適した新しい細胞培養用プラスチックフラスコに、37°Cおよび5%CO2で1時間のコーティング溶液をコーティングします。コーティング溶液を5mLのネフロン前駆細胞増殖培地と交換します。
- 予熱したネフロン前駆細胞増殖培地7 mLを含む15 mLのコニカルチューブを準備します。凍結細胞を37°Cの水浴中で約20秒間動かずに解凍します。細胞の半分が解凍され、氷が残っているときに、クライオバイアルを水浴から取り出します。
- クライオバイアルに70%エタノールをスプレーし、バイオセーフティキャビネットに入れます。解凍した細胞を予熱したネフロン前駆細胞拡張培地で円錐管に移します。1,000 μLのピペットを使用して、細胞をチューブの壁を非常にゆっくりと流れ落ちさせます。
- 空のクライオバイアルを1 mLのネフロン前駆細胞増殖培地で洗浄し、残りの細胞を回収し、円錐管にプールします。200 x g で20°Cで5分間遠心分離し、細胞ペレットを新鮮な予熱したネフロン前駆細胞増殖培地に再懸濁します。
- 解凍した細胞をコーティングされたフラスコに移し、翌日、培地を新鮮な予熱したネフロン前駆細胞増殖培地に変更します。さらに分化する前に、1日おきに培地を交換してネフロン前駆細胞増殖培地で細胞を増殖させ、ステップ8.3.5から進めます。
9. 免疫蛍光染色によるiPS細胞由来ポドサイトのキャラクタリゼーション
- 免疫蛍光染色により分化した足細胞にポドサイト特異的マーカーがあるかどうかを確認するには、プラスチック製のカバーガラスを24ウェルプレートに入れ、250 μLのコーティング溶液で37°C、5%CO2で1時間コーティングします。 コーティング溶液を、予熱したネフロン前駆細胞増殖培地1 mLと交換します。24ウェルプレートあたり2.5 x 104解離したネフロン前駆細胞をシードする。ネフロン前駆細胞の解離については、ステップ8.3.2〜8.3.4を参照してください。
- 細胞を37°C、5%CO2で一晩乱すことなく付着させます。翌日、予熱したネフロン前駆分化培地と培地を交換します。
- 細胞が分化するまで、1日おきに培地を交換して分化を終了し、ネフロン前駆細胞分化培地で合計14日間、さらに5日間ポドサイト分化培地で分化させる。
- 最終分化後、予温した1 mLの1x PBSで細胞を洗浄します。hiPSC足細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で10分間固定します。固定した細胞を1x PBSで洗浄し、ウェルあたり200 μLのプレインキュベーション溶液で室温で1時間、非特異的結合部位をブロックします。
- 一次抗体シナプトポジン(1:200)、ポドシン(1:100)、およびネフリン(1:25)を抗体希釈液で希釈し、30 μLの一次抗体希釈液滴を、貯水槽を含む染色チャンバー内の清潔なプラスチックホイル上に置きます。
- 固定されたhiPSCポドサイトを逆さまにしたカバースライドを希釈液に入れます。4°Cで一晩インキュベートします。 翌日、1x PBSで5分間3回洗います。二次抗体(1:1,000)を1x PBSで希釈し、30 μLの二次抗体希釈液滴をホイル上のきれいな場所に置きます。カバースライドを逆さまにして希釈液に入れます。
- 暗所で室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、1x PBSで5分間3回洗浄します。DAPIを含む封入剤のスライドガラスにサンプルをマウントします。室温と暗所で一晩乾燥させます。共焦点顕微鏡を使用してサンプルを画像化します。
Representative Results
エピソームのリプログラミングと分化を組み合わせたこの段階的なプロトコルにより、ポドサイト関連遺伝子に患者の変異を持つポドサイトを生成することができます。これにより、 ex vivoでの疾患特異的な足細胞変化の分析が可能になります。患者の遺伝的背景は、すべての異なる細胞段階の間、プロトコル中に保存されます。また、終末分化型非増殖性足細胞の細胞数不足の限界は、hiPS細胞由来足細胞を用いることで克服することができる。成長した皮膚線維芽細胞からhiPSCへのリプログラミングとその後のポドサイトへの分化 を経て 、hiPSC-Podocyteが生成されるまでには数ヶ月かかりますが、プロトコルの3つの異なるステップで細胞を凍結することが可能です(図2)。ネフロン前駆細胞分化培地で7日間分化させた後の線維芽細胞、hiPSC、ネフロン前駆細胞の凍結が可能です。したがって、作業セルバンクの生成と大規模な実験が可能です。
図2:位相差顕微鏡によるプロトコルの個々のステップ。 (A)成長した皮膚線維芽細胞。(B)リプログラミング後のhiPS細胞コロニー形成。(C)選択されたhiPS細胞培養。(d)分化2日後の中胚葉細胞。(e)ネフロン前駆細胞分化培地で14日間分化させた後のネフロン前駆細胞。(f)末端分化型iPS細胞由来ポドサイト。スケールバーは300μm(A、B、D-F)および150μm(C)を表します。スノーフレークは、可能な凍結ステップを強調します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
生成されたhiPS細胞由来の足細胞は、細胞の種類と形態に関して劇的な変化を伴う長いプロトコルを横断するため、細胞の特性評価は必須です。サイズや細胞の形状、成長挙動などの細胞の形態は、位相差顕微鏡を使用して監視できます。線維芽細胞は、150 μmから300 μmのサイズの長い紡錘状の表現型を示します(図2A)。リプログラミング後、50 μmの小さなhiPS細胞を持つコロニーが発生します。これらのコロニーは、高い核対体比と増殖率の増加によって区別される明確な境界とhiPS細胞を示します(図2C)。足細胞は最終分化した細胞であるため、分化が進むと増殖速度が低下し、足突起が目立つ300μmの大きな星型足細胞に細胞形態が変化します(図2F)。
コンフルエントはhiPS細胞培養の臨界点であり、コロニーが密になりすぎると自発的な分化が現れることがあります(図3)。これらのコロニーは、継代前に培養皿の患部をこすることによって除去しなければならない。
図3:異なる品質のhiPS細胞の例。 (A)再プログラムされたhiPSCコロニー、(B)選択されたhiPSC、ならびに(C)自然分化、(D、E)非hiPSCコロニー、および(F)高密度すぎるhiPSC培養物の位相差画像。スケールバーは300μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
このプロトコルの異なる細胞型は、特定のマーカーの発現に関して検証されなければならない。再プログラミング後、hiPS細胞は多能性能力を取り戻し、SSEA4、OCT3/4、Ki67などの増殖マーカーと多能性マーカーを発現します(図4)38,39,40。リプログラミング、ならびにhiPS細胞の長時間の培養および分化は、異常な核型につながるか、むしろ突然変異を誘発する可能性があることが知られている41。したがって、培養細胞の遺伝的背景は、gバンディングおよび全エクソームシーケンシングによって、経時的に異なる継代で監視する必要があります。
図4:免疫蛍光染色による生成されたhiPS細胞の特性評価。 (A)増殖マーカーKi67、ならびに多能性マーカー(B)OCT3/4および(C)SSEA4に対する染色による生成されたhiPS細胞の特性評価。スケールバーは100μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
形態学的には、hiPS細胞由来の足細胞は星形に見え、ciPodoc細胞と比較して長い一次および二次足突起の明確なネットワークを発現します(図5)。HiPS細胞由来のポドサイトは、シナプトポジン、ネフリン、ポドシンなどのポドサイト特異的マーカータンパク質を発現します(図6A-C)42。
図5:ciPodoc細胞と比較したhiPS細胞由来足細胞の形態。 健常ドナー由来の(A,B)hiPS細胞由来ポドサイトと(C,D)ciPodoccyの細胞形態と糸状足について、位相差顕微鏡(A,C)と走査型電子顕微鏡(B,D)を用いて比較した。スケールバーは150μm(A、C)および20μm(B、D)を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
したがって、健康なドナーだけでなく、ポドサイト特異的遺伝子に変異がある患者からのhiPS細胞由来ポドサイトの比較により、患者の変異を ex vivoで個別化することができます。
図6:hiPS細胞由来ポドサイトおよびciPodocyteにおけるポドサイト特異的マーカーの特性評価。ポドサイト特異的マーカータンパク質シナプトポジン(A,D)、ネフリン(B,E)、およびポドシン(C,F)に関する(D-F)ciPodoccytへの健康なドナーからの(A-C)hiPSc由来足細胞の比較。スケールバーは50μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表 1.研究に使用されたすべての細胞培養培地および溶液の組成。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
この細胞培養ベースのプロトコルは、ヒト皮膚線維芽細胞の患者特異的なhiPS細胞へのエピソームリプログラミングと、その後のhiPS細胞由来ポドサイトへの分化を組み合わせたものです。これにより、ポドサイト損傷に関する遺伝性糸球体疾患患者のポドサイトの突然変異関連変化を研究することができます。エレクトロポレーションによる集積フリー法で皮膚線維芽細胞を再プログラムするプロトコルは、Bangら32および沖田ら33の公開研究から適応されています。足細胞をhiPS細胞から区別するためのプロトコルは、Musahらから公開されているプロトコル28,34,35から適応されています。hiPS細胞27,34,35からの足細胞の生成を説明する文献が既に入手可能である。ただし、ここで提供されるプロトコルは、hiPS細胞の足細胞への分化に関して最適化されており、より安価です。Musahらから公開されたプロトコルと比較して、ビトロネクチン、ラミニンシルク-511、可溶化基底膜マトリックスなどのさまざまなコーティング試薬でこのプロトコルをテストしました。ビトロネクチンおよびラミニンシルク-511の濃度は、5μg/mLではなく2.5μg/mLに減少させることができた28,34,35。さらに、BMP7とアクチビンA-2つの非常に高価な成長因子の濃度を100 ng/mLから50 ng/mLに50%減少させることができました。
これにより、より安価な差別化が可能になります。7日目からのネフロン前駆細胞はまだ増殖しており、凍結の可能性は以前に示されていました。これらの細胞を解凍後、最終分化前に、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)とB27を含む基本培地で数日間増殖させ、コストをさらに削減しました。分化ステップに加えて、このプロトコルは、皮膚生検からの線維芽細胞の成長と、その後のエピソームリプログラミング による 患者固有のhiPS細胞の生成について説明します。これら2つの方法を組み合わせることで、患者特異的な足細胞を作製することができます。したがって、患者特異的なiPS細胞由来足細胞を生成するための完全な段階的なプロトコルが、これまで詳細に説明されていなかった完全なステップバイステップのプロトコルがここで提供されます。
全体的なプロトコルにはいくつかの異なる細胞タイプが含まれているため、生成された細胞タイプをさまざまなステップで特徴付けることが重要です。細胞は長期間培養されているため、さまざまな継代で品質管理を行う必要があります。hiPS細胞を扱う場合、毎日の摂食、細胞の挙動および形態のモニタリングが必要です。分化媒体の無菌性は、0.2 μmフィルターによるフィルター滅菌によって確保する必要があります。皮膚生検からhiPS細胞由来ポドサイトまでのプロトコル全体には数か月かかりますが、プロセスの異なる段階で細胞を凍結することが可能です。ネフロン前駆細胞分化培地中で7日後に線維芽細胞、選択されたhiPSCクローン、および増殖性ネフロン前駆細胞を凍結することができ、そして作業細胞バンクを生成することができる。
hiPSC由来の健康な足細胞は、一次および二次足突起の明確なネットワークを発達させ(図5A、B)、典型的な足細胞特異的マーカーを発現しますが(図6A-C)、in vivoで見られるように、特徴的なスリット横隔膜は、古典的な2次元細胞培養モデルでは模倣が困難です。さらに、他の糸球体細胞タイプとの細胞間コミュニケーションは、この単培養環境では不可能です。
それらの末端分化状態および増殖能力の欠如のために、ex vivoで足細胞を研究することは困難である。初代足細胞を条件付きで不死化することの助けを借りて、感温スイッチを挿入することによってこの制限を克服することが可能であり、細胞が33°Cで増殖し、37°Cで分化する細胞培養モデルをもたらす13,14。これらのciPodocytesは足細胞研究の可能性が高いですが、マーカー発現の欠如、脱分化形態、足突起の形成の失敗などの制限があります15,16。
患者由来の体細胞からの足細胞の分化は、ex vivoで健康な対照細胞と罹患した足細胞の生成および比較を可能にする。これにより、ポドサイト特異的遺伝子の変異によるポドサイトの損傷を研究することができます。さらに、hiPS細胞を扱うことは、三次元細胞培養疾患モデル、あるいはむしろオルガノイドを作成する可能性を秘めている43,44。hiPS細胞由来ポドサイトと糸球体内皮細胞やメサンギウム細胞などの他の糸球体細胞との共培養は、健康および糸球体疾患における細胞間コミュニケーションに関する新しい洞察につながる可能性があります。
さらに、患者特異的ポドサイトの特性評価および治療は、ハイスループット分析において ex vivo で行うことができる。個別化アプローチは、特定の変異の新しい治療標的を調査し、将来的に個別化医療を行う機会を開きます。
Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、フリードリヒ・アレクサンダー大学エアランゲン・ニュルンベルクの学際的臨床研究センター(IZKF)から助成金番号M4-IZKF-F009でヤニナ・ミュラー・ダイレに、そしてBundesministerium für Bildung und Forschung(BMBF)によってプロジェクト名STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS、助成金番号01GM2202DがJanina Müller-Deileに与えられた資金提供を受けました。SEM画像の撮影をサポートしてくれたAnnalena Krausに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm sterile filter | Rotilab | P668.1 | for sterilization of differentiation medium |
| all-trans retinoic acid | Stem Cell Technologies | 72262 | supplement for differentiation |
| B27 supplement (50 x), serum free | Gibco | 17504044 | supplement for serum-free differentiation medium |
| BG iMatrix-511 Silk | biogems | RL511S | additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| Bovine serum albumin (BSA) | Roth | 8076.4 | |
| CELLSTAR Filter Cap Cell Culture Flasks, T75, 250 mL | Greiner bio-one | 82050-856 | cell culture plastics suitable for fibroblast culture |
| CHIR99021 (5 mg) | Sigma-Aldrich | 252917-06-9 | supplement for differentiation |
| Corning Matrigel hESC qualified matrix | Corning | 354277 | additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture (solubilized basement membrane matrix) |
| countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | to count cells |
| countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | to count cells | |
| cryoPure tubes, 2 ml, QuickSeal screw cap, white | Sarstedt | 72380 | cryovials for freezing of cells |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Roth | A994.1 | for fibroblast freezing medium |
| DMEM/F12 (1:1) (1 x) | Gibco | 11320074 | basic medium for differentiation |
| DMEM/F12 + Glutamax | Gibco | 10565018 | basic medium for fibroblast medium |
| EVOS M5000 Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | phase contrast microscope |
| fetal bovine serum premium, inactivated (FCS) | PAN Biotech | P301902 | serum for fibroblast medium, fibroblast freezing medium and podocyte maintenance medium |
| fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm gap, 800 µL capacity, sterile | Fisherbrand | FB104 | cuvette used for electroporation/episomal reprogramming of fibroblasts (4mm gap) |
| fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | mounting medium containing dapi |
| gauge needle (0.6 x 30 mm) | BD Microlance3 | 300700 | for separation of hiPSC colonies into small pieces |
| human Recombinant Activin A Protein | 78001.1 | Stem cell technologies | supplement for differentiation |
| human recombinant bone morphogenetic protein 7 (BMP7) | Peprotech | 120-03P | supplement for differentiation |
| human VEGF-165 Recombinant Protein | Thermo Scientific | PHC9394 | supplement for differentiation |
| insulin-transferrin-selenium (ITS -G) (100 x) | Gibco | 41400045 | supplement for podocyte maintenance medium |
| LB medium | Roth | X964.1 | for sterility test of hiPSC culture |
| lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit | Sigma Aldrich | MP0035-1KT | commercial mycoplasma detection kit |
| microscope slides | Diagonal GmbH & Co.KG | 21,102 | |
| microtube 1.5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| mTeSR1 Complete Kit | Stem Cell Technologies | 85850 | basic medium for serum-free hiPSC culture medium |
| nalgene freezing container Mr.Frosty | Roth | AC96.1 | to ensure optimal freezing conditions |
| normal goat serum | abcam | ab 7481 | for preincubation solution and antibody diluent |
| nunc 24 well plates | Thermo Scientific | 142485 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| nunc 48 well plates | Thermo Scientific | 152640 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| nunc 6 well plates | Thermo Scientific | 140685 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| nunc EasYDish Dishes 100 mm | Thermo Scientific | 150466 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 167008 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| nutriFreez D10 Cryopreservation Medium | Sartorius | 05-713-1E | serum-free cryopreservation medium for cryopreservation of hiPSC and nephron progenitor cells |
| Opti-MEM | Gibco | 11058021 | electroporation medium |
| pCXLE-hMLN | Addgene | #27079 | plasmid for episomal reprogramming |
| pCXLE-hOCT3/4 plasmid | Addgene | #27077 | plasmid for episomal reprogramming |
| pCXLE-hSK plasmid | Addgene | #27078 | plasmid for episomal reprogramming |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | to avoid bacterial contamination |
| plastic coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | for immunofluorescent stainings of hiPSCs and hiPSC-derived podocytes |
| ROTI Histofix | Roth | P087.3 | commercial paraformaldehyde (4 %) for fixation of cells |
| RPMI 1640 + L-Glutamine | Gibco | 21875034 | basic medium for podocyte maintenance medium |
| staining chamber StainTray Black lid | Roth | HA51.1 | |
| stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | enzymatic cell detachment solution used for dissociation of hiPSCs |
| sterile phosphate buffered saline (PBS) (1 x) | Gibco | 14190094 | used for washing and coating |
| sterile water | Roth | T1432 | |
| syringe without needle 20 mL | BD Plastipak | 300629 | to filter sterilize differentiation medium |
| TC dish 100 mm | Sarstedt | 8,33,902 | sterile cell culture plastics used for cutting the skin biopsy and fibroblast culture |
| TC dish 35 mm | Sarstedt | 8,33,900 | sterile cell culture plastics used for outgrowing fibroblasts from skin biopsy |
| triton X 100 | Roth | 3051.3 | for preincubation solution |
| trypan Blue Stain (0.4 %) for use with the Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | to count cells |
| trypsin-EDTA (10 x) | Biowest | X0930-100 | dissociation reagent used for fibroblasts and nephron progenitor cells |
| tube 15 mL | Greiner bio-one | 188271-N | |
| tube 50 mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| vitronectin ACF | Sartorius | 05-754-0002 | extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
| Y-27632 dihydrochloride (10 mg) | Tocris | 1254 | to avoid apoptosis of hiPSCs during splitting |
| Primary antibodies | |||
| OCT4 | Stem Cell Technologies | 60093.1 | pluripotency marker, dilution 1:200 |
| SSEA-4 | Stem Cell Technologies | 60062FI.1 | pluripotency marker, dilution 1:100 |
| Ki67 | Abcam | ab15580 | proliferation marker, dilution 1:300 |
| synaptopodin | Proteintech | 21064-1-AP | podocyte-specific marker, dilution 1:200 |
| nephrin | Progen | GP-N2 | podocyte-specific marker, dilution 1:25 |
| podocin | proteintech | 20384-1-AP | podocyte-specific marker, dilution 1:100 |
| Secondary antibodies | |||
| goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21435 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
| alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A31634 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
| donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
| goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
| goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
References
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Grgic, I., et al. Imaging of podocyte foot processes by fluorescence microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 785-791 (2012).
- Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. The podocyte slit diaphragm-from a thin grey line to a complex signalling hub. Nature Reviews Nephrology. 9 (10), 587-598 (2013).
- Deen, W. M., Lazzara, M. J., Myers, B. D.
- Schell, C., Huber, T. B. The evolving complexity of the podocyte cytoskeleton. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (11), 3166-3174 (2017).
- Muller-Deile, J., Schiffer, M. Podocyte directed therapy of nephrotic syndrome-can we bring the inside out. Pediatric Nephrology. 31 (3), 393-405 (2016).
- Boehlke, C., et al. Hantavirus infection with severe proteinuria and podocyte foot-process effacement. American Journal of Kidney Diseases. 64 (3), 452-456 (2014).
- Schiffer, M., et al. Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models. Nature Medicine. 21 (6), 601-609 (2015).
- Kopp, J. B., et al.
- Wiggins, R. C. The spectrum of podocytopathies: a unifying view of glomerular diseases. Kidney International. 71 (12), 1205-1214 (2007).
- Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes. Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5096-5100 (1991).
- Saleem, M. A., et al. A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (3), 630-638 (2002).
- Eto, N., et al. Podocyte protection by darbepoetin: preservation of the cytoskeleton and nephrin expression. Kidney International. 72 (4), 455-463 (2007).
- Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T.
- Chittiprol, S., Chen, P., Petrovic-Djergovic, D., Eichler, T., Ransom, R. F. Marker expression, behaviors, and responses vary in different lines of conditionally immortalized cultured podocytes. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 301 (3), F660-F671 (2011).
- Shih, N. Y., et al. CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain. The American Journal of Pathology. 159 (6), 2303-2308 (2001).
- Yan, K., Khoshnoodi, J., Ruotsalainen, V., Tryggvason, K. N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (5), 1385-1389 (2002).
- Sir Elkhatim, R., Li, J. Y., Yong, T. Y., Gleadle, J. M. Dipping your feet in the water: podocytes in urine. Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (4), 423-437 (2014).
- Camici, M.
- Muller-Deile, J., et al. Overexpression of preeclampsia induced microRNA-26a-5p leads to proteinuria in zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 3621 (2018).
- Schenk, H., et al. Removal of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) factor suPAR using CytoSorb. Journal of Clinical Apheresis. 32 (6), 444-452 (2017).
- Petermann, A., Floege, J. Podocyte damage resulting in podocyturia: a potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity. Nephron. Clinical Practice. 106 (2), c61-c66 (2007).
- Vogelmann, S. U., Nelson, W. J., Myers, B. D., Lemley, K. V. Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 285 (1), F40-F48 (2003).
- Petermann, A. T., et al. Podocytes that detach in experimental membranous nephropathy are viable. Kidney International. 64 (4), 1222-1231 (2003).
- Sakairi, T., et al. Conditionally immortalized human podocyte cell lines established from urine. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 298 (3), F557-F567 (2010).
- Rauch, C., et al. Differentiation of human iPSCs into functional podocytes. PLoS One. 13 (9), e0203869 (2018).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Teshigawara, R., Cho, J., Kameda, M., Tada, T. Mechanism of human somatic reprogramming to iPS cell. Laboratory Investigation. 97 (10), 1152-1157 (2017).
- Bang, J. S., et al. Optimization of episomal reprogramming for generation of human induced pluripotent stem cells from fibroblasts. Animal Cells and Systems. 22 (2), 132-139 (2018).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).
- Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions. Journal of Visualized Experiments. (161), e61299 (2020).
- Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. Journal of Visualized Experiments. (77), e3779 (2013).
- Hoffding, M. K., Hyttel, P. Ultrastructural visualization of the Mesenchymal-to-Epithelial Transition during reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 14 (1), 39-53 (2015).
- Bharathan, S. P., et al. Systematic evaluation of markers used for the identification of human induced pluripotent stem cells. Biology Open. 6 (1), 100-108 (2017).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: more than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
- Vaz, I. M., et al. Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming. Genetics and Molecular Biology. 44 (3), 20200147 (2021).
- Reiser, J., Altintas, M. M.
- Ohmori, T., et al. Impaired NEPHRIN localization in kidney organoids derived from nephrotic patient iPS cells. Scientific Reports. 11 (1), 3982 (2021).
- Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).
