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Protocole optimisé pour la génération de cellules pancréatiques fonctionnelles sécrétant de l’insuline à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Published: February 2, 2024 doi: 10.3791/65530
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3, 1,4,5
1Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Faculty of Medicine, Cell Biology and Functional Genomics, 2Departments of Pediatrics, Naomi Berrie Diabetes Center, Obstetrics and Gynecology, Columbia Stem Cell Initiative, Columbia University Irving Medical Center, Columbia University, 3Department of Diabetes, Imperial College Healthcare NHS Trust, 4Faculté de Médicine, Université de Montréal, 5Lee Kong Chian Imperial Medical School, Nanyang Technological University

Summary

Cet article présente un protocole de différenciation dirigée et d’analyse fonctionnelle des cellules de type β-cellules. Nous décrivons les conditions de culture et les passages optimaux pour les cellules souches pluripotentes humaines avant de générer des cellules pancréatiques productrices d’insuline. La différenciation en six étapes progresse de la formation définitive de l’endoderme à des cellules fonctionnelles de type β sécrétant de l’insuline en réponse au glucose.

Abstract

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) peuvent se différencier en n’importe quel type de cellule, ce qui en fait une excellente source alternative de β-cellules pancréatiques humaines. Les CSPh peuvent être soit des cellules souches embryonnaires (CSEh) dérivées du blastocyste, soit des cellules pluripotentes induites (CSPh) générées directement à partir de cellules somatiques par un processus de reprogrammation. Ici, un protocole vidéo est présenté pour décrire les conditions optimales de culture et de passage des hPSC, avant leur différenciation et la génération ultérieure de cellules pancréatiques productrices d’insuline. Cette méthodologie suit le processus en six étapes de différenciation dirigée par les cellules β, dans lequel les hPSC se différencient en endoderme définitif (DE), tube intestinal primitif, destin de l’intestin antérieur postérieur, progéniteurs pancréatiques, progéniteurs endocriniens pancréatiques et finalement cellules β pancréatiques. Il convient de noter que cette méthodologie de différenciation prend une période de 27 jours pour générer des β-cellules pancréatiques humaines. Le potentiel de sécrétion d’insuline a été évalué par le biais de deux expériences, qui comprenaient l’immunomarquage et la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) ont la capacité unique de se différencier en différents types de cellules, ce qui en fait une alternative viable aux cellules β pancréatiques humaines1. Ces hPSC sont classées en deux types : les cellules souches embryonnaires (hESC), dérivées du blastocyste2, et les cellules pluripotentes induites (hiPSC), générées par la reprogrammation directe des cellules somatiques3. Le développement de techniques permettant de différencier les CSPh en cellules β a des implications importantes pour la recherche fondamentale et la pratique clinique 1,4. Le diabète sucré est une maladie chronique qui touche > 400 millions de personnes dans le monde et résulte de l’incapacité de l’organisme à réguler la glycémie en raison d’un dysfonctionnement ou d’une perte de cellules β pancréatiques5. La disponibilité limitée de cellules d’îlots pancréatiques pour la transplantation a entravé le développement de thérapies de remplacement cellulaire pour le diabète 2,4,6,7. La capacité de générer des cellules sécrétant de l’insuline sensibles au glucose à l’aide de hPSC sert de modèle cellulaire utile pour étudier le développement et la fonction des îlots de Langerhans humains. Il peut également être utilisé pour tester des candidats thérapeutiques potentiels pour le traitement du diabète dans un environnement contrôlé. De plus, les CSPh ont le potentiel de produire des cellules d’îlots pancréatiques génétiquement identiques à celles du patient, réduisant ainsi le risque de rejet immunitaire après la transplantation 2,4,7.

Ces dernières années, des progrès significatifs ont été réalisés dans le perfectionnement des protocoles de culture et de différenciation des CSPh, ce qui a permis d’accroître l’efficacité et la reproductibilité du processus de différenciation en vue de générer des cellules β pancréatiques 8,9.

Le protocole suivant décrit les étapes essentielles de la différenciation dirigée des β-cellules pancréatiques. Il implique la régulation de voies de signalisation cellulaire spécifiques à des moments distincts. Il est basé sur le protocole développé par Sui L. et al.10 (2018) pour la génération de CSPh dans les cellules β pancréatiques. Le protocole a été ajusté aux récentes mises à jour de Sui L. et al.11 (2021), car les dernières recherches soulignent l’importance de l’utilisation d’un traitement à l’aphidicoline (APH) pour améliorer la différenciation des β-cellules. Le protocole actuel comprend l’ajout d’APH au milieu au cours des étapes ultérieures du processus. De plus, des modifications ont été apportées à la composition du milieu au cours des premiers stades de différenciation par rapport au protocole initial. Un changement notable est l’ajout du facteur de croissance des kératinocytes (KGF) le jour 6 et se poursuit jusqu’au jour 8. Le facteur de croissance des kératinocytes (KGF) est introduit du 6e au 8e jour, ce qui diffère légèrement du protocole10 initial, où le KGF n’était pas inclus dans le milieu de stade 4.

La première étape essentielle de la génération de cellules de type β est la différenciation dirigée des CSPh en endoderme définitif (DE), une couche germinale primitive qui donne naissance à la muqueuse épithéliale de divers organes, y compris le pancréas. Après la formation de DE, les cellules subissent une différenciation dans le tube intestinal primitif, qui est suivie de la spécification du destin postérieur de l’intestin antérieur. L’intestin antérieur postérieur se développe ensuite en cellules progénitrices pancréatiques, qui ont le potentiel de se différencier en tous les types de cellules du pancréas, y compris les cellules endocrines et exocrines. L’étape suivante du processus implique des progéniteurs endocriniens pancréatiques donnant naissance aux cellules sécrétant des hormones trouvées dans les îlots de Langerhans. En fin de compte, le processus de différenciation atteint son stade final en produisant des cellules pancréatiques de type β-cellules 9,10 entièrement fonctionnelles. Il est important de noter que ce processus est complexe et nécessite souvent une optimisation des conditions de culture, telles que des facteurs de croissance spécifiques et des composants de la matrice extracellulaire, pour améliorer l’efficacité et la spécificité de la différenciation 9,10. De plus, la génération de cellules fonctionnelles de type β-cellules à partir de hPSC in vitro reste un défi majeur. Les recherches en cours se concentrent sur l’amélioration des protocoles de différenciation et l’amélioration de la maturation et de la fonction des β-cellules résultantes9.

Dans ce protocole, l’utilisation de la dissociation cellulaire douce pendant la culture et le passage des hPSC est essentielle pour maintenir la viabilité et la pluripotence cellulaires, améliorant considérablement l’efficacité de la différenciation en β-cellules pancréatiques. De plus, chaque milieu spécifique à l’étape a été méticuleusement optimisé selon le protocole développé par Sui L. et al.10 pour favoriser un rendement élevé de cellules sécrétant de l’insuline en grappes qui ressemblent étroitement à l’îlot humain.

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Protocol

Avant d’amorcer la différenciation, il est recommandé de déterminer le nombre requis d’organoïdes en forme d’îlots à des fins expérimentales. Dans une plaque à 6 puits, un seul puits avec plus de 80 % de confluence se compose généralement de 2 à 2,3 millions de CSPh. Bien qu’une prédiction précise soit difficile en raison des variations des lignées de hPSC et de l’efficacité de la différenciation, une estimation approximative est 1,5 fois le nombre de puits initiaux. Une différenciation dirigée efficacement produit généralement 1,6 à 2 millions de cellules par puits dans des plaques à six puits, englobant toutes les cellules des grappes plutôt que exclusivement les cellules productrices d’insuline. Pour un amas de 50 μm, on peut estimer qu’il contient environ 10 000 cellules. Le tableau 1 fournit un résumé de la composition du milieu utilisé pour chaque jour/stade de différenciation dirigée sur la matrice et le milieu de cellules souches, ainsi que le tampon de sécrétion d’insuline stimulé par le glucose.

1. Passage de cellules souches pluripotentes humaines avant différenciation dans des plaques à 6 puits

REMARQUE : Le passage approprié des cellules souches humaines avant la différenciation en cellules de type β est une étape cruciale dans l’établissement du processus expérimental. Un passage, une dilution ou un nombre de cellules d’attachement incorrects peuvent compromettre l’efficacité et la fidélité de la différenciation.

  1. Préparer le milieu de culture de cellules souches, l’enrobage et les solutions de dissociation (comme indiqué dans le tableau 1).
  2. 1 à 2 h avant le passage, enduire une plaque à six puits d’une solution de revêtement à froid (1 mL par puits) et incuber à 37 °C, 5 % de CO2.
  3. Chauffer une aliquote de milieu de culture de cellules souches à température ambiante (15 -25 °C) pendant 20 min.
  4. Aspirer le milieu de cellules souches et ajouter 1 mL de D-PBS sans calcium/magnésium.
  5. Répétez l’étape 1.4. deux fois.
    REMARQUE : Le D-PBS est ajouté pour laver les cellules et éliminer le milieu et les composés précédents. Il est important de noter qu’aucun délai spécifique n’est requis pour les étapes de lavage, car l’exposition au D-PBS n’endommage pas les hPSC, empêchant la rupture ou le rétrécissement des cellules causé par osmose.
  6. Aspirer le D-PBS, ajouter 500 μL de solution de dissociation pour chaque puits et laisser reposer pendant 2 à 5 minutes à température ambiante (15 à 25 °C).
  7. Pendant que les cellules se dissocient, aspirer la solution d’enrobage de la nouvelle plaque à 6 puits et ajouter 1 à 2 mL de D-PBS sans calcium/magnésium dans chaque puits.
  8. Vérifiez régulièrement le processus de dissociation au microscope inversé.
  9. Aspirer la solution de dissociation lorsque 80 à 90 % des cellules sont arrondies mais encore adhérentes.
  10. Ajouter 1 mL de milieu de cellules souches contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK.
  11. Recueillir les cellules dissociées dans un tube conique de 15 mL à l’aide de pointes de pipette filtrées stériles de 1 000 μL et d’une pipette P1000.
  12. Triturer lentement la suspension cellulaire de haut en bas dans la pipette avec une pointe filtrée stérile de 1 000 μL pour briser les colonies, mais ne pas dépasser 10 fois.
  13. Ajouter 1 mL du milieu de cellules souches contenant l’inhibiteur de ROCK pour aider à détacher les hPSC restantes et transférer la suspension cellulaire dans le même tube conique de 15 mL (1.10).
  14. Aspirez le D-PBS de la plaque nouvellement revêtue et ajoutez immédiatement la suspension cellulaire du tube conique de 15 ml. Pour assurer une croissance cellulaire optimale, ensemencez une gamme de 2 x 105- 1 x 106 cellules viables par puits lorsque vous utilisez une plaque à 6 puits (1 sur 10 à 1 sur 50 fentes).
    REMARQUE : Pour le calcul du volume, chaque puits d’une plaque à 6 puits doit contenir 2 mL de milieu de cellules souches avec inhibiteur de ROCK.
  15. Déplacez rapidement l’assiette d’avant en arrière et d’un côté à l’autre 5 à 10 fois.
  16. Placer la plaque à 37 °C, 5% CO2 incubateur pendant 24 h.
  17. Remplacer par un milieu de cellules souches frais sans inhibiteur de ROCK le lendemain, puis tous les 2 jours jusqu’à ce que la confluence des CSPh ait atteint 80 à 95 %.

2. Différenciation dirigée par des β-cellules dérivées de cellules souches humaines

REMARQUE : Les hPSC peuvent être utilisées pour le processus de différenciation directe en cellules β pancréatiques lorsque 80 à 95 % de confluence est atteinte.

  1. Jour -1 : Passage des cellules Jour -1 de la différenciation :
    1. 1 à 2 h avant le passage, enduire une plaque à 6 puits d’une solution de revêtement à froid dans un incubateur à 37 °C à 5 % de CO2 pendant 1 h.
    2. Suivez les étapes 1.1 à 1.10 et passez au comptage des cellules.
    3. Chargez 10 μL du mélange de cellules, ajoutez un volume égal de Trypan Blue et mélangez délicatement.
    4. Calculez la concentration cellulaire. Utiliser 0,8 × 106 cellules/mL - 1,0 x 106 cellules/mL de milieu de cellules souches contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK pour plaquer la plaque à 6 puits revêtue avec 2 mL de milieu par puits.
    5. Déplacez rapidement l’assiette d’avant en arrière, d’un côté à l’autre trois fois.
    6. Placer la plaque dans un incubateur à 37 °C à 5 % de CO2 . Déplacez rapidement l’assiette d’avant en arrière et d’un côté à l’autre 10 fois. Incuber ensuite la plaque pendant 4 h.
      REMARQUE : Assurez-vous que la fixation maximale et la répartition uniforme des cellules ne perturbent pas les cellules en déplaçant la plaque une fois placée dans l’incubateur. Ouvrez et fermez l’incubateur très soigneusement.
    7. Placez le flacon de milieu de base des jours 0 à 4 à 4 °C pour le décongeler pendant la nuit.
  2. Jour 0
    REMARQUE : Les hPSC doivent être confluentes à 80 à 95 %, ne commencez pas le processus de différenciation vers l’endoderme définitif sous cette confluence.
    1. Sur la glace, décongeler le milieu de base pour les jours 0 à 4 et les suppléments (voir le tableau des matières).
    2. Préparer dans deux tubes coniques seulement le volume nécessaire à utiliser le jour 1 (2 mL par puits d’une plaque de 6 puits), et dans un tube séparé, doubler le volume du jour 2,5 à 4 (2 x 2 mL par puits d’une plaque de 6 puits). Conserver le moyen du jour 2,5 au jour 4 à 4 °C.
    3. Réchauffez une aliquote du volume nécessaire du milieu Jour 1 et du milieu de lavage 1 au bain-marie à 37 °C pendant 5 min.
    4. Aspirer le milieu de cellules souches et ajouter 2 mL de milieu de lavage 1.
      REMARQUE : Le milieu de lavage utilisé dans le protocole est constitué du milieu de base spécifique à chaque jour/étape, complété par 1 % d’antibiotiques. Les étapes de lavage du protocole de différenciation directe n’impliquent que l’ajout du milieu de lavage désigné (appelé « milieu de lavage 1 ou 2 », tableau des matériaux) et l’aspiration ultérieure, conformément à la procédure décrite 2.2.4. Il est important de mentionner qu’il n’y a pas de délai spécifique indiqué pour ces étapes de lavage.
    5. Aspirer le milieu de lavage 1 et ajouter immédiatement 2 ml du milieu Jour 1 sur le côté du puits.
    6. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h.
  3. Jour 1
    1. Préchauffer une aliquote du volume nécessaire de jours 2,5 à 4 moyen dans un bain-marie à 37 °C pendant 5 min.
    2. Aspirer le milieu Jour 1 et ajouter immédiatement 2 ml du milieu Jour 2,5 à 4 sur le côté du puits. Ne lavez pas les cellules.
    3. Remettez la plaque à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 36 h.
  4. Jours 2.5 à 4
    1. Préchauffer une aliquote du volume restant du jour 2,5 à 4 à moyen dans un bain-marie à 37 °C pendant 5 min.
    2. Aspirer le milieu et ajouter immédiatement 2 ml de moyen Jours 2,5 à 4 fraîchement préparé sur le côté du puits.
    3. Remettez la plaque à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 36 h.
  5. Jour 4
    REMARQUE : À ce stade, l’expression des marqueurs endodermiques définitifs est à son maximum et les cellules peuvent initier la différenciation primitive du tube intestinal.
    1. Préparez une aliquote du volume nécessaire du milieu du stade intestinal primitif du jour 4 (2 mL par puits d’une plaque à six puits) et réchauffez-la à température ambiante (15 °C -25 °C) pendant 20 min.
    2. Aspirer le milieu des jours 2,5 à 4 et ajouter 2 mL de milieu de lavage 1.
    3. Aspirez le milieu de lavage 1 et ajoutez immédiatement 2 ml de stade intestinal primitif du jour 4 sur le côté du puits.
    4. Remettez la plaque à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 48 h.
  6. Jours 6 à 8
    REMARQUE : À ce stade, les cellules initient une différenciation supplémentaire sur le destin postérieur de l’intestin antérieur.
    1. Préparez le volume nécessaire de milieu de l’intestin antérieur postérieur des jours 6 à 8 (2 mL par puits d’une plaque de 6 puits) et réchauffez le milieu à température ambiante (15 °C -25 °C) pendant 20 min.
    2. Aspirer le milieu du jour 4 et ajouter immédiatement 2 ml de milieu de l’intestin antérieur postérieur des jours 6 à 8 sur le côté du puits.
    3. Placer la plaque dans un incubateur à 37 °C contenant 5% de CO2 pendant 48 h.
  7. Jours 8 à 12
    REMARQUE : Les cellules sont prêtes à subir la différenciation des progéniteurs pancréatiques.
    1. Préparer le volume nécessaire de milieu de stade des progéniteurs pancréatiques des jours 8 à 12 (2 mL par puits d’une plaque de 6 puits) et réchauffer le milieu à température ambiante (15 °C -25 °C) pendant 20 min.
    2. Aspirer le milieu des jours 6 à 8 et ajouter immédiatement 2 ml de milieu de l’intestin antérieur postérieur des jours 6 à 8 sur le côté du puits.
    3. Placer la plaque dans un incubateur à 37 °C contenant 5% de CO2 pendant 48 h.
  8. Jour 12 : Exécution de l’étape de clustering
    REMARQUE : À ce stade, les cellules forment une monocouche dense et seront transférées à la culture cellulaire 3D pour former des grappes. Cette étape est cruciale pour la différenciation afin d’améliorer la ressemblance structurelle des cellules de type β avec les îlots humains natifs, mais améliore également leur ressemblance fonctionnelle au niveau cellulaire et de l’amas11 (Figure 1).
    1. Traiter une plaque à 6 puits contenant des micropuits de 400 μm (tel que spécifié dans le Tableau des matériaux : Différenciation dirigée des β cellules dérivées de cellules souches humaines, jour 12) avec 2 mL de solution de rinçage antiadhérence à température ambiante (15 °C - 25 °C).
      REMARQUE : Le micropuits empêche les cellules de se fixer au fond du puits et facilite la formation mécanique de grappes 3D.
    2. Plaque à centrifuger à 1 300 x g pendant 5 min.
    3. Vérifiez la présence de bulles au microscope inversé. Si aucune bulle n’est observée, aspirer la solution de rinçage anti-adhérence et ajouter immédiatement 2 mL de produit de lavage 2 (Tableau des matières).
    4. Répétez l’étape 1.8.3. deux fois.
    5. Préparez le volume nécessaire de milieu à grappes et réchauffez-le à température ambiante (15 -25 °C) pendant 20 min. S’assurer que deux puits d’une plaque à 6 puits vont dans un puits de la plaque à 6 puits de 400 μm avec 4 mL du milieu en grappe.
    6. Aspirer le milieu progéniteur pancréatique et ajouter un tampon de dissociation (0,5 mL par puits).
    7. Incuber à température ambiante (15 °C - 25 °C) pendant 2 à 5 min. Vérifier régulièrement le processus de dissociation au microscope inversé et aspirer le tampon de dissociation lorsque la plupart des cellules sont arrondies mais encore adhérentes.
    8. Aspirer le tampon de dissociation et ajouter immédiatement 1 mL de milieu en grappe dans chaque puits.
    9. Dissociez les cellules en pipetant doucement de haut en bas six fois à l’aide d’une pipette P1000 et d’embouts filtrants de 1 000 μL.
    10. Transférer les cellules et le mélange de milieu en grappe dans un tube conique de 50 ml.
    11. Ajouter 1 mL de milieu de grappe pour recueillir toutes les cellules restantes.
    12. Ajouter le milieu à grappes au volume total nécessaire pour que chaque puits de la plaque à micropuits contienne 4 mL de milieu en grappes de mélange/cellules.
    13. Aspirer le milieu de lavage 2 de la plaque à 6 puits des micropuits et transférer la suspension cellulaire. Incuber la plaque à 37 °C pendant 24 h.
  9. Jour 13 : Manipulation des cellules après le regroupement et changement de leur milieu à partir du jour 13.
    REMARQUE : Les grappes sont très sensibles et nécessitent une manipulation minutieuse pour garantir leur intégrité et leur viabilité dans les jours suivants. Par conséquent, il est crucial de surveiller de près les grappes pendant la période post-grappe après le jour 12. Une évaluation et des ajustements réguliers sont essentiels pour promouvoir des résultats positifs dans le processus expérimental.
    1. Préparez le volume nécessaire de milieu des jours 13 (2 mL par puits d’une plaque à 6 puits) et dans un tube conique séparé de 50 mL pour les jours 15 à 20 du milieu progéniteur endocrinien pancréatique.
    2. Prélever lentement les grappes de la plaque à 6 puits des micropuits dans un tube conique de 50 mL à l’aide d’une pipette p1000 et d’embouts filtrés de 1 000 μL.
    3. Ajouter 1 mL de milieu du jour 13 pour recueillir les grappes restantes et transférer les grappes dans le tube.
    4. Laissez les cellules se fixer naturellement sous l’effet de la gravité au fond du tube conique pendant 5 min.
    5. Aspirer autant de surnageant que possible du tube sans perturber les amas de cellules. Les pointes de pipette ne doivent pas toucher ni aspirer les grappes, mais uniquement le surnageant.
    6. Ajouter le volume nécessaire de milieu du jour 13 selon ce qui suit : 1 puits de micropuits 6 puits de plaque de puits va dans trois puits d’une plaque de 6 puits à faible fixation (2 mL de milieu par puits).
    7. Pipeter doucement de haut en bas, en évitant d’aspirer des grappes.
    8. Transférer la suspension sur une plaque à 6 puits très peu adhérente.
    9. Déplacez rapidement l’assiette d’avant en arrière, d’un côté à l’autre six fois.
    10. Incuber la plaque à 37 °C pendant 48 h.
    11. Effectuez les changements de milieu dans toutes les étapes suivantes jusqu’à la fin de la différenciation comme décrit dans cette section 2.9.
  10. Jours 15 à 20
    1. Passer au milieu du stade progéniteur endocrinien pancréatique toutes les 48 h jusqu’au jour 21 de la différenciation en recueillant la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 mL et en suivant les étapes 2.9.4 à 2.9.10 pour le jour 13.
  11. Jours 21 à 27
    REMARQUE : À ce stade, les grappes se différencient en cellules β pancréatiques.
    1. Préparez le milieu pancréatique au stade β-cellules.
    2. Changez le milieu tous les deux jours comme décrit pour les jours 15 à 21.
      REMARQUE : Après le jour 25, les organoïdes en forme d’îlots peuvent être analysés pour confirmer qu’ils sont pleinement fonctionnels.

3. Coloration des amas de cellules β pancréatiques

REMARQUE : Effectuez cette étape pour étudier l’évaluation fonctionnelle des clusters après la différenciation

  1. Prélever cinq à dix grappes dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL à la fin de la différenciation.
  2. Fixez les amas de cellules avec 200 μL de PFA à 4 % pendant 15 min à température ambiante.
  3. Ajouter 1 mL de PBS dans les grappes et retirer le PBS avec une pointe de pipette de 1 000 μL sans déranger les grappes.
  4. Ajouter 200 μL de saccharose à 30 % aux grappes et incuber toute la nuit à 4 °C.
  5. Transférez les grappes dans un cryomoule, retirez le saccharose supplémentaire, ajoutez une goutte de milieu O.C.T. et mélangez les grappes avec le milieu O.C.T.
  6. Congelez le cryomoule sur de la glace carbonique et conservez-le à -80 °C.
  7. Découpez des coupes de 5 μm dans le bloc congelé sur des lames de microscope à l’aide d’un microtome/ou d’un cryostat.
  8. Conservez les lames au congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’elles soient tachées.
  9. Le jour de la coloration, sortez les lames du congélateur à -80 °C.
  10. Enlevez soigneusement la glace autour des sections du cryomoule.
  11. Encerclez les groupes de cellules sur les lames avec un stylo hydrophobe.
  12. Réhydrater les lames dans un bocal de coloration de lames contenant du PBS pendant 15 min.
  13. Ajoutez du méthanol froid dans le bocal de coloration des lames et placez le bocal avec les lames à -20 °C pendant 10 min.
  14. Plongez les diapositives dans un bocal PBS.
  15. Répétez l’étape 3.14 trois fois.
    REMARQUE : Utilisez cette méthode pour toutes les étapes de lavage suivantes.
  16. Retirer le PBS des lames et couvrir immédiatement avec 100 μL de solution bloquante avec 2 à 5 % de BSA dans du PBS-T.
  17. Ajouter une solution de blocage sur chaque lame et couvrir d’un film de paraffine.
  18. Incuber pendant 1 h à température ambiante (15 -25 °C).
  19. Diluer les anticorps primaires dans la solution bloquante en utilisant les ratios fournis dans la section Réactifs et solutions.
  20. Retirez la solution de blocage des lames.
  21. Ajouter immédiatement les anticorps dilués et couvrir les lames de parafilm pour éviter que la lame ne sèche.
  22. Incuber toute la nuit à 4 °C.
  23. Le lendemain, lavez les diapositives 3 à 5 fois avec PBS-T.
  24. Préparez les anticorps secondaires dilués et la coloration de l’ADN.
  25. Retirez l’excès de PBS-T des lames.
  26. Ajouter les anticorps secondaires dilués et la coloration de l’ADN. Incuber pendant 45 min à température ambiante (15 -25 °C).
  27. Lavez les lames 3 à 5 fois avec PBS-T.
  28. Retirez tout liquide des lames.
  29. Ajoutez une goutte de milieu de montage histologique à chaque section.
  30. Couvrez la diapositive avec un couvercle en verre.
  31. Prenez des photos de lames colorées à l’aide d’un microscope fluorescent.

4. GSIS (test de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose)

  1. Préparez trois solutions différentes : solution KREBS à faible teneur en glucose, solution KREBS à haute teneur en glucose et solution KREBS à faible teneur en glucose avec KCl.
  2. Réchauffez toutes les solutions au bain-marie à 37 °C.
  3. Sélectionnez soigneusement environ 10 à 15 grappes de taille similaire à l’aide d’une pointe de pipette de 1000 μL et transférez-les dans un tube de 1,5 mL avec une petite quantité de milieu différencié pour éviter de dessécher les grappes.
    REMARQUE : Les grappes doivent être visibles à l’œil nu, mais sinon, placez la plaque contenant les grappes différenciées sous un microscope inversé pour sélectionner les grappes et les transférer dans un tube de 1,5 ml.
  4. Placez le tube avec les grappes et le support sur un support de tube et attendez que les grappes coulent au fond du tube.
  5. Aspirer lentement le surnageant à l’aide d’une pipette de 200 μL et ajouter 200 μL de solution KREBS à faible teneur en glucose.
  6. Incuber les îlots dans la solution pauvre en glucose pendant 1 h à 37 °C.
    REMARQUE : Pour assurer l’évaluation précise du nombre de grappes et la cohérence des expériences, il est conseillé de vérifier la présence de toutes les grappes dans la solution pendant le transfert, car elles ont tendance à adhérer au tube.
  7. Retirer le tube de l’incubateur et aspirer lentement 200 μL de solution KREBS sans aspirer de grappes.
  8. Ajouter 200 μL de solution KREBS à faible teneur en glucose et incuber pendant 30 min à 37 °C.
  9. Aspirer le volume de 200 μL de solution KREBS à faible teneur en glucose dans un tube de 500 μL et le stocker immédiatement à -80 °C pour les mesures d’insuline. Répétez l’opération pour des traitements séparés.
  10. Pour laver les grappes, ajoutez 200 μL de solution KREBS sans glucose dans le tube contenant les grappes. Laissez les grappes se déposer au fond du tube et retirez soigneusement le surnageant sans déranger les grappes.
  11. Ajouter 200 μL de solution KREBS à haute teneur en glucose et incuber pendant 30 min à 37 °C.
  12. Aspirez 200 μL de KREBS à haute teneur en glucose dans un tube de 500 μL et stockez-le immédiatement à -80 °C pour la mesure de l’insuline. Répétez l’opération pour des traitements séparés.
  13. Pour laver les grappes, ajoutez 200 μL de solution KREBS sans glucose dans le tube contenant les grappes. Laissez les grappes se déposer au fond du tube et retirez soigneusement le surnageant sans déranger les grappes.
  14. Ajouter 200 μL de solution KCl KREBS et répéter l’opération pour des traitements séparés.
  15. Incuber pendant 30 min à 37 °C.
  16. Aspirer 200 μL de solution KCl KREBS dans un tube de 500 μL et le stocker immédiatement à -80 °C pour les mesures d’insuline. Répétez l’opération pour les autres traitements.
  17. Ajouter 50 μL d’eau ultrapure et procéder à la mesure de la teneur totale en insuline.
  18. Ajouter 150 μL de solution d’éthanol acide dans le tube avec des îlots et de l’eau ultrapure.
  19. Conserver les échantillons à 4 °C pendant la nuit (12 à 15 h).
  20. Le lendemain, vortex chaque échantillon.
  21. Effectuer la sonication avec un sonicateur électrique réglé à 20 % de puissance pendant 1 s pour assurer une lyse complète du tissu des îlots.
    REMARQUE : Répétez l’étape 4.21 jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de clusters visibles.
  22. Centrifuger tous les échantillons à 10 000 × g pendant 10 min et conserver le surnageant.
  23. Mesurez la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre à nanogouttes, qui peut ensuite être utilisé pour normaliser les mesures d’insuline.

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Representative Results

Le protocole décrit dans cet article offre une approche très efficace pour différencier les cellules de type β des hPSC10. Ce processus utilise un système de culture 2D facilement évolutif, permettant son utilisation dans divers contextes expérimentaux, tels que la différenciation de l’apprentissage, des projets et des laboratoires plus petits, et des tests pilotes pour évaluer le potentiel de différenciation d’une lignée iPSC.

Il est essentiel de caractériser les propriétés fonctionnelles des cellules β différenciées dans les îlots de Langerhans pour mieux comprendre l’homéostasie du glucose. Ceci est généralement réalisé grâce à diverses expériences telles que l’immunomarquage des marqueurs β-cellules et l’expression de l’insuline, ainsi que des tests de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS), qui testent la fonction des îlots en réponse à des concentrations de glucose faibles et élevées12,13. β-cellules possèdent des gènes de signature, notamment Nkx2-2, Pdx1, Nkx6-1 et Neurod1, qui sont essentiels à l’établissement et au maintien de l’identité des cellules β9. Les techniques d’immunomarquage sont utiles pour étudier l’expression et la localisation des protéines dans les coupes de tissus. L’immunomarquage des marqueurs β-cellules peut évaluer les niveaux d’expression des principaux marqueurs de la lignée pancréatique, fournissant des informations sur la fidélité et l’optimisation du processus de différenciation pour des applications spécifiques 9,12.

Dans cette étude, la lignée rapporteure de CSEh Mel1 InsGFP/w (Mel1 INS-GFP)14 a été utilisée pour différencier des amas comprenant différents types de cellules, y compris des cellules β ressemblant à celles trouvées dans les îlots natifs humains. La figure 2 de cet article offre des résultats significatifs concernant l’efficacité et la précision du processus de différenciation. Les résultats démontrent un enrichissement élevé des cellules exprimant l’insuline au sein de la lignée pancréatique, et ces cellules présentent une sécrétion d’insuline stimulée par le glucose. Cela indique la génération réussie de cellules fonctionnelles de type β par le processus de différenciation.

Les cellules différenciées ont été stimulées avec des concentrations de glucose faibles et élevées, et les résultats du GSIS ont montré que les clusters dérivés des cellules Mel1 fonctionnaient de la même manière que les îlots dans leur réponse de sécrétion d’insuline au glucose. Il a été constaté que les grappes dérivées de Mel1 sécrètent 100 fois plus d’insuline en réponse à des concentrations élevées de glucose par rapport à de faibles concentrations de glucose. Plus précisément, la teneur en insuline était de 0,003 ± 0,002 % à 3,3 mM de glucose faible et de 0,236 ± 0,197 % à 16,7 mM de glucose élevé.

Les grappes dérivées des CSEh Mel1 INS-GFP ont été soumises à des analyses plus approfondies pour déterminer leur composition et leur fonctionnalité, en plus du test GSIS. Plus précisément, l’expression des gènes de signature β-cellules et la présence de différents types de cellules dans les grappes ont été étudiées. Les résultats ont montré que la lignée pancréatique obtenue à partir de ce processus est fortement enrichie en cellules insulino-positives, indiquant un haut niveau de succès dans le processus de différenciation des CSEh en cellules de type β. De plus, l’expression de gènes de signature, tels que Nkx6.1 et Pdx1, importants pour l’établissement et le maintien des identités β-cellules, a été examinée. L’analyse a révélé qu’environ 25 % et 40 % des cellules exprimaient Nkx6.1 et Pdx1, respectivement, ce qui prouve que les grappes contenaient des cellules différenciées de type β (moyenne des cellules Nkx6,1+ par grappe 24,9 % ± 6,2 %, n = 9 grappes, cellules Pdx1+ 40,2 % ± 6,2 %, n = 9, MEB, Figure 2). De plus, les grappes contenaient d’autres types de cellules, telles que des cellules positives au glucagon, qui représentaient environ 15 % de la population cellulaire totale. Ces cellules se trouvent généralement dans les cellules alpha des îlots natifs de Langerhans, ce qui suggère que les amas ressemblent étroitement aux îlots humains en termes de composition cellulaire.

Figure 1
Figure 1 : Différenciation des CSPh en cellules β pancréatiques. (A) Représentation schématique de la différenciation dirigée in vitro des CSPh en cellules β pancréatiques, qui implique six étapes successives : induction définitive de l’endoderme, formation du tube intestinal primitif, spécification du destin de l’intestin antérieur postérieur, génération de progéniteurs pancréatiques, formation des progéniteurs endocriniens pancréatiques et, finalement, différenciation des cellules β pancréatiques. La différenciation pancréatique β-cellules utilise des étapes clés du développement des îlots humains, avec la régulation de voies de signalisation cellulaires spécifiques à des moments spécifiques. B27 : Supplément B-27 ; Ri : inhibiteur de la protéine kinase rho-associée ou inhibiteur de ROCK ; T3 : hormone thyroïdienne ; KGF : protéine humaine KGF / FGF-7 ; RepSox : inhibiteur de la voie de l’activine/des ganglions/TGF-β ; Inhibe ALK5 ; RA : Acide rétinoïque ; ZS : sulfate de zinc ; HNF : héparine non fractionnée ; XX : inhibiteur de la gamma-sécrétase XX ; APH : aphidicoline ; EGF : facteur de croissance épidermique ; LDN : Inhibiteur de BMP III, LDN-212854 ; Cyclo : Cyclopamine - KAAD. (B) Images de la morphologie cellulaire capturées à différents stades de différenciation des cellules souches pluripotentes aux β-cellules pancréatiques. La première image montre des cellules souches pluripotentes humaines au premier jour de la différenciation (monocouche de HPSC). (C) Au jour 11, les cellules sont au stade progéniteur pancréatique. Barre d’échelle de 100 μm. (D) Au jour 12, des amas se forment dans les micropuits de la plaque à 6 puits après la dissociation des cellules au stade progéniteur pancréatique. (E) Au jour 13, les grappes sont dans une plaque à 6 puits à faible fixation. Barre d’échelle de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Les clusters obtenus à partir de la lignée14 de rapporteurs différenciés Mel1 InsGFP/w hESC ont été évalués pour la présence de cellules productrices d’insuline exprimant des marqueurs de maturité β-cellules. (A) Des images d’immunofluorescence des clusters ont été capturées à partir de coupes de cryomoule (5 μm) à l’aide de la microscopie confocale à disque rotatif, qui a révélé la prédominance des cellules productrices d’insuline (environ 60 %) par rapport aux cellules productrices de glucagon (environ 15 %) (n = 9 clusters, environ 18 000 cellules, MEB). (B) Des images d’immunofluorescence des grappes ont été obtenues à partir de coupes cryomoulées (5 μm) par microscopie confocale à disque rotatif, qui ont montré la prédominance de cellules productrices d’insuline co-exprimant les marqueurs pancréatiques β-cellulaires Nkx6.1 (n = 9 grappes, environ 18 000 cellules). (C) La macro de compteur de cellules ImageJ, spécialement conçue pour l’immunomarquage des marqueurs, a été utilisée pour déterminer le pourcentage de cellules positives pour l’insuline, de glucagon positif et de β cellules Nkx6.1, et de marqueurs de cellules β Pdx1 positifs. (D) La sécrétion d’insuline stimulée par le glucose des clusters dérivés de Mel1 InsGFP/w hESC a été évaluée, qui a montré une augmentation de 100 fois en réponse à une stimulation élevée du glucose (16,7 mM de glucose) dans les clusters différenciés (n = 9, SEM). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Résumé de la composition des milieux pour la différenciation dirigée. Ce tableau fournit un résumé de la composition du milieu utilisé pour chaque jour/stade de différenciation dirigée sur la matrice et le milieu de cellules souches, ainsi que le tampon de sécrétion d’insuline stimulé par le glucose. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

La différenciation réussie des CSPh en cellules β pancréatiques dépend de l’optimisation de tous les aspects de la culture de routine et du passage des CSPh sélectionnées. Il s’agit notamment de s’assurer que la lignée cellulaire a un caryotype normal, qu’elle est négative pour l’infection à mycoplasmes et qu’elle est exempte de génomes plasmidiques ou de vecteurs viraux. De plus, lors de l’utilisation de hiPSC, il est important d’éviter d’utiliser le passage le plus ancien qui est encore en cours de reprogrammation, pour des expériences pilotes. Ces expériences doivent être menées à petite échelle pour identifier la raie hPSC avec le meilleur potentiel de différenciation et le nombre optimal de passages.

D’autres paramètres peuvent influencer l’efficacité de la différenciation, notamment la qualité du milieu de cellules souches utilisé, la densité du revêtement et le nombre de passages10,12. Ce protocole a été optimisé pour maximiser l’efficacité de la différenciation en veillant à ce que tous les paramètres pertinents soient optimisés10.

Des milieux de différenciation avec des formulations spécifiques sont utilisés à chaque étape pour soutenir la différenciation des hPSC en cellules β. L’activine A et un agoniste Wnt sont utilisés dans le milieu de différenciation pour initier la transition vers les cellules endodermiques définitives. Au cours de la phase primitive du tube intestinal, le KGF est ajouté au milieu pour favoriser une différenciation ultérieure en cellules β15, et cette inclusion de KGF est maintenue du 6e au 8e jour, ce qui diffère du protocole original de Sui, Egli et al.10. Au cours de la phase progénitrice pancréatique, la composition spécifique du milieu est optimisée pour améliorer l’expression du facteur de transcription Pdx1. Ceci est réalisé en utilisant une concentration élevée d’acide rétinoïque (AR), de KGF et de LDN193189, qui inhibe la voie8 de la protéine morphogénétique osseuse (BMP). Au fur et à mesure que la différenciation progresse vers le stade endocrinien, le milieu de culture est modifié pour réguler à la baisse la signalisation Notch. Ceci est réalisé en incorporant XXI, un inhibiteur de la γ-sécrétase, ainsi que de la T3 (hormone thyroïdienne), de la PR et de RepSox, un inhibiteur de la voie8 de l’Activin/BMP/TGF-β. Cette combinaison spécifique de composés est utilisée pour favoriser la différenciation des progéniteurs pancréatiques en progéniteurs endocriniens. Enfin, pour optimiser le processus de différenciation directe, l’aphidicoline (APH) est introduite lors de la différenciation des progéniteurs pancréatiques en progéniteurs endocriniens. Cet ajout d’APH vise à améliorer encore la différenciation des cellules β, et il représente une modification distincte par rapport au protocole initial proposé par Sui, Egli et al.10,11.

Pendant le processus de différenciation, il est crucial de surveiller la densité cellulaire et d’éviter les confluences excessives, car cela peut entraver une différenciation correcte. Les cultures à haute densité peuvent maintenir une expression élevée d’Oct4, inhibant la différenciation en endoderme définitif. L’élimination de l’inhibiteur de ROCK lors de la première étape de lavage est essentielle pour initier la différenciation et permettre à l’état pluripotent des CSPh d’être modifié. L’utilisation d’un marqueur de fluorescence, tel que Mel1 INS-GFP avec une GFP intégrée au locus de l’insuline, facilite l’évaluation des progrès de la différenciation aux stades progéniteur pancréatique et β-cellules, facilitant les expériences en aval14.

Le protocole actuel de différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules pancréatiques de type β a démontré une variabilité de l’efficacité entre les différentes lignées deCSPh 10. De plus, les cellules de type β qui en résultent présentent une immaturité fonctionnelle par rapport aux îlots pancréatiques humains, montrant une sécrétion d’insuline plus faible par cellule. Pour remédier davantage à cette limitation, la maturation in vivo de cellules de type β peut être obtenue par transplantation d’organoïdes d’îlots dans des modèles animaux au cours des dernières étapes de la différenciation 6,7.

Malgré ces limites, la différenciation des CSPh en cellules β pancréatiques présente un potentiel important par rapport aux méthodes existantes 8,9,10. Cette technique permet de produire un grand nombre de cellules de type β qui sont sensibles au glucose et expriment des marqueurs β-cellules (Pdx1 et Nkx6.1, voir Figure 2). Cela se fait sans les limites éthiques, techniques et de source associées à l’utilisation des îlots pancréatiques humains. De plus, cette technique a le potentiel d’être appliquée à la médecine personnalisée, car des cellules β spécifiques au patient peuvent être générées pour les tests de médicaments et la modélisation de la maladie 4,6,7. La technique pourrait également avoir des applications futures dans le traitement du diabète qui implique la perte ou le dysfonctionnement des cellules β pancréatiques 4,6,7.

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Acknowledgments

Ines Cherkaoui a bénéficié d’une bourse de recherche de Diabetes UK (BDA 18/0005934) à GAR, qui remercie également le Wellcome Trust pour une bourse de chercheur (212625/Z/18/Z), UKRI MRC pour une subvention de programme (MR/R022259/1), Diabetes UK pour une subvention de projet (BDA16/0005485), le CRCHUM pour des fonds de démarrage, Innovation Canada pour une bourse John R. Evans Leader (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) pour une subvention Projet, et IRSC, FRDJ pour une subvention d’équipe (IRSC-IRSC : 0682002550 ; FRDJ 4-SRA-2023-1182-S-N). Camille Dion et le Dr Harry Leitch pour leur aide à la génération et à la culture d’hiPSC humaines, l’installation d’organoïdes du NIHR Imperial BRC (Biomedical Research Centre), Londres.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube Starlabs S1615-5500
6-well Cell culture plate ThermoFisher Scientific 165218
AggreWell 400 6-well plate  STEMCELL Technologies 34425
Anti-Glucagon  Sigma-aldrich G2654-100UL
Anti-Insulin  Dako A0564
Anti-NKX6.1 Novus Biologicals NBP1-49672SS
Anti-PDX1  Abcam ab84987
Aphidicolin Sigma-Aldrich A4487
B-27 Supplement (50X), serum free  Thermo Fisher Scientific 17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid free Sigma-Aldrich A3803-100G
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C3306
Calcium/Magnesium free D-PBS Thermo Fisher Scientific 14190144
Cyclopamine-KAAD Calbiochem 239804
D-(+)-Glucose,BioXtra Sigma-Aldrich G7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrous Sigma-Aldrich 94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 10566016 For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS. 
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) Thermo Fisher Scientific 10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides Thermo Fisher Scientific 10149870
Ethanol VWR 20821.33
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XX Thermo Fisher Scientific J64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Thermo Fisher Scientific A1413302 Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555 Thermo Fisher Scientific A-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647 Abcam ab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633 Thermo Fisher Scientific A-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11011
Heparin Sigma-Aldrich H3149
HEPES buffer Sigma-Aldrich H3375-500G
Hoechst 33342, Trihydrochloride Thermo Fisher Scientific H1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein Thermo Fisher Scientific PHG0094
Hydrogen chloride Sigma-Aldrich 295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen Agar Scientific AGG4582
LDN193189 Sigma-Aldrich SML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M9272-500G
OCT Compound 118 mL Agar Scientific AGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents Thermo Fisher Scientific 7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS) Thermo Fisher Scientific, 15070-063
Potassium chloride Sigma-Aldrich 7447-40-7
Recombinant Human EGF Protein R&D Systems 236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mm VWR 631-0137
RepSox (Hydrochloride) STEMCELL Technologies 72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement   Thermo Fisher Scientific 61870036 For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mount Thermo Fisher Scientific 9990402
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014-500G
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous Sigma-Aldrich 7558-80-7
STEMdiff Endoderm  STEMCELL Technologies 5110
StemFlex Medium Thermo Fisher Scientific A3349401 Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid Reprocell 04-0021 
Thyroid Tormone 3 (T3) Sigma-Aldrich T6397
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
TrypL Express Enzyme (1X) Thermo Fisher Scientific 12604013
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture Thermo Fisher Scientific 38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher Scientific 10977015
Y-27632 (Dihydrochloride)  STEMCELL Technologies 72302
Zinc Sulfate Sigma-Aldrich  Z4750

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References

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Biologie numéro 204
Protocole optimisé pour la génération de cellules pancréatiques fonctionnelles sécrétant de l’insuline à partir de cellules souches pluripotentes humaines
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Cherkaoui, I., Du, Q., Egli, D., Misra, S., Rutter, G. A. Optimized Protocol for Generating Functional Pancreatic Insulin-secreting Cells from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (204), e65530, doi:10.3791/65530 (2024).

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