Summary
Este artículo presenta un protocolo para la diferenciación dirigida y el análisis funcional de células similares a β células. Describimos las condiciones óptimas de cultivo y los pasajes para las células madre pluripotentes humanas antes de generar células pancreáticas productoras de insulina. La diferenciación de seis etapas progresa desde la formación definitiva del endodermo hasta las células funcionales similares a las células β que secretan insulina en respuesta a la glucosa.
Abstract
Las células madre pluripotentes humanas (hPSC, por sus siglas en inglés) pueden diferenciarse en cualquier tipo de célula, lo que las convierte en una excelente fuente alternativa de células β pancreáticas humanas. Las hPSC pueden ser células madre embrionarias (hESC) derivadas del blastocisto o células pluripotentes inducidas (hiPSC) generadas directamente a partir de células somáticas mediante un proceso de reprogramación. Aquí se presenta un protocolo basado en video para describir las condiciones óptimas de cultivo y paso para las hPSC, antes de su diferenciación y posterior generación de células pancreáticas productoras de insulina. Esta metodología sigue el proceso de seis etapas para la diferenciación dirigida a las células β, en el que las hPSC se diferencian en endodermo definitivo (DE), tubo intestinal primitivo, destino del intestino anterior posterior, progenitores pancreáticos, progenitores endocrinos pancreáticos y, en última instancia, células β pancreáticas. Cabe destacar que esta metodología de diferenciación tarda un periodo de 27 días en generar células β pancreáticas humanas. El potencial de la secreción de insulina se evaluó a través de dos experimentos, que incluyeron inmunotinción y secreción de insulina estimulada por glucosa.
Introduction
Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) tienen la capacidad única de diferenciarse en varios tipos de células, lo que las convierte en una alternativa viablea las células β pancreáticas humanas. Estas hPSCs se clasifican en dos tipos: células madre embrionarias (hESCs), derivadas del blastocisto2, y células pluripotentes inducidas (hiPSCs), generadas por la reprogramación directa de células somáticas3. El desarrollo de técnicas para diferenciar las hPSCs en células β tiene importantes implicaciones tanto para la investigación fundamental como para la práctica clínica 1,4. La diabetes mellitus es una enfermedad crónica que afecta a >400 millones de personas en todo el mundo y es el resultado de la incapacidad del organismo para regular la glucemia debido a un mal funcionamiento o pérdida de las células β pancreáticas5. La limitada disponibilidad de células de los islotes pancreáticos para trasplante ha dificultado el desarrollo de terapias de reemplazo celular para la diabetes 2,4,6,7. La capacidad de generar células secretoras de insulina sensibles a la glucosa utilizando hPSC sirve como un modelo celular útil para estudiar el desarrollo y la función de los islotes humanos. También se puede utilizar para probar posibles candidatos terapéuticos para el tratamiento de la diabetes en un entorno controlado. Además, las hPSC tienen el potencial de producir células de los islotes pancreáticos que son genéticamente idénticas al paciente, lo que reduce el riesgo de rechazo inmunológico después del trasplante 2,4,7.
En los últimos años, se han producido avances significativos en el perfeccionamiento de los protocolos de cultivo y diferenciación de hPSC, lo que ha dado lugar a un aumento de la eficiencia y la reproducibilidad del proceso de diferenciación hacia la generación de células β pancreáticas 8,9.
El siguiente protocolo describe las etapas esenciales de la diferenciación dirigida de las células β pancreáticas. Implica la regulación de vías de señalización celular específicas en distintos puntos de tiempo. Se basa en el protocolo desarrollado por Sui L. et al.10 (2018) para la generación de hPSCs en células β pancreáticas. El protocolo se ajustó a las recientes actualizaciones de Sui L. et al.11 (2021), ya que las últimas investigaciones enfatizan la importancia del uso del tratamiento con afidiolina (APH) para mejorar la diferenciación de las células β. El protocolo actual incluye la adición de APH al medio durante las últimas etapas del proceso. Además, se han realizado modificaciones en la composición del medio durante las primeras etapas de diferenciación en comparación con el protocolo inicial. Un cambio notable es la adición del factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) en el día 6 y continúa hasta el día 8. El factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) se introduce desde el día 6 hasta el día 8, lo que difiere ligeramente del protocolo inicial10, donde el KGF no se incluyó en el medio de la etapa 4.
El primer y esencial paso en la generación de células similares a las células β es la diferenciación dirigida de las hPSC en endodermo definitivo (DE), una capa germinal primitiva que da lugar al revestimiento epitelial de varios órganos, incluido el páncreas. Después de la formación de DE, las células experimentan una diferenciación en el tubo intestinal primitivo, que es seguida por la especificación del destino del intestino anterior posterior. Luego, el intestino anterior posterior se convierte en células progenitoras pancreáticas, que tienen el potencial de diferenciarse en todos los tipos de células del páncreas, incluidas las células endocrinas y exocrinas. La etapa posterior del proceso involucra a los progenitores endocrinos pancreáticos que dan lugar a las células secretoras de hormonas que se encuentran en los islotes de Langerhans. Al final, el proceso de diferenciación llega a su etapa final al producir células pancreáticas de tipo β completamente funcionales 9,10. Es importante destacar que este proceso es complejo y muchas veces requiere la optimización de las condiciones de cultivo, como factores de crecimiento específicos y componentes de la matriz extracelular, para mejorar la eficiencia y especificidad de la diferenciación 9,10. Además, la generación de células funcionales similares a las células β a partir de hPSC in vitro sigue siendo un reto importante. La investigación en curso se centra en mejorar los protocolos de diferenciación y mejorar la maduración y función de las β-células resultantes9.
En este protocolo, el uso de la disociación celular suave durante el cultivo y el paso de hPSCs es esencial para mantener la viabilidad y pluripotencia celular, mejorando significativamente la eficiencia de la diferenciación en células β pancreáticas. Además, cada medio específico de la etapa se ha optimizado meticulosamente siguiendo el protocolo desarrollado por Sui L. et al.10 para promover un alto rendimiento de células secretoras de insulina en grupos que se asemejan mucho al islote humano.
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Protocol
Antes de iniciar la diferenciación, se recomienda determinar el número requerido de organoides similares a islotes con fines experimentales. En una placa de 6 pocillos, un solo pocillo con más del 80% de confluencia suele constar de 2-2,3 millones de hPSC. Si bien una predicción precisa es un desafío debido a las variaciones en las líneas de hPSC y la eficiencia de diferenciación, una estimación aproximada es 1,5 veces el número de pozos iniciales. Una diferenciación dirigida de manera efectiva generalmente produce de 1,6 a 2 millones de células por pocillo en placas de seis pocillos, que abarcan todas las células dentro de los grupos en lugar de exclusivamente células productoras de insulina. Para un grupo de 50 μm, se puede estimar que contiene alrededor de 10.000 células. La Tabla 1 proporciona un resumen de la composición del medio utilizado para cada día/etapa de diferenciación dirigida sobre la matriz de células madre y el medio, junto con el tampón de secreción de insulina estimulado por glucosa.
1. Paso de células madre pluripotentes humanas previa diferenciación en placas de 6 pocillos
NOTA: El paso apropiado de las células madre humanas antes de diferenciarlas en células similares a las células β es un paso crucial en el establecimiento del proceso experimental. La dilución de paso incorrecto o el número de celdas de unión pueden comprometer la eficiencia y la fidelidad de la diferenciación.
- Prepare el medio de cultivo de células madre, el recubrimiento y las soluciones de disociación (como se especifica en la Tabla 1).
- 1-2 h antes del pase, recubra una placa de seis pocillos con solución de recubrimiento en frío (1 ml por pocillo) e incube a 37 °C, 5% de CO2.
- Calentar una alícuota de medio de cultivo de células madre a temperatura ambiente (15 -25 °C) durante 20 min.
- Aspire el medio de células madre y agregue 1 ml de D-PBS libre de calcio/magnesio.
- Repita el paso 1.4. dos veces.
NOTA: Se agrega D-PBS para lavar las células y eliminar el medio y los compuestos anteriores. Es importante tener en cuenta que no se requiere un marco de tiempo específico para los pasos de lavado, ya que la exposición a D-PBS no daña las hPSC, evitando la ruptura o contracción celular causada por ósmosis. - Aspirar D-PBS, añadir 500 μL de solución de disociación para cada pocillo y dejar reposar durante 2-5 min a temperatura ambiente (15 - 25 °C).
- Mientras las células se disocian, aspire la solución de recubrimiento de la nueva placa de 6 pocillos y agregue 1-2 ml de D-PBS libre de calcio/magnesio a cada pocillo.
- Compruebe regularmente el proceso de disociación bajo el microscopio invertido.
- Aspire la solución de disociación cuando el 80 - 90% de las células se hayan redondeado pero aún estén adheridas.
- Agregue 1 mL del medio de células madre que contenga 10 μM de inhibidor de ROCK.
- Recoja las células disociadas en un tubo cónico de 15 ml utilizando puntas de pipeta filtradas estériles de 1.000 μl y una pipeta P1000.
- Triture lentamente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo en la pipeta con una punta filtrada de pipeta estéril de 1.000 μL para romper las colonias, pero no exceda de 10 veces.
- Añadir 1 mL del medio de células madre que contiene el inhibidor de ROCK para ayudar a separar las hPSC restantes y transferir la suspensión celular al mismo tubo cónico de 15 mL (1.10).
- Aspire el D-PBS de la placa recién recubierta e inmediatamente agregue la suspensión celular del tubo cónico de 15 mL. Para asegurar un crecimiento celular óptimo, siembre un rango de 2 x 105- 1 x 106 celdas viables por pocillo cuando use una placa de 6 pocillos (1 en 10 a 1 en 50 divisiones).
NOTA: Para el cálculo del volumen, cada pocillo de una placa de 6 pocillos debe contener 2 ml de medio de células madre con inhibidor de ROCK. - Mueva el plato rápidamente hacia adelante y hacia atrás, y de lado a lado de 5 a 10 veces.
- Colocar la placa a 37 °C, 5% CO2 incubadora durante 24 h.
- Reemplace con medio de células madre frescas sin inhibidor de ROCK al día siguiente, y luego cada 2 días hasta que la confluencia de hPSC haya alcanzado el 80 - 95%.
2. Diferenciación dirigida de células β derivadas de células madre humanas
NOTA: Las hPSC se pueden utilizar para el proceso de diferenciación directa en células β pancreáticas cuando se alcanza una confluencia del 80-95%.
- Día -1: Pasaje de las células Día -1 de diferenciación:
- 1-2 h antes del paso, cubra una placa de 6 pocillos con una solución de recubrimiento frío en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C durante 1 h.
- Siga los pasos 1.1 a 1.10 y proceda a contar las celdas.
- Cargue 10 μL de la mezcla de celdas, agregue un volumen igual de azul de tripano y mezcle suavemente.
- Calcula la concentración celular. Utilice 0,8 × 106 células/ml - 1,0 x 106 células/ml de medio de células madre que contenga 10 μM de inhibidor de ROCK para colocar la placa de 6 pocillos recubierta con 2 ml de medio por pocillo.
- Mueva el plato rápidamente hacia adelante y hacia atrás, de lado a lado tres veces.
- Coloque la placa en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 . Mueva rápidamente el plato hacia adelante y hacia atrás, y de lado a lado nuevamente 10 veces. A continuación, incubar la placa durante 4 h.
NOTA: Asegúrese de que la fijación máxima y la distribución uniforme de las células no perturben las células moviendo la placa una vez colocada en la incubadora. Abra y cierre la incubadora con mucho cuidado. - Coloque el frasco de medio basal durante los días 0 a 4 a 4 °C para descongelarlo durante la noche.
- Día 0
NOTA: Las hPSCs deben ser 80 - 95% confluentes, no iniciar el proceso de diferenciación al endodermo definitivo bajo esa confluencia.- Con hielo, descongele tanto el medio basal para los días 0 a 4 como los suplementos (ver Tabla de Materiales).
- Prepare en dos tubos cónicos solo el volumen necesario para ser utilizado el día 1 (2 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos), y en un tubo separado, duplique el volumen del día 2,5 a 4 (2 x 2 ml por pocillo de un plato de 6 pocillos). Conservar del día 2,5 al día 4 a 4 °C.
- Calentar una alícuota del volumen necesario del medio del día 1 y del medio de lavado 1 en un baño de agua a 37 °C durante 5 min.
- Aspire el medio de células madre y agregue 2 ml de medio de lavado 1.
NOTA: El medio de lavado utilizado en el protocolo consiste en el medio basal específico para cada día/etapa, suplementado con antibióticos al 1%. Las etapas de lavado del protocolo de diferenciación directa solo implican la adición del medio de lavado designado (denominado "medio de lavado 1 o 2", Tabla de materiales) y la aspiración posterior, siguiendo el procedimiento descrito 2.2.4. Es importante mencionar que no hay un marco de tiempo específico indicado para estos pasos de lavado. - Aspire el medio de lavado 1 e inmediatamente agregue 2 ml del medio del Día 1 al costado del pozo.
- Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h.
- Día 1
- Precalentar una alícuota del volumen necesario de los días 2,5 a 4 medios en un baño de agua a 37 °C durante 5 min.
- Aspire el medio del Día 1 e inmediatamente agregue 2 mL del medio del Día 2.5 a 4 al costado del pozo. No lave las células.
- Vuelva a colocar la placa a 37 °C y 5% de CO2 durante 36 h.
- Días 2.5 a 4
- Precalentar una alícuota del volumen restante del medio de 2,5 a 4 días en baño maría a 37 °C durante 5 min.
- Aspire el medio e inmediatamente agregue 2 mL de medio recién preparado de los días 2.5 a 4 al costado del pocillo.
- Vuelva a colocar la placa a 37 °C y 5% de CO2 durante 36 h.
- Día 4
NOTA: En esta etapa, la expresión de los marcadores definitivos del endodermo está en su máximo y las células pueden iniciar la diferenciación primitiva del tubo intestinal.- Preparar una alícuota del volumen necesario del medio de la etapa intestinal primitiva del día 4 (2 ml por pocillo de una placa de seis pocillos) y calentarlo a temperatura ambiente (15 °C -25 °C) durante 20 min.
- Aspirar los días 2.5 a 4 medio y agregar 2 mL de medio de lavado 1.
- Aspire el medio de lavado 1 e inmediatamente agregue 2 ml de la etapa intestinal primitiva del día 4 al costado del pozo.
- Vuelva a colocar la placa a 37 °C y 5% de CO2 durante 48 h.
- Días 6 a 8
NOTA: En esta etapa, las células inician una mayor diferenciación hacia el destino posterior del intestino anterior.- Preparar el volumen necesario de medio del intestino anterior posterior de los días 6 a 8 (2 mL por pocillo de una placa de 6 pocillos) y calentar el medio a temperatura ambiente (15 °C -25 °C) durante 20 min.
- Aspire el medio del día 4 e inmediatamente agregue 2 ml del medio del intestino anterior posterior de los días 6 a 8 al costado del pozo.
- Colocar la placa a 37 °C incubadora conteniendo 5% de CO2 durante 48 h.
- Días 8 a 12
NOTA: Las células están listas para someterse a la diferenciación de los progenitores pancreáticos.- Preparar el volumen necesario de los días 8 a 12 del medio de la etapa de progenitores pancreáticos (2 mL por pocillo de una placa de 6 pocillos) y calentar el medio a temperatura ambiente (15 °C -25 °C) durante 20 min.
- Aspire los días 6 a 8 medio e inmediatamente agregue 2 mL del medio del intestino anterior posterior de los días 6 a 8 al costado del pozo.
- Colocar la placa en una incubadora a 37 °C que contenga un 5% de CO2 durante 48 h.
- Día 12: Realización del paso de agrupación en clústeres
NOTA: En esta etapa, las células forman una monocapa densa y se pasarán al cultivo celular 3D para formar grupos. Este paso es crucial para la diferenciación con el fin de mejorar la semejanza estructural de las células similares a β con los islotes humanos nativos, pero también mejora su semejanza funcional tanto a nivel celular como de racimo11 (Figura 1).- Trate una placa de 6 pocillos que contenga micropocillos de 400 μm (como se especifica en la Tabla de materiales: Diferenciación dirigida de células β derivadas de células madre humanas, día 12) con 2 ml de solución de enjuague antiadherente a temperatura ambiente (15 °C - 25 °C).
NOTA: El micropocillo evita que las células se adhieran al fondo del pocillo y facilita la formación mecánica de grupos 3D. - Plato centrífugo a 1.300 x g durante 5 min.
- Compruebe la presencia de burbujas bajo un microscopio invertido. Si no se observan burbujas, aspirar la solución de enjuague antiadherente y añadir inmediatamente 2 mL de medio de lavado 2 (Tabla de materiales).
- Repita el paso 1.8.3. dos veces.
- Preparar el volumen necesario del medio del racimo y calentarlo a temperatura ambiente (15 -25 °C) durante 20 min. Asegúrese de que dos pocillos de una placa de 6 pocillos entren en un pocillo de la placa de 6 pocillos de micropocillos de 400 μm con 4 ml del medio del racimo.
- Aspirar el medio progenitor pancreático y añadir tampón de disociación (0,5 ml por pocillo).
- Incubar a temperatura ambiente (15 °C - 25 °C) durante 2-5 min. Compruebe regularmente el proceso de disociación bajo un microscopio invertido y aspire el tampón de disociación cuando la mayoría de las células se hayan redondeado pero aún estén adheridas.
- Aspire el tampón de disociación e inmediatamente agregue 1 ml de medio de racimo a cada pocillo.
- Disocie las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo seis veces con una pipeta P1000 y puntas de filtro de 1.000 μL.
- Transfiera las células y la mezcla de medio del racimo a un tubo cónico de 50 ml.
- Agregue 1 ml del medio del racimo para recolectar todas las células restantes.
- Agregue el medio del racimo al volumen total necesario para que cada pocillo de la placa de micropocillos tenga 4 ml de medio de mezcla/celdas.
- Aspire el medio de lavado 2 de la placa de 6 pocillos de micropocillos y transfiera la suspensión celular. Incubar la placa a 37 °C durante 24 h.
- Trate una placa de 6 pocillos que contenga micropocillos de 400 μm (como se especifica en la Tabla de materiales: Diferenciación dirigida de células β derivadas de células madre humanas, día 12) con 2 ml de solución de enjuague antiadherente a temperatura ambiente (15 °C - 25 °C).
- Día 13: Manejo de las células después de la agrupación y cambio de sus medios a partir del día 13.
NOTA: Los clústeres son muy sensibles y requieren un manejo cuidadoso para garantizar su integridad y viabilidad en los días siguientes. Por lo tanto, es crucial monitorear de cerca los conglomerados durante el período posterior a la agrupación después del día 12. La evaluación y los ajustes regulares son esenciales para promover resultados exitosos en el proceso experimental.- Prepare el volumen necesario de medio para el día 13 (2 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos), y en un tubo cónico separado de 50 ml para el medio progenitor endocrino pancreático del día 15 al 20.
- Recoja lentamente los racimos de la placa de 6 pocillos de los micropocillos en un tubo cónico de 50 ml utilizando una pipeta p1000 y puntas filtradas de 1.000 μl.
- Agregue 1 ml de medio del día 13 para recolectar los racimos restantes y transfiera los racimos al tubo.
- Deje que las células se asienten naturalmente bajo gravedad en el fondo del tubo cónico durante 5 minutos.
- Aspire la mayor cantidad posible de sobrenadante del tubo sin alterar los grupos celulares. Las puntas de pipeta no deben tocar ni aspirar los grupos, sino solo el sobrenadante.
- Agregue el volumen necesario del medio del día 13 de acuerdo con lo siguiente: 1 pocillo de la placa de 6 pocillos de micropocillos va a tres pocillos de una placa de 6 pocillos de baja adherencia (2 ml de medio por pocillo).
- Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo, evitando los racimos de aspiración.
- Transfiera la suspensión a una placa de 6 pocillos de muy baja adherencia.
- Mueva el plato rápidamente hacia adelante y hacia atrás, de lado a lado seis veces.
- Incubar la placa a 37 °C durante 48 h.
- Realice los cambios de medio en todos los pasos siguientes hasta el final de la diferenciación como se describe en esta sección 2.9.
- Días 15 a 20
- Cambie al medio de la etapa progenitora endocrina pancreática cada 48 h hasta el día 21 de diferenciación recogiendo la suspensión celular en un tubo cónico de 50 ml y siguiendo los pasos 2.9.4 a 2.9.10 para el día 13.
- Días 21 al 27
NOTA: En esta etapa, los grupos se diferencian en células β pancreáticas.- Prepare el medio pancreático en etapa de β células.
- Cambie el medio cada dos días como se describe durante los días 15 a 21.
NOTA: Después del día 25, los organoides en forma de islotes pueden someterse a análisis para confirmar que son completamente funcionales.
3. Tinción de grupos de células β pancreáticas
NOTA: Realice este paso para estudiar la evaluación funcional de los conglomerados después de la diferenciación
- Recoja de cinco a diez grupos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml al final de la diferenciación.
- Fije los grupos celulares con 200 μL de PFA al 4% durante 15 min a temperatura ambiente.
- Añada 1 ml de PBS a los clústeres y retire el PBS con una punta de pipeta de 1.000 μl sin alterar los clústeres.
- Añadir 200 μL de sacarosa al 30% a los racimos e incubar durante la noche a 4 °C.
- Transfiera los racimos a un molde criogénico, retire la sacarosa adicional, agregue una gota de medio O.C.T. y mezcle los racimos con medio O.C.T.
- Congele el criomold en hielo seco y guárdelo a -80 °C.
- Corte secciones de 5 μm del bloque congelado en portaobjetos de microscopio utilizando un micrótomo o criostato.
- Guarde los portaobjetos a -80 °C en el congelador hasta que se manchen.
- El día de la tinción, saque los portaobjetos del congelador a -80 °C.
- Retire con cuidado el hielo alrededor de las secciones del criomolde.
- Encierre en un círculo los grupos de células en portaobjetos con un bolígrafo hidrofóbico.
- Rehidrate los portaobjetos en un frasco de tinción de portaobjetos que contenga PBS durante 15 min.
- Agregue metanol frío al frasco de tinción de portaobjetos y coloque el frasco con portaobjetos a -20 °C durante 10 min.
- Sumerge las diapositivas en un frasco de PBS.
- Repita el paso 3.14 tres veces.
NOTA: Utilice este método para todos los siguientes pasos de lavado. - Retire el PBS de los portaobjetos y cúbralo inmediatamente con 100 μL de solución de bloqueo con 2-5% de BSA en PBS-T.
- Agregue la solución de bloqueo a cada portaobjetos y cúbralo con una película de parafina.
- Incubar durante 1 h a temperatura ambiente (15 -25 °C).
- Diluir los anticuerpos primarios en la solución bloqueante utilizando las proporciones proporcionadas en la sección Reactivos y soluciones.
- Retire la solución de bloqueo de los portaobjetos.
- Agregue inmediatamente anticuerpos diluidos y cubra los portaobjetos con parafilm para evitar que el portaobjetos se seque.
- Incubar durante la noche a 4 °C.
- Al día siguiente, lave los portaobjetos de 3 a 5 veces con PBS-T.
- Preparar anticuerpos secundarios diluidos y tinción de ADN.
- Retire el exceso de PBS-T de los portaobjetos.
- Agregue anticuerpos secundarios diluidos y tinción de ADN. Incubar durante 45 min a temperatura ambiente (15 -25 °C).
- Lave los portaobjetos de 3 a 5 veces con PBS-T.
- Retire cualquier líquido de los portaobjetos.
- Agregue una gota de medio de montaje histológico a cada sección.
- Cubra el portaobjetos con una cubierta de vidrio.
- Tome fotografías de los portaobjetos teñidos con un microscopio fluorescente.
4. GSIS (ensayo de secreción de insulina estimulada por glucosa)
- Prepare tres soluciones diferentes: solución KREBS baja en glucosa, solución KREBS alta en glucosa y solución KREBS baja en glucosa con KCl.
- Calentar todas las soluciones a 37 °C baño de agua.
- Seleccione cuidadosamente entre 10 y 15 grupos de tamaño similar con una punta de pipeta de 1000 μL y transfiérelos a un tubo de 1,5 ml junto con una pequeña cantidad de medio diferenciado para evitar que se sequen los grupos.
NOTA: Los grupos deben ser visibles a simple vista, pero si no es así, coloque la placa que contiene los grupos diferenciados bajo un microscopio invertido para seleccionar los grupos y transferirlos a un tubo de 1,5 ml. - Coloque el tubo con los racimos y el medio en una rejilla para tubos y espere a que los racimos se hundan hasta el fondo del tubo.
- Aspirar lentamente el sobrenadante con una pipeta de 200 μL y añadir 200 μL de solución KREBS baja en glucosa.
- Incubar los islotes en la solución baja en glucosa durante 1 h a 37 °C.
NOTA: Para garantizar la evaluación precisa del número de racimos y la consistencia en los experimentos, se recomienda verificar la presencia de todos los conglomerados en la solución durante la transferencia, ya que tienden a adherirse al tubo. - Retire el tubo de la incubadora y aspire lentamente 200 μL de solución KREBS sin aspirar ningún racimo.
- Añadir 200 μL de solución KREBS baja en glucosa e incubar durante 30 min a 37 °C.
- Aspire el volumen de 200 μL de solución KREBS baja en glucosa en un tubo de 500 μL y guárdelo inmediatamente a -80 °C para mediciones de insulina. Repita para tratamientos separados.
- Para lavar los racimos, añadir 200 μL de solución KREBS sin glucosa al tubo que contiene los racimos. Deje que los racimos se asienten en el fondo del tubo y retire con cuidado el sobrenadante sin perturbar los racimos.
- Añadir 200 μL de solución KREBS con alto contenido de glucosa e incubar durante 30 min a 37 °C.
- Aspire 200 μL de KREBS de glucosa alta en un tubo de 500 μL y guárdelo inmediatamente a -80 °C para la medición de insulina. Repita para tratamientos separados.
- Para lavar los racimos, añadir 200 μL de solución KREBS sin glucosa al tubo que contiene los racimos. Deje que los racimos se asienten en el fondo del tubo y retire con cuidado el sobrenadante sin perturbar los racimos.
- Agregue 200 μL de solución de KCl KREBS y repita para tratamientos separados.
- Incubar durante 30 min a 37 °C.
- Aspirar 200 μL de solución KREBS de KCl en un tubo de 500 μL y almacenarlo inmediatamente a -80 °C para mediciones de insulina. Repita el procedimiento para otros tratamientos.
- Añadir 50 μL de agua ultrapura y proceder a medir el contenido total de insulina.
- Añadir 150 μL de solución ácida de etanol al tubo con islotes y agua ultrapura.
- Almacenar las muestras a 4 °C durante la noche (12 - 15 h).
- Al día siguiente, vórtice cada muestra.
- Realice la sonicación con un sonicador eléctrico ajustado al 20% de potencia durante 1 s para garantizar una lisis completa del tejido de los islotes.
NOTA: Repita el paso 4.21 hasta que no queden clústeres visibles. - Centrifugar todas las muestras a 10.000 × g durante 10 min y mantener el sobrenadante.
- Mida la concentración de ADN con un espectrofotómetro de nanogotas, que luego se puede usar para normalizar las mediciones de insulina.
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Representative Results
El protocolo descrito en este artículo ofrece un enfoque altamente eficiente para diferenciar las células similares a β de las hPSC10. Este proceso utiliza un sistema de cultivo 2D que es fácilmente escalable, lo que permite su uso en diversos entornos experimentales, como el aprendizaje de la diferenciación, proyectos y laboratorios más pequeños, y pruebas piloto para evaluar el potencial de una línea iPSC para la diferenciación.
Es esencial caracterizar las propiedades funcionales de las células β diferenciadas en los islotes para obtener información sobre la homeostasis de la glucosa. Por lo general, esto se logra a través de varios experimentos, como la inmunotinción para marcadores de células β y la expresión de insulina, así como ensayos de secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS), que prueban la función de los islotes en respuesta a concentraciones bajas y altas de glucosa12,13. Las células β poseen genes característicos, incluidos Nkx2-2, Pdx1, Nkx6-1 y Neurod1, que son fundamentales para establecer y mantenerla identidad de las células β. Las técnicas de inmunotinción son valiosas para investigar la expresión y localización de proteínas dentro de secciones de tejido. La inmunotinción para marcadores de células β puede evaluar los niveles de expresión de marcadores clave del linaje pancreático, proporcionando información sobre la fidelidad y optimización del proceso de diferenciación para aplicaciones específicas 9,12.
En este estudio, se utilizó la línea reportera Mel1 InsGFP/w (Mel1 INS-GFP)14 hESC para diferenciar grupos que comprenden diferentes tipos de células, incluidas las células β que se asemejan a las que se encuentran en los islotes nativos humanos. La Figura 2 de este artículo ofrece hallazgos significativos con respecto a la eficiencia y precisión del proceso de diferenciación. Los resultados demuestran un alto enriquecimiento de las células que expresan insulina dentro del linaje pancreático, y estas células exhiben secreción de insulina estimulada por glucosa. Esto indica la generación exitosa de células funcionales similares a las β a través del proceso de diferenciación.
Las células diferenciadas fueron estimuladas con concentraciones bajas y altas de glucosa, y los resultados del GSIS mostraron que los grupos derivados de las células Mel1 funcionaban de manera similar a los islotes en su respuesta de secreción de insulina a la glucosa. Se encontró que los grupos derivados de Mel1 secretan 100 veces más insulina en respuesta a altas concentraciones de glucosa en comparación con bajas concentraciones de glucosa. En concreto, el contenido de insulina fue de 0,003 ± 0,002% a 3,3 mM de glucosa baja y de 0,236 ± 0,197% a 16,7 mM de glucosa alta.
Los conglomerados derivados de las hESCs Mel1 INS-GFP se sometieron a análisis adicionales para determinar su composición y funcionalidad, además del ensayo GSIS. En concreto, se investigó la expresión de los genes de firma de las células β y la presencia de diferentes tipos celulares dentro de los grupos. Los resultados mostraron que el linaje pancreático obtenido de este proceso está altamente enriquecido en células insulin-positivas, lo que indica un alto nivel de éxito en el proceso de diferenciación de hESCs en células similares a células β. Además, se examinó la expresión de genes característicos, como Nkx6.1 y Pdx1, importantes para el establecimiento y mantenimiento de las identidades de las células β. El análisis reveló que aproximadamente el 25% y el 40% de las células expresaban Nkx6.1 y Pdx1, respectivamente, lo que proporciona evidencia adicional de que los grupos contenían células diferenciadas similares a β (media de células Nkx6.1+ por grupo 24.9% ± 6.2%, n=9 grupos, células Pdx1+ 40.2% ± 6.2%, n=9, SEM, Figura 2). Además, los grupos contenían otros tipos de células, como las células positivas para glucagón, que representaban alrededor del 15% de la población celular total. Estas células se encuentran típicamente en las células alfa de los islotes nativos de Langerhans, lo que sugiere que los grupos se parecen mucho a los islotes humanos en términos de composición celular.
Figura 1: Diferenciación de hPSCs hacia células β pancreáticas. (A) Representación esquemática de la diferenciación dirigida in vitro de hPSCs en células β pancreáticas, que implica seis etapas sucesivas: inducción definitiva del endodermo, formación del tubo intestinal primitivo, especificación del destino del intestino anterior posterior, generación de progenitores pancreáticos, formación de progenitores endocrinos pancreáticos y, en última instancia, diferenciación de células β pancreáticas. La diferenciación de células β pancreáticas utiliza etapas clave del desarrollo de los islotes humanos, con la regulación de vías de señalización celular específicas en momentos específicos. B27: Suplemento B-27; Ri: inhibidor de la proteína quinasa asociada a rho o inhibidor de ROCK; T3: hormona tiroidea; KGF: proteína humana KGF / FGF-7; RepSox: Inhibidor de la vía de la activina/ganglio/TGF-β; inhibe ALK5; AR: Ácido retinoico; ZS: sulfato de zinc; HNF: heparina no fraccionada; XX: inhibidor de la gamma-secretasa XX; APH: afidicolina; EGF: factor de crecimiento epidérmico; LDN: Inhibidor de BMP III, LDN-212854; Ciclo: Ciclopamina- KAAD. (B) Imágenes de la morfología celular capturadas en varias etapas de diferenciación de células madre pluripotentes a células β pancreáticas. La primera imagen muestra células madre pluripotentes humanas en el primer día de diferenciación (monocapa de HPSC). (C) En el día 11, las células están en la etapa progenitora pancreática. Barra de escala de 100 μm. (D) En el día 12, se forman grupos en los micropocillos de la placa de 6 pocillos después de la disociación de las células en la etapa progenitora pancreática. (E) En el día 13, los racimos están en una placa de 6 pocillos de baja adhesión. Barra de escala de 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Se evaluaron los conglomerados obtenidos a partir de la línea14 reportera diferenciada de Mel1 InsGFP/w hESC para determinar la presencia de células productoras de insulina que expresan marcadores de madurez de células β. (A) Las imágenes de inmunofluorescencia de los grupos se capturaron de secciones de criomoldo (5 μm) utilizando microscopía confocal de disco giratorio, que reveló el predominio de células productoras de insulina (aproximadamente 60%) en comparación con las células productoras de glucagón (aproximadamente 15%) (n = 9 grupos, aproximadamente 18.000 células, SEM). (B) Las imágenes de inmunofluorescencia de los grupos se obtuvieron a partir de secciones de criomold (5 μm) utilizando microscopía confocal de disco giratorio, que mostró el predominio de células productoras de insulina que coexpresan los marcadores pancreáticos de células β Nkx6.1 (n = 9 grupos, aproximadamente 18.000 células). (C) Se empleó la macro contadora de células ImageJ, diseñada específicamente para la inmunotinción de marcadores, para determinar el porcentaje de células positivas para insulina, glucagón positivo y marcadores de células β Nkx6.1 y células positivas para marcadores de células β Pdx1. (D) Se evaluó la secreción de insulina estimulada por glucosa de los grupos derivados de Mel1 InsGFP/w hESC, que mostraron un aumento de 100 veces en respuesta a la estimulación con glucosa alta (16,7 mM de glucosa) en los grupos diferenciados (n = 9, SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Resumen de la composición de los medios para la diferenciación dirigida. Esta tabla proporciona un resumen de la composición del medio utilizado para cada día/etapa de diferenciación dirigida en la parte superior de la matriz de células madre y el medio, junto con el tampón de secreción de insulina estimulado por glucosa. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
El éxito de la diferenciación de las hPSC en células β pancreáticas depende de la optimización de todos los aspectos del cultivo rutinario y del paso de las hPSC seleccionadas. Esto incluye asegurarse de que la línea celular tenga un cariotipo normal, sea negativa para la infección por micoplasma y esté libre de genomas de plásmidos o vectores virales. Además, cuando se utilizan hiPSC, es importante evitar el uso de los primeros pasajes que aún están en proceso de reprogramación, para experimentos piloto. Estos experimentos deben llevarse a cabo a pequeña escala para identificar la línea hPSC con el mejor potencial de diferenciación y el número óptimo de pasajes.
Otros parámetros que pueden influir en la eficiencia de la diferenciación incluyen la calidad del medio de células madre utilizado, la densidad del recubrimiento y el número de pasadas10,12. Este protocolo se ha optimizado para maximizar la eficiencia de la diferenciación al garantizar que todos los parámetros relevantes estén optimizados10.
En cada etapa se utilizan medios de diferenciación con formulaciones específicas para apoyar la diferenciación de hPSC en células β. La activina A y un agonista Wnt se utilizan en el medio de diferenciación para iniciar la transición a las células del endodermo definitivo. Durante la etapa primitiva del tubo intestinal, se agrega KGF al medio para promover una mayor diferenciación en células β15, y esta inclusión de KGF se mantiene desde el día 6 hasta el día 8, diferenciándose del protocolo original de Sui, Egli et al.10. Durante la etapa progenitora pancreática, la composición específica del medio se optimiza para mejorar la expresión del factor de transcripción Pdx1. Esto se logra mediante el uso de una alta concentración de ácido retinoico (AR), KGF y LDN193189, que inhibe la vía de la proteína morfogenética ósea (BMP)8. A medida que la diferenciación progresa a la etapa endocrina, el medio de cultivo se modifica para regular a la baja la señalización de Notch. Esto se logra mediante la incorporación de XXI, un inhibidor de la γ-secretasa, junto con T3 (hormona tiroidea), AR y RepSox, un inhibidor de la vía Activina/BMP/TGF-β8. Esta combinación específica de compuestos se utiliza para promover la diferenciación de los progenitores pancreáticos en progenitores endocrinos. Finalmente, para optimizar el proceso de diferenciación directa, se introduce aphidicolina (APH) durante la diferenciación de progenitores pancreáticos a progenitores endocrinos. Esta adición de APH tiene como objetivo mejorar aún más la diferenciación de las células β, y representa una modificación distinta del protocolo inicial propuesto por Sui, Egli, et al.10,11.
Durante el proceso de diferenciación, es crucial controlar la densidad celular y evitar la sobreconfluencia, ya que esto puede dificultar la diferenciación adecuada. Los cultivos de alta densidad pueden mantener una alta expresión de Oct4, inhibiendo la diferenciación hacia el endodermo definitivo. La eliminación del inhibidor de ROCK durante el primer paso de lavado es esencial para iniciar la diferenciación y permitir que se altere el estado pluripotente de las hPSC. El uso de un marcador de fluorescencia, como Mel1 INS-GFP con un GFP integrado en el locus de la insulina, facilita la evaluación del progreso de la diferenciación en las etapas de progenitor pancreático y β células, lo que ayuda a los experimentos posteriores14.
El protocolo actual para diferenciar células madre pluripotentes humanas en células similares a la β pancreática ha demostrado variabilidad en la eficiencia entre diferentes líneas de hPSC10. Además, las células similares a β resultantes exhiben inmadurez funcional en comparación con los islotes pancreáticos humanos, mostrando una menor secreción de insulina por célula. Para abordar aún más esta limitación, la maduración in vivo de células similares a β puede lograrse mediante el trasplante de organoides de islotes en modelos animales durante las etapas finales de diferenciación 6,7.
A pesar de estas limitaciones, la diferenciación de las hPSCs en células β pancreáticas tiene un potencial significativo con respecto a los métodos existentes 8,9,10. Esta técnica permite producir un gran número de células similares a las células β que responden a la glucosa y expresan marcadores de células β (Pdx1 y Nkx6.1, ver Figura 2). Esto se hace sin las limitaciones éticas, técnicas y de origen asociadas con el uso de islotes pancreáticos humanos. Además, esta técnica tiene el potencial de ser aplicada a la medicina personalizada, ya que se pueden generar células β específicas del paciente para pruebas de fármacos y modelado de enfermedades 4,6,7. La técnica también puede tener aplicaciones futuras en el tratamiento de la diabetes que impliquen la pérdida o disfunción de las células β pancreáticas 4,6,7.
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Acknowledgments
Ines Cherkaoui recibió el apoyo de una beca de Diabetes UK (BDA 18/0005934) a GAR, que también agradece al Wellcome Trust por un Premio al Investigador (212625/Z/18/Z), UKRI MRC por una subvención del Programa (MR/R022259/1), Diabetes UK por una subvención de Proyecto (BDA16/0005485), CRCHUM por fondos de puesta en marcha, Innovation Canada por un Premio John R. Evans al Líder (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) para una subvención de proyecto, y CIHR, JDRF para una subvención de equipo (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). Camille Dion y el Dr. Harry Leitch por su ayuda con la generación y el cultivo de hiPSCs humanas, la instalación de organoides del NIHR Imperial BRC (Centro de Investigación Biomédica), Londres.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube | Starlabs | S1615-5500 | |
| 6-well Cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 165218 | |
| AggreWell 400 6-well plate | STEMCELL Technologies | 34425 | |
| Anti-Glucagon | Sigma-aldrich | G2654-100UL | |
| Anti-Insulin | Dako | A0564 | |
| Anti-NKX6.1 | Novus Biologicals | NBP1-49672SS | |
| Anti-PDX1 | Abcam | ab84987 | |
| Aphidicolin | Sigma-Aldrich | A4487 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A3803-100G | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Calcium/Magnesium free D-PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Cyclopamine-KAAD | Calbiochem | 239804 | |
| D-(+)-Glucose,BioXtra | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Disodium hydrogen phosphate, anhydrous | Sigma-Aldrich | 94046-100ML- | |
| DMEM plus GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566016 | For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS. |
| DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
| Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
| Ethanol | VWR | 20821.33 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270098 | |
| Gamma-Secretase Inhibitor XX | Thermo Fisher Scientific | J64904 | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100. |
| Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-21435 | |
| Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150187 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Thermo Fisher Scientific | A-21052 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H3375-500G | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H1399 | |
| Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0094 | |
| Hydrogen chloride | Sigma-Aldrich | 295426 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Agar Scientific | AGG4582 | |
| LDN193189 | Sigma-Aldrich | SML0559-5MG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272-500G | |
| OCT Compound 118 mL | Agar Scientific | AGR1180 | |
| PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Penicillin-Streptomycin (PS) | Thermo Fisher Scientific, | 15070-063 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Recombinant Human EGF Protein | R&D Systems | 236-EG-200 | |
| Rectangular cover glasses, 22×50 mm | VWR | 631-0137 | |
| RepSox (Hydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72394 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 61870036 | For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS. |
| Shandon Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-500G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium dihydrogen phosphate anhydrous | Sigma-Aldrich | 7558-80-7 | |
| STEMdiff Endoderm | STEMCELL Technologies | 5110 | |
| StemFlex Medium | Thermo Fisher Scientific | A3349401 | Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium. |
| Stemolecule All-Trans Retinoic Acid | Reprocell | 04-0021 | |
| Thyroid Tormone 3 (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| TrypL Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P2287-500ML | |
| Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture | Thermo Fisher Scientific | 38071 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | Z4750 |
References
- Kolios, G., Moodley, Y. Introduction to stem cells and regenerative medicine. Respiration. 85 (1), 3-10 (2013).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Nair, G. G., Tzanakakis, E. S., Hebrok, M. Emerging routes to the generation of functional β-cells for diabetes mellitus cell therapy. Nature Reviews Endocrinology. 16 (9), 506-518 (2020).
- Diagnosis and classification of diabetes mellitus. American Diabetes Association. Diabetes Care. 32 (Supplement_1), S62-S67 (2009).
- Sui, L., et al. β-Cell Replacement in mice using human Type 1 diabetes nuclear transfer embryonic stem cells. Diabetes. 67 (1), 26-35 (2018).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Hogrebe, N. J., Maxwell, K. G., Augsornworawat, P., Millman, J. R. Generation of insulin-producing pancreatic β-cells from multiple human stem cell lines. Nature Protocols. 16 (9), 4109-4143 (2021).
- Jiang, J., et al. Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (8), 1940-1953 (2007).
- Sui, L., Leibel, R. L., Egli, D. Pancreatic β-cell differentiation from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 99 (1), e68 (2018).
- Sui, L., et al. Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size. JCI Insight. 6 (5), 141553 (2021).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- Rutter, G. A., Georgiadou, E., Martinez-Sanchez, A., Pullen, T. J. Metabolic and functional specialisations of the pancreatic β-cell: gene disallowance, mitochondrial metabolism and intercellular connectivity. Diabetologia. 63 (10), 1990-1998 (2020).
- Micallef, S. J., et al. INS(GFP/w) human embryonic stem cells facilitate isolation of in vitro derived insulin-producing cells. Diabetologia. 55 (3), 694-706 (2012).
- Finch, P. W., Rubin, J. S., Miki, T., Ron, D., Aaronson, S. A. Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth. Science. 245 (4919), 752-755 (1989).
