Profilage phénotypique des neurones dopaminergiques du mésencéphale dérivés de cellules souches humaines

Summary

Ce protocole décrit la culture cellulaire de neurones dopaminergiques du mésencéphale humain, suivie d’une coloration immunologique et de la génération de profils phénotypiques neuronaux à partir d’images microscopiques acquises à haut contenu permettant l’identification de variations phénotypiques dues à des modulations génétiques ou chimiques.

Abstract

La maladie de Parkinson (MP) est liée à une série de processus biologiques cellulaires qui provoquent la perte de neurones dopaminergiques du mésencéphale (mDA). De nombreux modèles cellulaires de MP in vitro actuels manquent de complexité et ne prennent pas en compte plusieurs phénotypes. Le profilage phénotypique dans les neurones mDA dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) peut remédier à ces lacunes en mesurant simultanément une gamme de phénotypes neuronaux dans un type de cellule pertinent pour la maladie de Parkinson en parallèle. Nous décrivons ici un protocole permettant d’obtenir et d’analyser des profils phénotypiques à partir de neurones mDA humains disponibles dans le commerce. Un panel de coloration fluorescente spécifique aux neurones est utilisé pour visualiser les phénotypes nucléaires, liés à la α-synucléine, à la tyrosine hydroxylase (TH) et à la protéine associée aux microtubules 2 (MAP2). Le protocole de profilage phénotypique décrit est évolutif car il utilise des plaques à 384 puits, une manipulation automatique des liquides et une microscopie à haut débit. L’utilité du protocole est illustrée par l’utilisation de neurones mDA donneurs sains et de neurones mDA porteurs de la mutation G2019S liée à la maladie de Parkinson dans le gène LRRK2 (Leucine-rich repeat kinase 2). Les deux lignées cellulaires ont été traitées avec l’inhibiteur de la kinase LRRK2 PFE-360 et les changements phénotypiques ont été mesurés. De plus, nous démontrons comment les profils phénotypiques multidimensionnels peuvent être analysés à l’aide de méthodes de classification supervisée basées sur le clustering ou l’apprentissage automatique. Le protocole décrit intéressera particulièrement les chercheurs travaillant sur la modélisation des maladies neuronales ou l’étude des effets des composés chimiques dans les neurones humains.

Introduction

Divers processus biologiques cellulaires sont perturbés dans la maladie de Parkinson (MP). Par exemple, un dysfonctionnement mitochondrial, un stress oxydatif, des défauts de dégradation des protéines, une perturbation du trafic vésiculaire et de la fonction endolysosomale ont été associés à une perte de neurones dopaminergiques du mésencéphale (mDA) sont couramment observés dans la MP¹. Par conséquent, la maladie de Parkinson semble impliquer de multiples mécanismes pathologiques qui peuvent interagir et s’aggraver mutuellement. Un moyen utile d’étudier cette interaction mécanistique est la création d’une empreinte phénotypique complète ou d’u....

Protocol

1. Préparation du milieu et des plaques pour l’ensemencement des neurones (Jour 1)

1. Pour préparer les plaques pour l’ensemencement des neurones au jour 1, réchauffez la laminine à température ambiante (RT) juste avant l’utilisation. Préparer la solution de laminine en diluant la solution mère de laminine (0,1 mg/mL) 1/10 dans du PBS+/+ froid (avec Ca 2⁺ et Mg²⁺).
   REMARQUE : Tous les réactifs sont répertoriés dans le tableau des matériaux. Les compositions des solutions et des tampons sont décrites dans les tableaux 1 à 4.
2. Ensuite, ajoutez 25 μL de la solution de laminine dan....

Results

Le profilage phénotypique dans les neurones mDA est un moyen efficace de quantifier de multiples aspects de la biologie cellulaire et leurs changements au cours de la modulation expérimentale. Pour illustrer cette méthodologie, cette étude a utilisé des neurones LRRK2 G2019S cryoconservés et des neurones mDA de donneurs sains. Ces neurones sont différenciés depuis environ 37 jours, sont des marqueurs neuronaux post-mitotiques et express (TUBB3 et MAP2) et des neurones dopaminergiques, y compris la tyrosine hydroxylase (T.......

Discussion

Le profilage phénotypique est une technique permettant de mesurer un grand nombre de phénotypes dans les cellules en appliquant des colorations fluorescentes, la microscopie et l’analyse d’images³. Des profils phénotypiques peuvent être obtenus et comparés entre des lignées cellulaires ou d’autres conditions expérimentales pour comprendre des changements complexes dans la biologie cellulaire qui pourraient passer inaperçus lors de l’utilisation d’une seule lecture. Nous décrivons ici l’application.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-poulet &ndash ; Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-souris - Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-lapin - Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase	Merck	T2928	Immunofluorescence
Anti-&alpha ;-synucléine	Abcam	138501	Immunofluorescence
Bravo Plateforme automatisée de manipulation de liquides avec tête 384ST	Agilent		Si aucun manipulateur de liquide n’est disponible, l’utilisation d’une pipette électronique multicanaux est recommandée.
Microscope confocal  ;	Yokogawa	CV7000	L’utilisation d’un microscope confocal à fluorescence automatisé est recommandée pour garantir la cohérence de la qualité de l’image.
Countess Compteur de cellules automatisé	Invitrogen		Comptage des cellules avant l’ensemencement. Peut également être effectué à l’aide d’une chambre de comptage manuelle.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Tampon pour le lavage
EL406 Distributeur de laveuse  ;	BioTek (Agilent)  ;		Si aucun manipulateur de liquide n’est disponible, l’utilisation d’une pipette électronique multicanaux est recommandée.
Solution de formaldéhyde (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fixation avant coloration
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Coloration nucléaire
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Milieu de base pour neurones
iCell DPN, Donneur#01279, Phénotype AHN, lot#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Donneur
apparemment sainiCell DPN, Donneur#11299, Phénotype LRRK2 G2019S, phénotype lot#106139	Fujifilm	C1149	Donneur porteur de la mutation LRRK2 G2019S  ;
Supplément pour système nerveux iCell	Fujifilm	M1031	Supplément pour support de base
Supplément neuronal iCell B Supplément	Fujifilm	M1029	pour support de base
Jupyter Python Notebook	Développement interne	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook pour effectuer la visualisation et la classification de profils phénotypiques à partir de données brutes.
Laminine	Biolamina	LN521	Revêtement de plaque
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	Inhibiteur de kinase LRRK2
PhenoLink	Développement interne	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Logiciel d’analyse d’images
PhenoPlate 384w, revêtement PDL	Perkin Elmer	6057500	Plaque pré-enduite pour la culture cellulaire et l’imagerie. Cette plaque permet d’imager tous les puits en utilisant tous les objectifs du microscope Yokogawa CV7000.
Plaques de stockage Abgene 120 µ ; L	Thermo Scientific	AB-0781	Nécessaire pour la distribution de composés à l’aide du système de pipetage Vprep. Si elle n’est pas disponible, l’utilisation d’une pipette électronique multicanaux est recommandée.
Triton	Sigma	T9284	Perméabilisation avant lyse
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Détermination des cellules vivantes
Système de pipetage Vprep  ;	Agilent		Changement moyen et distribution composée. Alternativement, une pipette électronique multicanaux peut être utilisée.