التنميط الظاهري للخلايا العصبية الدوبامينية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية في الدماغ المتوسط
Summary
يصف هذا البروتوكول زراعة الخلايا للخلايا العصبية الدوبامينية في الدماغ المتوسط البشري ، يليها تلطيخ مناعي وتوليد ملامح النمط الظاهري للخلايا العصبية من الصور المجهرية عالية المحتوى المكتسبة مما يسمح بتحديد الاختلافات المظهرية بسبب التحويرات الجينية أو الكيميائية.
Abstract
يرتبط مرض باركنسون (PD) بمجموعة من العمليات البيولوجية الخلوية التي تسبب فقدان الخلايا العصبية الدوبامينية في الدماغ المتوسط (mDA). تفتقر العديد من النماذج الخلوية PD الحالية في المختبر إلى التعقيد ولا تأخذ في الاعتبار الأنماط الظاهرية المتعددة. يمكن أن يعالج التنميط الظاهري في الخلايا العصبية mDA المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC) التي يسببها الإنسان أوجه القصور هذه عن طريق قياس مجموعة من الأنماط الظاهرية العصبية في وقت واحد في نوع الخلية ذات الصلة PD بالتوازي. هنا ، نصف بروتوكولا للحصول على ملفات تعريف النمط الظاهري وتحليلها من الخلايا العصبية mDA البشرية المتاحة تجاريا. يتم استخدام لوحة تلطيخ الفلورسنت الخاصة بالخلايا العصبية لتصور الأنماط الظاهرية ذات الصلة بالبروتين النووي ، α-synuclein ، هيدروكسيلاز التيروزين (TH) ، والبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 2 (MAP2). بروتوكول التنميط الظاهري الموصوف قابل للتطوير لأنه يستخدم ألواح 384 بئرا ومعالجة السوائل التلقائية والفحص المجهري عالي الإنتاجية. تتمثل فائدة البروتوكول في استخدام الخلايا العصبية mDA المانحة السليمة والخلايا العصبية mDA التي تحمل طفرة G2019S المرتبطة ب PD في جين كيناز 2 (LRRK2) الغني بالليوسين. تمت معالجة كلا خطي الخلايا بمثبط كيناز LRRK2 PFE-360 وتم قياس التغيرات الظاهرية. بالإضافة إلى ذلك ، نوضح كيف يمكن تحليل ملفات تعريف النمط الظاهري متعددة الأبعاد باستخدام طرق التصنيف الخاضعة للإشراف القائمة على التجميع أو التعلم الآلي. سيثير البروتوكول الموصوف اهتمام الباحثين الذين يعملون على نمذجة الأمراض العصبية أو دراسة تأثيرات المركبات الكيميائية في الخلايا العصبية البشرية.
Introduction
يتم إزعاج مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية الخلوية في مرض باركنسون (PD). على سبيل المثال ، ارتبط الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا ، والإجهاد التأكسدي ، وعيوب تحلل البروتين ، وتعطيل الاتجار الحويصلي ووظيفة الليزوزومات الداخلية بفقدان الخلايا العصبية الدوبامينية في الدماغ المتوسط (mDA) ، ويلاحظ بشكل شائع في PD1. لذلك ، يبدو أن مرض باركنسون ينطوي على آليات مرضية متعددة يمكن أن تتفاعل مع بعضها البعض وتزيد من تفاقمها. تتمثل إحدى الطرق المفيدة للتحقيق في هذا التفاعل الميكانيكي في إنشاء بصمة مظهرية شاملة أو ملف تعريف للخلايا العصبية الدوبامينية في الدماغ المتوسط (mDA).
التنميط الظاهري هو نهج يتضمن إنشاء ملف تعريف لعينة بناء على مجموعة من الخصائص القابلة للقياس ، وثانيا ، يتضمن إجراء تنبؤات حول عينة بناء على هذا الملف الشخصي 2,3. الهدف من التنميط هو التقاط مجموعة متنوعة من الميزات ، قد لا يكون بعضها مرتبطا سابقا بمرض أو علاج3. نتيجة لذلك ، يمكن أن يكشف التنميط عن عمليات بيولوجية غير متوقعة. يعتمد التنميط الظاهري عادة على الخلايا الملطخة بالفلورسنت ، وقد تم تطوير فحوصات موحدة ، مثل طلاء الخلية ، لإنشاء ملامح النمط الظاهري4. في الآونة الأخيرة ، تم تطبيق التنميط الظاهري ، على سبيل المثال ، لتوصيف الجزيئات الصغيرة أو التنبؤ الدقيق بأنواع PD الفرعية فقط بناء على الخلايا الليفية المشتقة من المريض 5,6. على الرغم من هذه التطورات ، نادرا ما تم تطبيق التنميط الظاهري على الخلايا المتمايزة بعد الانقسام ، مثل الخلايا العصبية mDA المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSC) والتي تعبر عن طفرات مرتبطة بمرض باركنسون مثل LRRK2 G2019S. تشمل التحديات الكبيرة للنماذج المشتقة من iPSC وجود سمات مرضية دقيقة أو متغيرة عبر دفعات التمايز أو الأنماط الجينية ، وحقيقة أن الأنماط الظاهرية المعزولة لمرض باركنسون لا تلتقط التعقيد الكامل للمرض. علاوة على ذلك ، في حين أن النماذج العصبية iPSC ذات صلة من الناحية الفسيولوجية ، إلا أنها نادرا ما تستخدم في عمليات اكتشاف أدوية PD بسبب مخاوف بشأن التعقيد التقني 7,8.
لقد طورنا سابقا منهجية قوية لقياس الأنماط الظاهرية الفيزيولوجية المرضية المتعددة المرتبطة بمرض باركنسون في الخلايا العصبية mDA البشرية الحساسة للتغيرات المظهرية التي يسببها المركبات الجينيةوالكيميائية 9. توضح هذه المقالة بالتفصيل نسخة محسنة أخرى من هذه المنهجية لإنشاء ملفات تعريف النمط الظاهري من الخلايا العصبية mDA (الشكل 1). يتمتع هذا البروتوكول بالعديد من المزايا مقارنة بنهج التنميط الظاهري الموصوفة سابقا ، مثل استخدام الخلايا العصبية mDA عالية الجودة والتكاثر التقني. لأول مرة ، يتيح هذا البروتوكول التنميط الظاهري في الخلايا العصبية mDA ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية بعد الانقسام بعد الاضطرابات الكيميائية بطريقة قابلة للتطوير بدرجة كبيرة. تتوفر الخلايا العصبية mDA المتمايزة والمحفوظة بالتبريد تجاريا ، مما يقلل بشكل كبير من تباين التمايز من دفعة إلى أخرى. ثانيا، يمكن زيادة تقليل التباين التقني باستخدام تصميم تجريبي محدد جيدا (أي مدة الاستزراع أو تجنب الآبار الحافة)، والمناولة الآلية للسوائل والفحص المجهري الآلي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توضيح الخطوات الأولية لتحليل ملف تعريف النمط الظاهري باستخدام نهج التجميع غير الخاضع للإشراف أو التصنيف الخاضع للإشراف هنا ، مما يشير إلى كيفية تحليل بيانات التنميط الظاهري. سيكون هذا البروتوكول مفيدا للباحثين المهتمين بالتغيرات المظهرية للخلايا العصبية mDA الناتجة عن الاضطرابات الجينية أو الكيميائية ، وتحديدا عندما تكون هناك حاجة إلى إعداد دراسة قابلة للتطوير بدرجة كبيرة ، على سبيل المثال ، أثناء حملات الفحص أو عندما يتم دراسة تأثيرات عدد أقل من المركبات ، على سبيل المثال ، لتحديد الآثار السامة. باختصار ، من المتوقع أن يكون تطبيق التنميط الظاهري للخلايا العصبية البشرية تقنية قيمة لدراسة الأنماط الظاهرية المعقدة المرتبطة بالأمراض وتوصيف التأثيرات الخلوية للأدوية المرشحة.
الشكل 1: تصوير تخطيطي للبروتوكول التجريبي لتوليد ملامح النمط الظاهري القائمة على الصور من الخلايا العصبية mDA المشتقة من iPSC البشرية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Protocol
Representative Results
Discussion
التنميط الظاهري هو تقنية لقياس عدد كبير من الأنماط الظاهرية في الخلايا عن طريق تطبيق تلطيخ الفلورسنت والفحص المجهري وتحليل الصور3. يمكن الحصول على ملامح النمط الظاهري ومقارنتها عبر خطوط الخلايا أو الظروف التجريبية الأخرى لفهم التغيرات المعقدة في البيولوجيا الخلوية التي قد ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا جميع الزملاء في Ksilink على مساعدتهم القيمة ومناقشاتهم التي أدت إلى تصميم البروتوكول المقدم.
Materials
| Anti- chicken – Alexa 647 | Jackson ImmunoRearch | 703-605-155 | Immunofluorescence |
| Anaconda | https://www.anaconda.com/download | ||
| Anti-Map2 | Novus | NB300-213 | Immunofluorescence |
| Anti-mouse – Alexa 488 | Thermo Fisher | A11001 | Immunofluorescence |
| Anti-rabbit – Alexa 555 | Thermo Fisher | A21429 | Immunofluorescence |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase | Merck | T2928 | Immunofluorescence |
| Anti-α-synuclein | Abcam | 138501 | Immunofluorescence |
| Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head | Agilent | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
| Confocal microscope | Yokogawa | CV7000 | The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency. |
| Countess Automated cell counter | Invitrogen | Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber. | |
| DPBS +/+ | Gibco | 14040-133 | Buffer for washing |
| EL406 Washer Dispenser | BioTek (Agilent) | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
| Formaldehyde Solution (PFA 16 %) | Euromedex | EM-15710-S | Fixation before staining |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| iCell Base Medium 1 | Fujifilm | M1010 | Base medium for neurons |
| iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M | Fujifilm | C1087 | Apparently healthy donor |
| iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139 | Fujifilm | C1149 | Donor carrying LRRK2 G2019S mutation |
| iCell Nervous System Supplement | Fujifilm | M1031 | Supplement for base medium |
| iCell Neural Supplement B | Fujifilm | M1029 | Supplement for base medium |
| Jupyter Python Notebook | In-house development | https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling | Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data. |
| Laminin | Biolamina | LN521 | Plate coating |
| PFE-360 | MedChemExpress | HY-120085 | LRRK2 kinase inhibitor |
| PhenoLink | In-house development | https://github.com/Ksilink/PhenoLink | Software for image analysis |
| PhenoPlate 384w, PDL coated | Perkin Elmer | 6057500 | Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope. |
| Storage plates Abgene 120 µL | Thermo Scientific | AB-0781 | Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. |
| Triton | Sigma | T9284 | Permeabilization before lysis |
| Trypan Blue | Sigma | T8154-20ML | Determination of living cells |
| Vprep Pipetting System | Agilent | Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used. |
References
- Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. The cell biology of Parkinson’s disease. The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095 (2021).
- Caicedo, J. C., et al. Data-analysis strategies for image-based cell profiling. Nature Methods. 14 (9), 849-863 (2017).
- Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
- Bray, M. -. A., et al. Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nature Protocols. 11 (9), 1757-1774 (2016).
- Schiff, L., et al. Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts. Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).
- Ziegler, S., Sievers, S., Waldmann, H. Morphological profiling of small molecules. Cell Chemical Biology. 28 (3), 300-319 (2021).
- Cobb, M. M., Ravisankar, A., Skibinski, G., Finkbeiner, S. iPS cells in the study of PD molecular pathogenesis. Cell and Tissue Research. 373 (1), 61-77 (2018).
- Elitt, M. S., Barbar, L., Tesar, P. J. Drug screening for human genetic diseases using iPSC models. Human Molecular Genetics. 27 (R2), 89-98 (2018).
- Vuidel, A., et al. High-content phenotyping of Parkinson’s disease patient stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons using machine learning classification. Stem Cell Reports. 17 (10), 2349-2364 (2022).
- Stirling, D. R., Swain-Bowden, M. J., Lucas, A. M., Carpenter, A. E., Cimini, B. A., Goodman, A. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sofroniew, N., et al. . napari: a multi-dimensional image viewer for Python. , (2022).
- Berthold, M. R., et al. KNIME: The Konstanz Information Miner. Data Analysis, Machine Learning and Applications. , 319-326 (2008).
- Fathi, A., et al. Diverging Parkinson’s Disease Pathology between patient-derived GBAN370S, LRRK2G2019S and engineered SNCAA53T iPSC-derived Dopaminergic Neurons. bioRxiv. , (2023).
- Wang, Y., Huang, H., Rudin, C., Shaposhnik, Y. Understanding How Dimension Reduction Tools Work: An Empirical Approach to Deciphering t-SNE, UMAP, TriMap, and PaCMAP for Data Visualization. Journal of Machine Learning Research. 22 (201), 1-73 (2021).
- Ke, G., et al. LightGBM: A highly efficient gradient boosting decision tree. Advances in Neural Information Processing Systems. 30, (2017).
- Avazzadeh, S., Baena, J. M., Keighron, C., Feller-Sanchez, Y., Quinlan, L. R. Modelling Parkinson’s Disease: iPSCs towards Better Understanding of Human Pathology. Brain Sciences. 11 (3), 373 (2021).
- Sánchez-Danés, A., et al. Disease-specific phenotypes in dopamine neurons from human iPS-based models of genetic and sporadic Parkinson’s disease. EMBO Molecular Medicine. 4 (5), 380-395 (2012).
- Oosterveen, T., et al. Pluripotent stem cell derived dopaminergic subpopulations model the selective neuron degeneration in Parkinson’s disease. Stem Cell Reports. 16 (11), 2718-2735 (2021).
- Hughes, R. E., et al. Multiparametric high-content cell painting identifies copper ionophores as selective modulators of esophageal cancer phenotypes. ACS Chemical Biology. 17 (7), 1876-1889 (2022).
- Akbarzadeh, M., et al. Morphological profiling by means of the Cell Painting assay enables identification of tubulin-targeting compounds. Cell Chemical Biology. 29 (6), 1053-1064 (2022).
- Schiff, L., et al. Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts. Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).
- Way, G. P., et al. Morphology and gene expression profiling provide complementary information for mapping cell state. Cell Systems. 13 (11), 911-923 (2022).
- Feng, Y., Mitchison, T. J., Bender, A., Young, D. W., Tallarico, J. A. Multi-parameter phenotypic profiling: using cellular effects to characterize small-molecule compounds. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (7), 567-578 (2009).
- Antonov, S. A., Novosadova, E. V. Current state-of-the-art and unresolved problems in using human induced pluripotent stem cell-derived dopamine neurons for parkinson’s disease drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3381 (2021).
- Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell Stem Cell. 13 (6), 691-705 (2013).
- Bezard, E., Gross, C. E., Brotchie, J. M. Presymptomatic compensation in Parkinson’s disease is not dopamine-mediated. Trends in Neurosciences. 26 (4), 215-221 (2003).
- Wu, Y., Le, W., Jankovic, J. Preclinical Biomarkers of parkinson disease. Archives of Neurology. 68 (1), 22-30 (2011).
- Verstraelen, P., et al. Systematic quantification of synapses in primary neuronal culture. iScience. 23 (9), 101542 (2020).
- Liu-Yesucevitz, L., et al. ALS-Linked mutations enlarge TDP-43-enriched neuronal RNA granules in the dendritic arbor. The Journal of Neuroscience. 34 (12), 4167-4174 (2014).
