Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

פרופיל פנוטיפי של נוירונים דופמינרגיים שמקורם בתאי גזע אנושיים במוח התיכון

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65570
Automatic Translation
1, 1, 1
1Ksilink

Summary

פרוטוקול זה מתאר את תרבית התאים של נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון האנושי, ולאחר מכן צביעה אימונולוגית ויצירת פרופילים פנוטיפיים עצביים מתמונות מיקרוסקופיות שנרכשו בתוכן גבוה ומאפשרים זיהוי של וריאציות פנוטיפיות עקב מודולציות גנטיות או כימיות.

Abstract

מחלת פרקינסון (PD) קשורה למגוון תהליכים ביולוגיים של התא הגורמים לאובדן נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון (MDA). מודלים תאיים רבים של PD במבחנה חסרים מורכבות ואינם לוקחים בחשבון פנוטיפים מרובים. פרופיל פנוטיפי בתאי עצב mDA שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC) יכול לטפל בחסרונות אלה על ידי מדידה בו זמנית של מגוון פנוטיפים עצביים בסוג תא רלוונטי למחלת פרקינסון במקביל. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להשגה וניתוח של פרופילים פנוטיפיים מנוירוני mDA אנושיים הזמינים באופן מסחרי. פאנל צביעה פלואורסצנטי ספציפי לנוירון משמש להמחשת הפנוטיפים הקשורים לגרעין, α-סינוקלאין, טירוזין הידרוקסילאז (TH) וחלבון הקשור למיקרוטובול 2 (MAP2). פרוטוקול הפרופיל הפנוטיפי המתואר ניתן להרחבה מכיוון שהוא משתמש בלוחות 384 בארות, טיפול אוטומטי בנוזלים ומיקרוסקופ בתפוקה גבוהה. התועלת של הפרוטוקול מודגמת באמצעות נוירונים mDA מתורם בריא ונוירוני mDA הנושאים את מוטציית G2019S המקושרת ל- PD בגן קינאז חוזר עשיר בלאוצין 2 (LRRK2). שני קווי התאים טופלו במעכב קינאז LRRK2 PFE-360 ונמדדו שינויים פנוטיפיים. בנוסף, אנו מדגימים כיצד ניתן לנתח פרופילים פנוטיפיים רב-ממדיים באמצעות אשכולות או שיטות סיווג מונחות למידת מכונה. הפרוטוקול המתואר יעניין במיוחד חוקרים העובדים על מודלים של מחלות עצביות או חוקרים השפעות כימיות של תרכובות בתאי עצב אנושיים.

Introduction

מגוון תהליכים ביולוגיים של התא מופרעים במחלת פרקינסון (PD). לדוגמה, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, עקה חמצונית, פגמים בפירוק חלבונים, הפרעה בסחר שלפוחית השתן ותפקוד אנדוליזוזומלי נקשרו לאובדן נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון (mDA), נצפו בדרך כלל במחלת פרקינסון1. לכן, נראה כי פרקינסון מערבת מנגנוני מחלה מרובים שיכולים לתקשר זה עם זה ולהחמיר זה את זה. דרך שימושית אחת לחקור את יחסי הגומלין המכניסטיים האלה היא יצירת טביעת אצבע פנוטיפית מקיפה או פרופיל של נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון (mDA).

פרופיל פנוטיפי הוא גישה הכוללת יצירת פרופיל של מדגם המבוסס על אוסף של מאפיינים מדידים, ושנית, היא כוללת ביצוע תחזיות לגבי מדגם המבוסס על פרופיל זה 2,3. מטרת יצירת הפרופילים היא ללכוד מגוון רחב של תכונות, שחלקן אולי לא היו קשורות בעבר למחלה או לטיפול3. כתוצאה מכך, פרופיל יכול לחשוף תהליכים ביולוגיים בלתי צפויים. פרופיל פנוטיפי מסתמך בדרך כלל על תאים מוכתמים פלואורסצנטית, ובדיקות סטנדרטיות, כגון צביעת תאים, פותחו ליצירת פרופילים פנוטיפיים4. לאחרונה, פרופיל פנוטיפי יושם, למשל, עבור אפיון של מולקולות קטנות או חיזוי מדויק של תת-סוגים של PD אך ורק על סמך פיברובלסטיםשמקורם במטופל 5,6. למרות התקדמות זו, פרופיל פנוטיפי כמעט ולא יושם על תאים ממוינים פוסט-מיטוטיים, כגון תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC) שמקורם בתאי עצב mDA המבטאים מוטציות הקשורות לפרקינסון כגון LRRK2 G2019S. אתגרים משמעותיים של מודלים שמקורם ב-iPSC כוללים את נוכחותם של מאפיינים פתולוגיים עדינים או משתנים על פני קבוצות התמיינות או גנוטיפים, והעובדה שפנוטיפים מבודדים של פרקינסון אינם לוכדים את מלוא המורכבות של המחלה. יתר על כן, בעוד מודלים עצביים iPSC רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, הם משמשים לעתים רחוקות בתהליכי גילוי תרופות PD בשל חששות לגבי מורכבות טכנית 7,8.

בעבר פיתחנו מתודולוגיה חזקה למדידת פנוטיפים פתופיזיולוגיים מרובים הקשורים לפרקינסון בנוירוני mDA אנושיים הרגישים הן לשינויים פנוטיפיים גנטיים והן כימיים הנגרמים על ידי תרכובת9. מאמר זה מתאר בפירוט גרסה ממוטבת נוספת של המתודולוגיה הזו ליצירת פרופילים פנוטיפיים מתאי עצב mDA (איור 1). לפרוטוקול זה יש מספר יתרונות על פני גישות הפרופיל הפנוטיפיות שתוארו קודם לכן, כגון שימוש בנוירוני mDA באיכות גבוהה ויכולת שחזור טכנית. לראשונה, פרוטוקול זה מאפשר יצירת פרופיל פנוטיפי בנוירוני mDA פוסט-מיטוטיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית לאחר הפרעות כימיות באופן מדרגי ביותר. נוירוני mDA ממוינים לחלוטין ושמורים בהקפאה זמינים מסחרית, ומפחיתים באופן משמעותי את שונות ההתמיינות בין אצווה לאצווה. שנית, ניתן לצמצם עוד יותר את השונות הטכנית על ידי שימוש בתכנון ניסויי מוגדר היטב (כלומר, משך תרבית או הימנעות מבארות קצה), טיפול אוטומטי בנוזלים ומיקרוסקופ אוטומטי. בנוסף, השלבים הראשונים של ניתוח פרופיל פנוטיפי באמצעות אשכולות לא מפוקחים או גישות סיווג מפוקחות מתוארים כאן, המציינים כיצד ניתן לנתח נתוני פרופיל פנוטיפי. פרוטוקול זה ישמש חוקרים המעוניינים בשינויים פנוטיפיים של נוירוני mDA הנגרמים על ידי הפרעות גנטיות או כימיות, במיוחד כאשר נדרש מערך מחקר מדרגי מאוד, למשל, במהלך מסעות סינון או כאשר יש לחקור את ההשפעות של מספר קטן יותר של תרכובות, למשל, כדי לקבוע השפעות רעילות. לסיכום, צפוי כי היישום של פרופיל פנוטיפי של נוירונים אנושיים הוא טכניקה רבת ערך לחקר פנוטיפים מורכבים הקשורים למחלות ולאפיין את ההשפעות התאיות של מועמדים לתרופות.

Figure 1
איור 1: תיאור סכמטי של פרוטוקול הניסוי ליצירת פרופילים פנוטיפיים מבוססי תמונה מתאי עצב mDA אנושיים שמקורם בתאי עצב שמקורם בתאי עצב iPSC. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מדיום וצלחות לזריעת נוירונים (יום 1)

  1. כדי להכין את הצלחות לזריעת תאי עצב ביום הראשון, חממו את הלמינין לטמפרטורת החדר (RT) ממש לפני השימוש. הכינו את תמיסת הלמינין על ידי דילול תמיסת ציר למינין (0.1 מ"ג/מ"ל) 1/10 ב-PBS + / + קר (עם Ca 2+ ו-Mg2+).
    הערה: כל הריאגנטים מפורטים בטבלת החומרים. הרכבי התמיסות והמאגרים מתוארים בטבלאות 1-4.
  2. לאחר מכן, הוסף 25 μL של תמיסת Laminin לכל באר של צלחת Poly-D-Lysine (PDL) מצופה מראש 384-well, ולדגור לילה ב 4 ° C. ניתן לאחסן את הצלחות המצופות ב -4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן למשך עד שבוע. אטמו את הצלחות באמצעות סרט פלסטיק.
  3. הכינו מדיית תחזוקה מלאה ואחסנו בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודש (טבלה 1).

2. הפשרת נוירונים (יום 0)

  1. כדי להפשיר את תאי העצב ביום 0, חממו מראש אמבט מים ל -37 מעלות צלזיוס, ואזנו את מדיית התחזוקה המלאה ל- RT, המוגנת מפני אור.
  2. הוציאו את הבקבוקון המכיל את תאי העצב הקפואים שהושגו באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) ממיכל החנקן הנוזלי והניחו אותו על קרח יבש. לאחר מכן מניחים את הבקבוקון באמבט המים למשך 2 דקות. לאחר הפשרת הנוזל לחלוטין, יש לחטא את הבקבוקון באתנול 70%.
  3. שאפו את תאי העצב המופשרים עם פיפטה P1000 (בסביבות 370 מיקרוליטר) והעבירו אותם בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ללא פיפטינג מעלה ומטה. לאחר מכן, שטפו את הבקבוקון עם 630 μL של אמצעי תחזוקה מלאה, ושחררו טיפה אחר טיפה (זווית של 45°) בצינור 50 מ"ל. יש להרגיז לאט תוך כדי ניפוק.
    הערה: קריטי לפזר את המדיום לאט, טיפה אחר טיפה, כדי למנוע קרע אוסמוטי של התאים. זווית של 45° ותסיסת אור ממזערות לחץ אוסמוטי מקומי גבוה במהלך פיפטינג.
  4. באופן דומה, הוסף 1 מ"ל של אמצעי תחזוקה מלאה בצינור הצנטריפוגה 50 מ"ל עם פיפטה P1000. לאחר מכן, להוסיף לאט 2 מ"ל של אמצעי תחזוקה מלאה. יש להרגיז בזהירות בזמן הניפוק.
  5. ספור את התאים. הכינו מיקרו-צינור עם 10 μL Trypan Blue ותרחיף תאים 10 μL והוסיפו לשקופית תא ספירה (10 μL). בצע ספירה באמצעות מונה תאים אוטומטי (ראה רשימת חומרים) או באופן ידני.
  6. לאחר הספירה, צנטריפוגו את צינור 50 מ"ל המכיל את הנוירונים ב 400 x g במשך 5 דקות ב RT, ולהסיר את supernatant. בזהירות resuspend את הגלולה באמצעות פיפטה P1000 ו 1 מ"ל של אמצעי תחזוקה מלאה. לאחר מכן הוסף את הנפח הדרוש כדי להגיע לריכוז הרצוי (300,000 תאים / מ"ל, ראה גם השלב הבא).

3. זריעת נוירונים על צלחות מוכנות (יום 0)

  1. כדי לזרוע תאי עצב על הצלחות המוכנות ביום 0, הוציאו את הצלחות המצופות מהמקרר, הניחו אותן מתחת למכסה המנוע של תרבית התאים ותנו להן להתאזן ל-RT למשך כ-30 דקות.
  2. רגע לפני הזריעה, שאפו לתמיסת ציפוי 15 μL עם מטפל נוזלים אוטומטי או פיפטה 16 ערוצים. השאירו כ-10 מיקרוליטר לבאר כדי למנוע נזק לציפוי.
  3. לאחר מכן, שחררו 50 מיקרוליטר של תמיסת התא המכילה 300,000 תאים/מ"ל (שהוכנו בשלב 2.6) לכל באר עם פיפטה בת 16 ערוצים, והתוצאה היא 15,000 נוירונים שנזרעו לכל באר ונפח סופי לכל באר של 60 מיקרוליטר.
  4. בלוח של 384 בארות, הימנע משימוש בעמודות 1, 2, 23, 24 ובשורות A, B, O ו- P כדי למזער אפקטי קצה אפשריים שעלולים להשפיע על הפרופילים הפנוטיפיים. מלא את הבארות הריקות שאינן בשימוש עם 80 μL של PBS. לדגור על הצלחות ב 37 ° C ו 5% CO2.

4. שינוי בינוני או טיפול מורכב (יום 3)

  1. בהתאם למספר הבארות, יש לחמם מראש נפח מתאים של אמצעי תחזוקה מלא ב-RT. יש להגן מפני אור.
  2. אם נדרש שינוי בינוני, המשך לשלב 4.4. אם רוצים טיפול בתרכובת, יש לוודא את ריכוז מלאי התרכובת ואת הממס המשומש (מים, DMSO, מתנול וכו').
  3. הכינו תמיסת תרכובת מרוכזת פי 1.5 לכל הריכוזים הרצויים לבדיקה. הכינו את הדילולים המורכבים באמצעות Complete Maintenance Medium.
    הערה: כבקרה ניטרלית, השתמש בממס המתאים באותו ריכוז כמו התרכובת הנבדקת. אם משתמשים בתרכובות מרובות או לא ידועות בריכוזים שונים, מומלץ לבצע ניסוי מנה-תגובה נפרד כדי למדוד את השפעות הממס על הפרופיל הפנוטיפי.
  4. אם נעשה שימוש במערכת צנרת אוטומטית, הוסף 60 μL של תמיסת התרכובת 1.5x לצלחת אחסון של 384 בארות. לחלופין, השתמשו בפיפט בן 16 ערוצים. אם נדרש שינוי בינוני, הוסף 60 μL של אמצעי תחזוקה מלאה במקום.
  5. באמצעות מערכת הצנרת האוטומטית, שאפו והשליכו 40 מיקרוליטר של מדיום לכל באר מהצלחת המכילה נוירונים כדי לשמור על 20 μL/באר. לאחר מכן הוסף 40 μL / באר של תמיסת תרכובת 1.5x מלוח האחסון של 384 בארות לכל באר כדי להשיג את הריכוז הסופי הרצוי.
    הערה: חשוב לא לבצע שינויי מדיום מלאים אלא להשאיר תמיד שאריות תווך בבאר כדי למנוע נזק לשטיח העצבי או לציפוי.
  6. במקרה התרבות העצבית מבוצעת במשך יותר מ 6 ימים המתוארים בפרוטוקול זה, לשנות את המדיום כל 2-3 ימים.

5. קיבוע נוירונים והכתמה (ימים 6 עד 7)

  1. כדי לתקן ולהכתים את תאי העצב בימים 6 ו-7, השתמשו במטפל אוטומטי בנוזלים לכל שלבי הניפוק והכביסה. לחלופין, השתמשו בפיפט בן 16 ערוצים.
  2. הכינו פתרון 10% Triton X-100 על ידי דילול Triton X-100 ב-1x PBS. מערבולת עד שהפתרון הומוגני. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
  3. כדי לתקן את הנוירונים, יש לפזר 20 μL/well של 16% PFA והתוצאה היא ריכוז סופי של 4%. דגרו על הצלחת במשך 30 דקות ב-RT, ושטפו אותה שלוש פעמים עם 1x PBS. השאירו 20 מיקרוליטר/באר של PBS לאחר השטיפה האחרונה.
    אזהרה: PFA מוכר כחומר מסוכן הידוע כגורם לרעילות דרך הפה, העור והנשימה. הוא גם מהווה איום על העיניים ועלול להוביל למוטציות גנטיות ולסרטן. טיפול נכון ב-PFA מחייב שימוש בציוד מגן אישי מתאים, כגון הגנה על העיניים והפנים, בנוסף להבטחת אוורור נאות. חשוב למנוע שחרור של PFA לסביבה.
  4. לחדירה וחסימה, הכינו פתרון חסימה פי 2 (טבלה 2).
  5. הוסף 20 μL / באר של 2x פתרון חסימה (ריכוז סופי 1x), לדגור במשך 1 שעה ב RT, ולשטוף פעם אחת עם PBS. יש לשמור 20 μL/באר של PBS לאחר הכביסה.
  6. לצביעת נוגדנים ראשוניים (ראו טבלת חומרים), הכינו חיץ צביעה ראשוני פי 2 (טבלה 3).
  7. הוסף 20 μL / באר של 2x חיץ צביעה ראשוני (1x ריכוז סופי) ודגר לילה ב 4 ° C. למחרת בבוקר ביום 7, שטפו שלוש פעמים עם PBS. יש להשאיר 20 μL/באר של PBS לאחר הכביסה.
  8. לצביעת נוגדנים שניונית (ראו טבלת חומרים), הכינו חיץ צביעה משני פי 2 (טבלה 4).
  9. יש להוסיף 20 μL/well של חיץ צביעה משני פי 2 (ריכוז סופי של 1x), לדגור במשך שעתיים ב-RT הרחק מאור, ולשטוף שלוש פעמים עם PBS. השאירו 100 μL PBS / היטב לאחר הכביסה האחרונה.
    1. הוסיפו איטום אלומיניום על הצלחת כדי למזער אידוי. לחלופין, מכסים את הצלחת בסרט פלסטיק ובנייר אלומיניום. המשך לרכישת תמונה, או אחסן את הצלחת ב- 4 ° C.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן למשך עד שבוע. אם נצפתה פלואורסצנטיות רקע, שקול להגדיל את זמן החסימה. אם הכתמים אינם מספיקים, נסה להגדיל את ריכוז הנוגדנים הראשוני או את זמן הדגירה.

6. הדמיה של נוירונים מוכתמים פלואורסצנטית (יום 7)

  1. רכשו תמונות של תאי העצב המצופים, המתורבתים והמוכתמים ביום השביעי. באופן אידיאלי, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי אוטומטי (ראה טבלת חומרים). לחלופין, רכשו תמונות באופן ידני.
  2. רכשו את ערוצי Hoechst, TH, α-synuclein ו-MAP2 באמצעות לייזרים של 405 ננומטר, 488 ננומטר, 561 ננומטר ו-647 ננומטר, בהתאמה (איור 2).
    הערה: כדי להפיק כמות מספקת של נתונים מפורטים עבור פרופיל פנוטיפי, השתמש במטרה של 40x ורכוש 16 שדות/באר באמצעות ערימות Z המורכבות מ-3 פרוסות Z המופרדות ב-2 מיקרומטר. במקרה שיש נזקים הקשורים לצנרת בשטיח העצבי, נסו להימנע מהדמיה של אזורים אלה.
  3. בהתאם למיקרוסקופ ולמצלמה, התאימו את זמני החשיפה ועוצמות העירור עבור כל אחד מארבעת ערוצי הפלואורסצנט בנפרד כדי לקבל טווח דינמי אופטימלי של עוצמות הפלואורסצנט.
    הערה: תוכנת הדמיה מספקת לעתים קרובות היסטוגרמה כדי לקבוע את זמן החשיפה האידיאלי. אם ההיסטוגרמה מוסטת יותר מדי שמאלה בטווח האות הנמוך, זמן החשיפה קצר מדי או שעוצמת העירור נמוכה מדי. אם יש צוק חד ברמת האות המקסימלית מימין, ערך האות רווי. במקרה זה, להפחית את עוצמת העירור או לקצר את זמן החשיפה.
  4. אחסן תמונות בפורמט פתוח וללא אובדן נתונים, כגון .tif.

7. עיבוד תמונה (יום 8)

  1. פילוח תמונות וחילוץ תכונות פנוטיפיות נדרשים ליצירת פרופילים פנוטיפיים כמותיים. השתמש בתוכנת PhenoLink לפילוח תמונות וחילוץ תכונות (רשימת חומרים). הוראות להתקנת PhenoLink ניתן למצוא במאגר GitHub (https://github.com/Ksilink/PhenoLink).
    הערה: פילוח תמונה משמש לזיהוי ולהפרדה של אובייקטים או אזורים שונים בתמונה, בעוד חילוץ תכונות פנוטיפי משמש לניתוח ולחילוץ מידע רלוונטי מאזורים אלה. מספר פתרונות תוכנה חלופיים, כגון CellProfiler 10, ImageJ/FIJI11, Napari 12 או Knime Analytics Platform13 זמינים לחילוץ מידע כמותי מתמונות פלואורסצנטיות רב-ערוציות.
  2. בצעו פילוח תמונה בתמונות גולמיות מתוקנות תאורה. קבעו אמפירית את ספי עוצמת הערוץ הפלואורסצנטי המתאימים לכל לוחית, כך שאות הרקע יהיה מינימלי, והאות המקוטע הרצוי יתאים לאות בתמונה הגולמית. לוחות שעובדו ונצבעו באותו יום דורשים בדרך כלל ספי עוצמת ערוץ דומים לצורך סגמנטציה.
  3. הגדר את גודל הגרעין ועוצמתו כדי להפריד בין תאים חיים לתאים מתים. בעת שימוש בתמונות 40x, שמור על כל פרמטרי ברירת המחדל האחרים והפעל את התוכנה. מאה עשרים ושש תכונות תמונה כמותיות יחושבו לכל באר (טבלה משלימה 1).
  4. השתמש בנתונים הכמותיים הטבלאיים המתקבלים כדי לבנות פרופילים פנוטיפיים ולהשוות פרופילים פנוטיפיים מקווי תאים שונים או מתנאי טיפול שונים. כל שורה מתאימה למצב ביולוגי (טוב) וכל עמודה מתאימה לתכונה פנוטיפית קבועה.
    הערה: אנו מספקים קובץ פלט לדוגמה יחד עם צינור ניתוח הנתונים כדי להמחיש את השימוש בו (ראה טבלת חומרים). נוסף על כך, איור 3 מראה את ההרכב של פרופיל פנוטיפי.

8. יצירת פרופיל פנוטיפי והדמיה (יום 8)

  1. אם Python ו-Jupyter אינם מותקנים במחשב שלך, התקן את Anaconda Distribution ופתח את תוכנת Jupyter. הורד את מחברת Jupyter שסופקה ואת כל הקבצים האחרים שסופקו ושמור אותם באותה ספרייה (ראה טבלת חומרים). פתח את קובץ המחברת Jupyter באמצעות תוכנת Jupyter.
    הערה: אנקונדה היא פלטפורמת קוד פתוח חופשית לשפות תכנות כגון Python. פלטפורמה זו מגיעה עם מתורגמן Python Jupyter אשר יכול לבצע את מחברת Jupyter שסופקה כדי ליצור ולנתח פרופילים פנוטיפיים (https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling).
  2. הפעל את מחברת Jupyter תא אחר תא באמצעות תוכנת Jupyter. הנתונים לדוגמה שסופקו .fth ודרישות .txt קבצים צריכים להיות ממוקמים באותה ספריה כמו מחברת Jupyter. כל תא מחברת Jupyter מבואר כדי להסביר את הפונקציונליות שלו.
    הערה: חיוני להשתמש במחברת Jupyter בסדר הנכון החל מטעינת נתונים ושינוי קנה מידה ולהמשיך תא אחר תא עד הסוף. כל הנתונים ופלט הגרפיקה יאוחסנו בתיקייה חדשה שנוצרה בספריית המקור של מחברת Jupyter. איור 4 מתאר את זרימת העבודה ואת פלט זרימת העבודה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרופיל פנוטיפי בנוירונים mDA הוא דרך יעילה לכמת היבטים רבים של ביולוגיה תאית ואת השינויים שלהם במהלך אפנון הניסוי. כדי להדגים מתודולוגיה זו, מחקר זה עשה שימוש ב- LRRK2 G2019S שמור בהקפאה ובנוירונים mDA בריאים מתורם. נוירונים אלה נבדלו במשך כ-37 ימים, הם סמנים עצביים פוסט-מיטוטיים ומבטאים (TUBB3 ו-MAP2) וסמנים של נוירונים דופמינרגיים, כולל טירוזין הידרוקסילאז (TH) בשילוב עם FOXA2, בעוד שסמן גליה Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) נעדר14. בעקבות הפרוטוקול המתואר, שני קווי התאים גודלו בתרבית במשך 6 ימים וטופלו ב-0.1 מיקרומטר PFE-360, מעכב קינאז LRRK2. תאי העצב הוכתמו באמצעות הכתם הגרעיני Hoechst, ונוגדנים נגד α-synuclein, TH ו-MAP2 (איור 2).

לאחר מכן, תמונות היו מקוטעים, תכונות פנוטיפיות חולצו. קבענו 126 מאפיינים כמותיים שניתן לצבור לפרופילים פנוטיפיים מבוססים היטב (איור 3A,B). ניתן לגשת לכל תכונה ולערכה בהתאם לתנאי הניסוי. חלק מהתכונות הראו שינויים בטיפול המורכב. לדוגמה, עוצמת הפלואורסצנטיות של α-סינוקלאין בתאים חיוביים ל-TH ירדה לאחר טיפול ב-PFE-360 (איור 3C, פאנל שמאלי). תכונות אחרות הציגו רק הבדלים בין שורות התאים שנבדקו, אך לא בטיפול מורכב. זה היה, למשל, המקרה של אורך רשת תאי העצב MAP2 או היחס בין תאי עצב חיוביים ל-TH (איור 3C, פאנל אמצעי וימני). חיוני לשקול את הפרופיל הפנוטיפי המלא כדי לנתח את השינויים הפנוטיפיים בקווי תאים שונים או טיפולים מורכבים בצורה פחות סלקטיבית ומקיפה.

במהלך שלב ניתוח התמונה, כל 126 התכונות מחושבות תמיד. כמו כן, במהלך ניתוח נתונים, כל התכונות נחשבות, אך אלגוריתם למידת המכונה מקצה משקלים לתכונות בודדות כדי להפריד בין המחלקות הביולוגיות. זרימת העבודה של ניתוח הנתונים מתחילה בטעינת נתונים ובשינוי קנה מידה של תכונות (איור 4A). קנה מידה חשוב ללמידת מכונה מכיוון שהוא עוזר לנרמל את הנתונים ומבטיח שכל תכונה תהיה בקנה מידה דומה. זה יכול לעזור לשפר את הביצועים של אלגוריתמים של למידת מכונה על ידי הפיכתם לפחות רגישים לקנה המידה של תכונות הקלט. בנוסף, קנה מידה יכול לעזור לשפר את יכולת הפירוש של מודלים של למידת מכונה בכך שהוא מקל על השוואת החשיבות היחסית של תכונות שונות. בשלב הבא, ניתוח אשכולות מבוצע (איור 4B). קיבוץ באשכולות יכול להיות שימושי לחקר המבנה של ערכות נתונים רב-ממדיות ולזיהוי דפוסים בנתונים שייתכן שלא יהיו גלויים לעין באופן מיידי מהתבוננות בתכונות בודדות. אשכולות היררכיים המבוססים על מרחק קוסינוס בין פרופילים פנוטיפיים מבוססים היטב הראו הבדלים חזקים בין קווי תאים, אך פחות לטיפול תרופתי. נתונים מבארות מטופלות PFE-360 מקובצות בתוך הבקרה שטופלה ב-DMSO, מה שמצביע על כך שאין הבדלים חזקים בשימוש במדד השוואה זה. לצד קיבוץ באשכולות, גישות להפחתת ממדים הן גם כלים שימושיים להמחשת קווי הדמיון וההבדלים של נתוני פרופיל פנוטיפיים רב-ממדיים. כאן עשינו שימוש בקירוב סעפת מבוקרת זוגית (PaCMAP)15 (איור 4C). בדומה לגישה הקודמת המבוססת על מרחק קוסינוס (Cosine distance), PaCMAP הראתה בעיקר הבדלים בין שני קווי התאים ובמידה פחותה יותר, בין בארות מטופלות PFE-360 או DMSO control. גם אשכולות מרחק קוסינוס וגם PaCMAP הן שיטות לא מפוקחות ולא סביר שיזהו הבדלים קטנים שקיימים רק בתכונות פנוטיפיות נבחרות, למשל, מכיוון שתרכובת משנה רק כמה פנוטיפים (כלומר, תכונות הקשורות לנוריט בלבד). כדי להתמודד עם מגבלה זו של ניתוח פרופיל פנוטיפי, ביצענו סיווג מונחה למידת מכונה. באופן ספציפי, השתמשנו במכשיר להגברת שיפוע האור (LightGBM) (איור 4D). LightGBM הוא אלגוריתם למידת מכונה מפוקח המשתמש באלגוריתמים של עץ החלטות כדי ליצור מודל שיכול לשמש לדירוג או סיווג16. LightGBM תוכנן להיות מהיר ויעיל יותר מאלגוריתמים מסורתיים מבוססי עצים כגון אלגוריתם יער אקראי. האלגוריתם אומן עם נתוני פרופיל פנוטיפיים מלוח אחד ובדק את המודל המאומן על נתונים מלוח עצמאי שני. מודל LightGBM היה בעל דיוק כולל של 85% וחזה נכונה את קטגוריית הניסוי (קו תאים או תרכובת) של רוב הבארות. הדיוק לחיזוי קו התא היה גבוה יותר מאשר לחיזוי תרכובות, אך גם 60% מהבארות שטופלו בתרכובת נחזו נכון, וזה עדיף על שיטות קלאסיות ללא פיקוח. LightGBM מאפשר גישה לחשיבות התכונות הפנוטיפיות בהתאמה לסיווג ארבע המחלקות (איור 4D). תכונות פנוטיפיות חשובות המייחדות את קווי התאים וטיפולים תרופתיים קשורות, למשל, לשטח הפנים של התא או לעוצמות התא של צביעות MAP2 ו- TH. פני השטח של הציטופלסמה החיובית הכפולה TH ו-α-synuclein היו התכונה החשובה ביותר שהבדילה בין קווי תאים וטיפולים מורכבים, ואחריה היחס בין תאים מתים. אנו מספקים מחברת יופיטר המבצעת התוויית נתונים ואת כל שיטות הניתוח הבלתי מפוקחות והמפוקחות המתוארות כאן (ראה טבלת חומרים). התוצאות שהתקבלו ממחישות את הפוטנציאל של פרופיל פנוטיפי להבחנה בין קווי תאים והשפעות טיפול מורכבות בנוירוני mDA אנושיים.

Figure 2
איור 2: צביעה חיסונית של תאי עצב mDA שמקורם בתאי עצב iPSC אנושיים. מוצגות תמונות מייצגות של כל ערוצי הפלואורסצנט שנרכשו. תורם בריא או נוירוני mDA נושאי מוטציה LRRK2 G2019S טופלו ב- DMSO או ב- 0.1 מיקרומטר של מעכב LRRK2 קינאז PFE-360. הטיפול בוצע ביום 3 והתאים נקבעו ביום 6 כמתואר בפרוטוקול. פסי קנה מידה: 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: יצירת פרופיל פנוטיפי ממאפיינים פנוטיפיים בודדים. (A) מוצגות תכונות פנוטיפיות נבחרות שניתן לחלץ מתעלות פלואורסצנטיות בודדות. (B) ניתן לצבור תכונות פנוטיפיות לפרופיל פנוטיפי. פרופילים פנוטיפיים מרובים יכולים להיווצר על פני תנאי ניסוי שונים הקיימים על לוח 384 בארות. (C) דוגמאות לתכונות פנוטיפיות וערכיהן המתאימים לכל תנאי ניסוי. כל נקודת נתונים מתאימה למדידה מבאר אחת. מבחן t השונות הלא שוויונית של וולש שימש לבדיקת מובהקות. מובהקות סטטיסטית מוצגת כ- * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001, **** = p < 0.0001, ולא מובהקת (ns = p > 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: פרופילים פנוטיפיים של נוירוני mDA מכילים מידע כמותי וניתן להשתמש בהם כדי לסווג פנוטיפים . (A) סקירה סכמטית של זרימת העבודה של ניתוח הנתונים. (B) פרופילים פנוטיפיים מצטברים של נוירוני mDA שטופלו בבקרה ובתרופות. (C) Pairwise Controlled Manifold Approximation (PaCMAP) הפחתת ממד ללא פיקוח של נתוני פרופיל פנוטיפי. (D) מכשיר להגברת שיפוע האור (LightGBM) פיקוח על סיווג נתוני פרופיל פנוטיפי. אלגוריתם הסיווג אומן על נתוני פרופיל פנוטיפי מלוח אחד ויושם לחיזוי מחלקות ניסוי בלוח שני. פאנל שמאלי: מטריצת הבלבול מציגה את הקשר בין ארבע מחלקות הנתונים האמיתיות לבין ארבע המחלקות החזויות על ידי המודל. בסך הכל, המודל מנבא את מחלקת הנתונים בצורה נכונה ב -85% מהמקרים. פאנל ימני: 10 התכונות הפנוטיפיות החשובות ביותר עבור מסווג LightGBM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ריאגנטים עבור 100 מ"ל
iCell בסיס בינוני 1 100 מ"ל
תוסף עצבי iCell B 2 מ"ל
תוסף מערכת העצבים iCell 1 מ"ל

טבלה 1: הרכב מדיית תחזוקה מלאה.

מגיב פתרון 2x ריכוז סופי עבור 100 מ"ל
PBS 1x 1 1 78 מ"ל
טריטון 10% 0.20% 0.10% 2 מ"ל
פתרון מניות FBS 20% 10% 20 מ"ל

טבלה 2: הרכב פתרון חסימה פי 2.

מגיב ריכוז פי 2 ריכוז סופי עבור 100 מ"ל
PBS 1x 1 1 87.36 מ"ל
טריטון 10% 0.20% 0.10% 2 מ"ל
פתרון מניות FBS 10% 5% 10 מ"ל
אנטי-TH 1/500 1/1000 0.2 מ"ל
אנטי-α-סינוקלאין 1/250 1/500 0.4 מ"ל
אנטי-MAP2 1/2500 1/5000 0.04 מ"ל

טבלה 3: הרכב חיץ צביעה ראשוני.

מגיב ריכוז פי 2 ריכוז סופי עבור 100 מ"ל
PBS 1x 1 1 86.7 מ"ל
טריטון 10% 0.20% 0.10% 2 מ"ל
פתרון מניות FBS 10% 5% 10 מ"ל
A488 נגד עכבר 1/500 1/1000 0.2 מ"ל
נגד ארנב A555 1/500 1/1000 0.2 מ"ל
נגד עוף A647 1/125 1/250 0.8 מ"ל
הוכסט 1/1000 1/2000 0.1 מ"ל

טבלה 4: הרכב חיץ צביעה משני פי 2.

טבלה משלימה 1: סקירה כללית של כל התכונות הפנוטיפיות שחולצו. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרופיל פנוטיפי הוא טכניקה למדידת מספר רב של פנוטיפים בתאים על ידי החלת כתמים פלואורסצנטיים, מיקרוסקופיה וניתוח תמונה3. ניתן לקבל פרופילים פנוטיפיים ולהשוות אותם בין קווי תאים או תנאי ניסוי אחרים כדי להבין שינויים מורכבים בביולוגיה התאית שעשויים להיעלם מעיניהם בעת שימוש בקריאה יחידה. כאן אנו מתארים את היישום של פרופיל פנוטיפי על נוירוני mDA אנושיים שמקורם ב- iPSC, סוג תא המשמש לעתים קרובות למדל ביולוגיה תאית של PD17,18,19. פרופיל פנוטיפי בנוירונים mDA יש מספר יתרונות על פני גישות פרופיל בשימוש בעבר המשתמשות כתמים פלואורסצנטיים גנריים4, סוגי תאים שאינם עצביים 5,6 או שאינם ניתנים להרחבה 7,8. השיטה המוצגת כאן מאפשרת יצירת פרופיל פנוטיפי בנוירוני mDA פוסט-מיטוטיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. שנית, השימוש בנוירוני mDA שמקורם ב-iPSC מפחית באופן משמעותי את השתנות התמיינות מאצווה לאצווה. שלישית, על ידי שימוש בתכנון ניסויי מוגדר היטב, טיפול אוטומטי בנוזלים ומיקרוסקופ אוטומטי, השונות הטכנית יכולה להיות מופחתת עוד יותר והופכת את הפרוטוקול למדרגי מאוד ופותחת את האפשרות להשתמש בנוירוני mDA לקמפיינים של סינון פנוטיפי. לבסוף, סיווג מפוקח נותן למשתמשים את האפשרות לקבץ ולהבין את התכונות העיקריות של פרופילים פנוטיפיים ולכן עשוי לעזור לחשוף ביולוגיה חדשה.

פרופיל פנוטיפי מאפשר לחקור תכונות בודדות כדי לפתח השערות מעקב המובילות למחקרי המשך מכניסטיים. לדוגמה, הראינו שתאי עצב mDA מסוג LRRK2 G2019S שונים מנוירוני mDA של קבוצת ביקורת בהתבסס על תכולת ה-α-סינוקלאין שלהם, אורך הנוירוט MAP2 והיחס בין תאים חיוביים ל-TH (איור 3C). טיפול מורכב במעכב LRRK2 קינאז PFE-360, לעומת זאת, משנה רק את תכולת α-סינוקלאין ואין לו השפעה על אורך הנוירוט MAP2 או על היחס בין תאים חיוביים TH. תרכובת כימית רצויה אמורה להציל אנסמבל של פנוטיפים. פרופיל פנוטיפי מכיל את המידע הדרוש וניתן לחקור אותו באמצעות טכניקות אשכולות או הפחתת ממדיות, שיכולות לסייע בהמחשת אינטראקציות תכונות מורכבות בעלילות דו-ממדיות. אשכולות מבוססי מרחק קוסינוס מאפשרים הפרדה מדויקת של שני קווי התאים (איור 4B). הפחתת ממדים באמצעות PaCMAP ממחישה עוד יותר כיצד שני קווי התאים יוצרים אשכולות נפרדים, וכי טיפול PFE-360 מוביל לפנוטיפים כלליים מובחנים, אך עדיין דומים, ככל הנראה בשל ההשפעה על תכונות נמדדות מעטות בלבד כגון תוכן α-סינוקלאין (איור 4C). לעומת זאת, למידת מכונה מפוקחת יכולה לעזור לחזות פרופילים בעלי עניין בהתבסס על התכונות שלהם. מודל LightGBM שאומן על הנתונים ניבא במדויק את התורם הבריא ואת נוירוני mDA בעלי מוטציית LRRK2 בנתוני הבדיקה. הזיהוי של תאי עצב שטופלו ב-PFE-360 היה פחות מדויק, ככל הנראה משום שההשפעות של תרכובות כימיות על פנוטיפים חלשות יותר מהשפעות גנטיות (איור 4C). פני השטח של הציטופלסמה החיובית הכפולה TH ו-α-synuclein היו התכונה החשובה ביותר שהבדילה בין קווי תאים וטיפולים מורכבים, ואחריה היחס בין תאים מתים. מספר תכונות מובילות אחרות היו קשורות לשטח הפנים של התא. לכן, נראה שגודל התא הוא מאפיין מבדיל בין בקרה בריאה לבין נוירוני mDA עם מוטציה ב-LRRK2 (איור 4D). גישה זו מדגימה אפוא כיצד למידת מכונה יכולה לזהות את התכונות הפנוטיפיות המגדירות ביותר במערך נתונים מורכב, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהן כדי לפתח השערות חדשות ולבחון השערות אלה במבדקים משניים.

CellPainting הפכה לגישה פופולרית ליצירת פרופילים פנוטיפיים ומשתמשת בסט סטנדרטי של בדיקות פלואורסצנטיות ובפרוטוקול מוגדר 3,4,20,21,22,23. כאן הוחלט להשתמש בלוח צביעה ספציפי יותר לנוירון mDA המורכב מכתם גרעיני Hoechst ונוגדנים נגד α-synuclein, TH ו-MAP2. כתמים פלואורסצנטיים אחרים באמצעות נוגדן LAMP1 הקשור לליזוזום או צבעים ממוקדי מיטוכונדריה TMRM או MitoTracker יושמו על ידינו בעבר ומתמקדים בהיבטים ספציפיים יותר של ביולוגיה תאית של PD9. מיקרוסקופ אור סטנדרטי מוגבל במובן זה שניתן לפתור רק ארבעה אורכי גל פלואורסצנטיים. לכן, הוספת כתמים ליזוזומליים או מיטוכונדריאליים ללוח הצביעה הנוכחי אינה אפשרית בקלות. בהתאם לשאלה הביולוגית, ניתן להחליף כתמים. לחלופין, ניתן להכתים שני מבנים ביולוגיים באותו אורך גל בתנאי שניתן להבחין במורפולוגיה שלהם ושהם ממוקמים בתאי תאים שונים.

כדי להגביר את תאימות הסינון של הפרוטוקול, הוא תוכנן לדרוש מספר מינימלי של צעדי צנרת ומשך תרבית קצר. קריטיים לשיטה הם כל שלבי הטיפול בנוזלים מכיוון שהם יכולים להשפיע על הציפוי או לגרום לניתוק של נוירונים. כפי שצוין בפרוטוקול, מומלץ כי כמות שיורית של מדיום תמיד נשאר בבאר. זה גם קריטי לטפל נוירונים mDA בזהירות מאז הם סוג תא שביר מאוד. בצע הפשרה בדיוק כפי שצוין כדי למנוע מוות תאי מוגזם עקב קרע אוסמוטי של קרום התא. צפיפות הזריעה הותאמה כדי לייצר מספיק נתונים לכל באר תוך מניעת מבנים חופפים מוגזמים, כגון נוירוטים או גרעינים בתמונות. פרופילים פנוטיפיים רגישים מאוד להשפעות מיקום בצלחת 2,4,23. כפי שצוין בפרוטוקול, אין להשתמש בבארות קצה. בנוסף, מומלץ להשתמש לפחות בחמישה עותקים טכניים לכל תנאי ניסוי בעת תכנון ניסוי. באופן אידיאלי, לפזר את העותקים המשוכפלים באופן אקראי על הצלחת.

כמו בכל שיטה, פרופיל פנוטיפי עצבי יש מגבלות. מערכי נתונים של פרופיל פנוטיפי יכולים להיות גדולים מאוד, במיוחד כאשר הם מחושבים עבור תאים בודדים. למרות שיש תכונות פנוטיפיות יותר יכול להיות יתרון, כגון חשיפת מנגנון לא ידוע בעבר או הבטחת יציבות מערכת הבדיקה, זה יכול גם להציג רעש לא רצוי ולהיות מאתגר יותר לפרש מאשר תכונות בודדות שנבחרו בקפידה. לדוגמה, התאמת יתר של מודלים או מתאמים מזויפים הם אתגרים המתרחשים בתדירות גבוהה יותר במערכי נתונים גדולים 4,24. פרופיל פנוטיפי לא נועד אפוא להחליף תכנון ניסויי מונחה השערות, אלא לשמש נקודת מוצא להשערות חדשות שניתן לבחון לאחר מכן. פרקינסון היא מחלה נוירודגנרטיבית ולעתים קרובות מתבטאת רק בשלב מאוחר בחיים. לכן, חקר ביולוגיה של מחלות הקשורות לפרקינסון מוסמיך בתאי עצב שמקורם ב-iPSC יכול להוות מגבלה, במיוחד כאשר ההתמקדות היא בסימני היכר קלאסיים של פרקינסון בשלב מאוחר, כגון צבירת α-סינוקלאין 17,25,26. להיפך, בשל הופעתה המאוחרת יחסית של מחלת פרקינסון, השלב הטרום-סימפטומטי מוערך כארוך. פתולוגיות משמעותיות עשויות אפוא כבר להיות ניתנות לגילוי על בסיס תאי במודלים עצביים של iPSC mDA, בעוד שברמה המערכתית, המוח מסוגל לפצות על אובדן עצבי ותפקודי במשך שנים רבות27,28.

בעתיד, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לסוגי נוירונים אחרים שמקורם ב-iPSC, כגון נוירונים קליפתיים או מוטוריים, על-ידי החלפת כתמים רלוונטיים לנוירונים mDA בכתמים המתמקדים, למשל, בביולוגיה סינפטית או בצברים תוך-תאיים. נוירונים קורטיקליים יכולים, למשל, להיות מאופיינים באמצעות צביעה פאן-נוירוטית כנגד β-טובולין III וחלבונים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים כגון Synapsin1 והומרוס, שעבורם תוארו נוגדנים באיכות גבוהה29. נוירונים מוטוריים יכולים להיות פנוטיפיים באמצעות נוגדנים נגד כולין אצטילטרנספראז (ChAT), חלבון קושר DNA זפת 43 (TDP-43) וסמני גרגרי RNA30. לסיכום, צפוי כי הפרוטוקול המוצג ליצירת פרופילים פנוטיפיים עצביים יהיה שימושי עבור קהילת המחקר לחקור את ההשפעות של הפרעות כימיות או גנטיות על מגוון רחב של פנוטיפים עצביים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים מועסקים על ידי Ksilink.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לכל העמיתים ב-Ksilink על עזרתם רבת הערך והדיונים שהובילו לעיצוב הפרוטוקול המוצג.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti- chicken – Alexa 647 Jackson ImmunoRearch 703-605-155 Immunofluorescence
Anaconda https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2 Novus NB300-213 Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488 Thermo Fisher A11001 Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555 Thermo Fisher A21429 Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase Merck T2928 Immunofluorescence
Anti-α-synuclein Abcam 138501 Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head Agilent If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope  Yokogawa CV7000 The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter Invitrogen Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+ Gibco 14040-133 Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser  BioTek (Agilent)  If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %) Euromedex EM-15710-S Fixation before staining
Hoechst 33342 Invitrogen H3570 Nuclear staining
iCell Base Medium 1 Fujifilm M1010 Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M Fujifilm C1087 Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139 Fujifilm C1149 Donor carrying LRRK2 G2019S mutation 
iCell Nervous System Supplement Fujifilm M1031 Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B Fujifilm M1029 Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook In-house development https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin Biolamina LN521 Plate coating
PFE-360 MedChemExpress HY-120085 LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink In-house development https://github.com/Ksilink/PhenoLink Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated Perkin Elmer 6057500 Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL Thermo Scientific AB-0781 Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton Sigma T9284 Permeabilization before lysis
Trypan Blue Sigma T8154-20ML Determination of living cells
Vprep Pipetting System  Agilent Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. The cell biology of Parkinson's disease. The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095 (2021).
  2. Caicedo, J. C., et al. Data-analysis strategies for image-based cell profiling. Nature Methods. 14 (9), 849-863 (2017).
  3. Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
  4. Bray, M. -A., et al. Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nature Protocols. 11 (9), 1757-1774 (2016).
  5. Schiff, L., et al. Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts. Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).
  6. Ziegler, S., Sievers, S., Waldmann, H. Morphological profiling of small molecules. Cell Chemical Biology. 28 (3), 300-319 (2021).
  7. Cobb, M. M., Ravisankar, A., Skibinski, G., Finkbeiner, S. iPS cells in the study of PD molecular pathogenesis. Cell and Tissue Research. 373 (1), 61-77 (2018).
  8. Elitt, M. S., Barbar, L., Tesar, P. J. Drug screening for human genetic diseases using iPSC models. Human Molecular Genetics. 27 (R2), 89-98 (2018).
  9. Vuidel, A., et al. High-content phenotyping of Parkinson's disease patient stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons using machine learning classification. Stem Cell Reports. 17 (10), 2349-2364 (2022).
  10. Stirling, D. R., Swain-Bowden, M. J., Lucas, A. M., Carpenter, A. E., Cimini, B. A., Goodman, A. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Sofroniew, N., et al. napari: a multi-dimensional image viewer for Python. , (2022).
  13. Berthold, M. R., et al. KNIME: The Konstanz Information Miner. Data Analysis, Machine Learning and Applications. , 319-326 (2008).
  14. Fathi, A., et al. Diverging Parkinson's Disease Pathology between patient-derived GBAN370S, LRRK2G2019S and engineered SNCAA53T iPSC-derived Dopaminergic Neurons. bioRxiv. , (2023).
  15. Wang, Y., Huang, H., Rudin, C., Shaposhnik, Y. Understanding How Dimension Reduction Tools Work: An Empirical Approach to Deciphering t-SNE, UMAP, TriMap, and PaCMAP for Data Visualization. Journal of Machine Learning Research. 22 (201), 1-73 (2021).
  16. Ke, G., et al. LightGBM: A highly efficient gradient boosting decision tree. Advances in Neural Information Processing Systems. 30, https://papers.nips.cc/paper/2017/hash/6449f44a102fde848669bdd9eb6b76fa-Abstract.html (2017).
  17. Avazzadeh, S., Baena, J. M., Keighron, C., Feller-Sanchez, Y., Quinlan, L. R. Modelling Parkinson's Disease: iPSCs towards Better Understanding of Human Pathology. Brain Sciences. 11 (3), 373 (2021).
  18. Sánchez-Danés, A., et al. Disease-specific phenotypes in dopamine neurons from human iPS-based models of genetic and sporadic Parkinson's disease. EMBO Molecular Medicine. 4 (5), 380-395 (2012).
  19. Oosterveen, T., et al. Pluripotent stem cell derived dopaminergic subpopulations model the selective neuron degeneration in Parkinson's disease. Stem Cell Reports. 16 (11), 2718-2735 (2021).
  20. Hughes, R. E., et al. Multiparametric high-content cell painting identifies copper ionophores as selective modulators of esophageal cancer phenotypes. ACS Chemical Biology. 17 (7), 1876-1889 (2022).
  21. Akbarzadeh, M., et al. Morphological profiling by means of the Cell Painting assay enables identification of tubulin-targeting compounds. Cell Chemical Biology. 29 (6), 1053-1064 (2022).
  22. Schiff, L., et al. Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts. Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).
  23. Way, G. P., et al. Morphology and gene expression profiling provide complementary information for mapping cell state. Cell Systems. 13 (11), 911-923 (2022).
  24. Feng, Y., Mitchison, T. J., Bender, A., Young, D. W., Tallarico, J. A. Multi-parameter phenotypic profiling: using cellular effects to characterize small-molecule compounds. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (7), 567-578 (2009).
  25. Antonov, S. A., Novosadova, E. V. Current state-of-the-art and unresolved problems in using human induced pluripotent stem cell-derived dopamine neurons for parkinson's disease drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3381 (2021).
  26. Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell Stem Cell. 13 (6), 691-705 (2013).
  27. Bezard, E., Gross, C. E., Brotchie, J. M. Presymptomatic compensation in Parkinson's disease is not dopamine-mediated. Trends in Neurosciences. 26 (4), 215-221 (2003).
  28. Wu, Y., Le, W., Jankovic, J. Preclinical Biomarkers of parkinson disease. Archives of Neurology. 68 (1), 22-30 (2011).
  29. Verstraelen, P., et al. Systematic quantification of synapses in primary neuronal culture. iScience. 23 (9), 101542 (2020).
  30. Liu-Yesucevitz, L., et al. ALS-Linked mutations enlarge TDP-43-enriched neuronal RNA granules in the dendritic arbor. The Journal of Neuroscience. 34 (12), 4167-4174 (2014).

Tags

פרופיל פנוטיפי תאי גזע אנושיים נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון מחלת פרקינסון מודלים תאיים של PD חוץ גופי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) פנוטיפים עצביים פאנל צביעה פלואורסצנטי צביעה גרעינית α-synuclein טירוזין הידרוקסילאז (TH) חלבון הקשור למיקרוטובול 2 (MAP2) פרוטוקול פרופיל פנוטיפי ניתן להרחבה לוחות 384 בארות טיפול אוטומטי בנוזלים מיקרוסקופיה בתפוקה גבוהה מוטציית G2019S גן קינאז חוזר עשיר בלאוצין 2 (LRRK2) מעכב קינאז LRRK2 PFE-360 שינויים פנוטיפיים פרופילים פנוטיפיים רב-ממדיים ניתוח אשכולות סיווג מונחה למידת מכונה
פרופיל פנוטיפי של נוירונים דופמינרגיים שמקורם בתאי גזע אנושיים במוח התיכון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weiss, A., Sommer, P., Wilbertz, J.… More

Weiss, A., Sommer, P., Wilbertz, J. H. Phenotypic Profiling of Human Stem Cell-Derived Midbrain Dopaminergic Neurons. J. Vis. Exp. (197), e65570, doi:10.3791/65570 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter