Summary
在该方案中，使用改良的Videman方法制备了膝骨关节炎模型，并详细介绍了针灸切开术的操作规程和注意事项。针灸切开术的有效性已通过测试股四头肌和肌腱的机械性能以及软骨的机械和形态特性得到证明。
Abstract
膝骨关节炎（KOA）是骨科最常遇到的疾病之一，严重降低了KOA患者的生活质量。在几个致病因素中，膝关节的生物力学失衡是KOA的主要原因之一。针灸学认为，恢复膝关节的机械平衡是治疗KOA的关键。临床研究表明，针灸术可以通过减少膝关节周围肌肉和肌腱的粘连、软组织挛缩和应力集中点来有效减轻疼痛并改善膝关节活动度。
在该协议中，我们使用改进的 Videman 方法通过将左后肢固定在笔直位置来建立 KOA 模型。我们详细概述了针灸术的操作方法和注意事项，并通过检测股四头肌和肌腱的力学性能以及软骨力学和形态学，结合“调节肌肉和肌腱治疗骨骼疾病”理论评估了针灸切开术的疗效。结果表明，针灸术通过调节膝关节周围软组织的力学性能，改善软骨应力环境，延缓软骨退化，对软骨具有保护作用。
Introduction
膝骨关节炎 （KOA） 是最常见的骨关节炎形式，通常被认为是一种以关节软骨变性为特征的全关节疾病，临床表现为受累关节疼痛、肿胀和活动受限1。根据最近的流行病学统计数据，据报道，到 2020 年，全球 40 岁或以上的 KOA 影响了 6.541 亿人。KOA 的患病率和发病率随着年龄的增长而上升，在中老年人中最高，并且影响的女性多于男性2。由于全球人口老龄化和肥胖流行，KOA的患病率可能会增加，对全球公共卫生构成越来越大的威胁。年龄、性别、肥胖、创伤和其他与 KOA 相关的复杂危险因素都直接影响膝关节不稳定，使膝关节的生物力学失衡成为 KOA3 的主要原因之一。
在正常生理条件下，膝关节处于机械平衡状态，保证关节内的机械负荷均匀分布在软骨上。膝关节的任何机械失衡都会导致软骨异常应力，导致软骨退化和 KOA4 的发作。肌腱系统是维持膝关节机械平衡的主要动力系统。伸屈肌腱系统的协调运动可以均匀地分布在软骨表面的运动产生的负荷，避免局部软骨应力超出其生理负荷的代谢失衡，导致软骨流失5。肌肉力量下降是肌肉内运动障碍和软骨损伤的主要原因，这可能发生在有症状的 KOA 之前。
KOA 还可诱发关节肌抑制 （AMI），表现为肌肉无力和膝关节周围肌肉力量下降6.在这些肌肉中，股四头肌群是唯一的膝伸肌，是维持膝关节稳定性的重要结构。研究表明，股四头肌横截面积和肌肉力量的减少与 KOA 进展显着正相关7。股四头肌力量的下降会影响步态模式、膝关节稳定性、运动模式和许多其他功能。此外，肌肉力量的下降会损害肌腱功能，表现为肌腱刚度、弹性模量和其他生物力学特性的降低8.在长期应变修复中，膝关节的肌肉和肌腱可能发生粘连、挛缩等变化，破坏其力学性能，引起关节不稳定，最终形成KOA病理变化的恶性循环。因此，对于KOA治疗来说，改善肌腱系统的机械性能并恢复关节机械平衡至关重要。
在 KOA 的原因中，生物力学失衡是膝关节疼痛、功能障碍、炎症性病变和软骨退行性变的主要诱发因素9。因此，治疗KOA的关键是恢复膝关节的生物力学平衡。针灸学认为KOA的病因和发病机制是“机械失衡”。当膝关节周围软组织的力学特性发生异常变化时，膝关节失去机械平衡，关节异常的机械应力环境加速退化，引起炎症刺激，进一步加重软组织粘连、挛缩，关节稳定性进一步下降。这种恶性循环最终发展成KOA。针灸术通过松弛软组织粘连和挛缩，以及降低肌肉和肌腱的压力集中，结合“调节肌肉和肌腱治疗骨骼疾病”的理论，改善软组织力学，“调节肌肉和肌腱”，平衡关节的机械应力，有效缓解软骨退化和“治疗骨骼疾病”10.在动物模型选择方面，基于本研究的目的，我们采用改良的Videman左后肢伸展固定方法制备了KOA模型。
本文详细介绍了使用改良的Videman左后肢伸展固定方法建立KOA模型以及针灸切开术的操作方法和注意事项。我们通过测试股四头肌和肌腱的机械性能以及检测关节软骨应力和形态的变化来证明针灸切开术的有效性。
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Protocol
所有动物实验均经北京中医药大学动物伦理委员会评审批准。BUCM-4-2022010101-1097）。在该协议中，24 只 6 周龄的雄性新西兰兔被饲养在特定条件下，即 20-25 °C、50-60% 湿度和 12 小时光照/12 小时黑暗昼夜节律周期，可以自由获得常规食物饮食。通过结合深度麻醉和空气栓塞术对兔子进行麻醉和处死。疼痛是KOA的典型病理特征之一，也是评估KOA动物模型和干预方法的关键指标之一，因此在模型制备过程中不使用镇痛药。
1. KOA兔模型
- 用 3% 戊巴比妥钠 （30 mg/kg） 在耳缘静脉注射麻醉兔子。为了确认适当的麻醉水平，寻找角膜反射明显减弱或消失，并且用止血钳夹住皮肤时没有疼痛。麻醉期间，每15分钟在兔子的眼睛上滴2-3滴润滑剂，以防止兔子的眼睛变干。
- 麻醉后，将每只兔子固定在仰卧位，将左后肢拉到完全伸展的位置。
- 将每只兔子的左后肢固定在伸展位置。
- 作为第一层，用医用胶带覆盖兔子的皮肤，从腹股沟到踝关节。
- 作为第二层，将 36 毫米宽的双面泡沫胶带缠绕在医用胶带上，然后用聚合物绷带从腹股沟缠绕到踝关节。确保膝关节伸直 180°，踝关节背屈 60°。
- 作为第三层，在膝关节和踝关节的前后用小夹板固定关节，并在最外层缠绕钢网以防止咬伤。露出兔子的脚趾，观察血液循环是否正常。
- 将动物固定6周以建立KOA模型（图1）。
注意： 1） 在模型准备过程中，每隔一天检查一次模具。如果任何霉菌松动或脱落，请麻醉兔子，并在伸展位置重新固定左后肢。2）在笼子底部铺设保护垫，防止兔子的四肢被卡住而受伤。
2. 针灸干预
注意：在针灸术干预开始之前，通过耳缘静脉注射用3%戊巴比妥钠（30mg / kg）麻醉兔子。
- 确定治疗点。
- 剃掉兔子左后肢膝关节的皮毛。
- 触诊兔膝关节内侧股肌肌腱插入、股直肌肌腱插入、股二头肌肌腱插入和鹅足滑囊。用无菌皮肤标记标记局部肌肉的病理性硬结。用医用碘伏和 75% 医用酒精交替对膝关节进行三次消毒。
- 针灸手术
- 保持针灸刀片平行于平行于肌腱和肢体纵轴的行进方向。
- 用左手的拇指向下按压进入标记点的皮肤并横向移动，使拇指腹侧的血管和神经分开。
- 右手握住针灸手柄，用小力快速按压，使针灸刀片瞬间穿过皮肤。缓慢地将针灸刀片推进到局部肌肉硬结处，并进行纵向切割和横向摆动。
- 针灸手术完成后，再次对膝关节进行消毒并贴上创可贴。
- 每周执行一次此操作，持续 4 周（图 2）。
注意：1）如果股内侧肌、股外侧肌、股直肌、股二头肌或鹅肌滑囊的肌腱插入处没有接触硬结或索状组织，则应使用针灸针直接释放其肌腱插入处。2）针灸干预时，不要将针灸组和模型组兔的左后肢固定在伸展位置。
3. 股四头肌弹性模量
注：1）本实验采用实时横波弹性成像（SWE）超声诊断仪测量每组兔体内股四头肌的弹性模量。2）测试人员应为具有超声检测经验的超声医师。测量时，应将超声探头轻轻放在股四头肌的皮肤表面，以避免局部肌肉紧张。当动物处于安静状态，没有挣扎或活动时，需要进行测量。如果动物处于活动状态，请等到它平静后再进行测试。
- 剃掉皮毛，露出左后肢股四头肌区域的皮肤。
- 使用传统的二维超声来定位股四头肌肌肉腹部并确定感兴趣区域 （ROI），设置为 1-2 厘米的深度。
- 启动 SWE 模式 进行检查。
- 将感兴趣区域均匀设置为直径为 2 mm 的圆形区域，并将感兴趣区域设置为距皮肤表面 ~0.5-1 cm 深。
- 使用超声诊断仪产生声辐射力脉冲，刺激肌肉组织，获得组织弹性成像。
- 等待 2-3 秒让图像稳定，然后冻结图像。激活仪器的 Q-BOX 功能以测量股四头肌的杨氏模量。
- 等待系统自动计算 ROI 杨氏模量的最大值、最小值和平均值（单位：KPa）。为三个测量值选择三个相同深度的 ROI，并取平均值进行统计分析。
注意：测试人员应是经验丰富的超声检测超声医师。测量时，应将超声探头轻轻放在股四头肌的皮肤表面，以避免局部肌肉紧张。当动物处于安静状态，没有挣扎或活动时，需要进行测量。如果动物处于活动状态，请等到它平静后再进行测试。
4. 测量股四头肌的收缩力
注：测量股四头肌收缩力后，在麻醉下通过空气栓塞对兔子实施安乐死。
- 用3%戊巴比妥钠（30mg / kg）在耳缘静脉注射麻醉兔子。为了确认已达到适当的麻醉水平，请寻找角膜反射明显减弱或消失，并且用止血钳夹紧皮肤时没有疼痛。麻醉期间，每15分钟在兔子的眼睛上滴2-3滴润滑剂，以防止兔子的眼睛变干。
- 暴露股四头肌并连接张力换能器。
- 切开髌骨下方的皮肤，沿肢体纵轴向上切至大腿根部，继续向上切开皮肤3-4厘米。小心地剥离皮肤和筋膜，露出肌肉。切开髌韧带，小心地将股四头肌与髂关节分开，保持股四头肌与髂骨相连。
- 在髌骨和股四头肌之间的肌腱连接处结扎手术缝合线。在自然状态下将肌肉拉伸至全长，然后将其连接到张力传感器上。将肌肉上的结扎线与力传感器上的结扎线保持在一条直线上。
- 将张力传感器固定到支架上。将张力传感器上的信号采集线连接到生物信号采集系统处理器。
- 测量股四头肌的收缩性能。
- 将电极平行于股四头肌腹部插入，并避免电极之间有任何接触。
- 按下示波器按钮。调整力传感器在支架上的位置，使基线保持在零。选择波宽为5ms，延迟为10ms的刺激器的刺激参数。
- 首先使用单个刺激，然后从零开始逐渐调整刺激强度，每次增量为 0.1 V。观察肌肉收缩曲线和收缩幅度的变化，直到确定股四头肌的最大单次收缩幅度（Pt）。记录下来以备后续统计。
- 使用集群刺激，以诱发最大单次收缩幅度的刺激幅值为基线，持续刺激肌肉，逐渐增加刺激频率。观察肌肉收缩曲线的变化，直到确定股四头肌的最大收缩幅度 （Pt）。记录下来以备后续统计。
注意： 1） 每次肌肉收缩后，应给予肌肉 30 秒放松，肌肉缓冲溶液不断滴在肌肉上。2）手术过程中，通过监测兔子的眼睑反射、呼吸节律、肌肉松弛和皮肤捏合反应来判断麻醉状态。
5.股四头肌肌腱的力学性能
- 预处理：在测试当天，用游标卡尺测量股四头肌肌腱的长度、宽度和厚度，并在疲劳试验机中安装专用防滑夹具。重复加载和卸载 15 倍进行预处理。
- 应力松弛测试：使用0N至100N的传感器，以5mm/min的速度拉伸，直到达到所需长度，然后开始收集数据。从t（0）开始设置计算机数据采集时间，每0.1秒采集一次数据，持续1800秒。达到设定时间后，记录数据和曲线。
- 拉伸试验：使用0N至100N的传感器，以5mm/min的速度将其拉伸至最大载荷，直到试样被拉开。试验后，计算试样的最大位移、极限载荷和刚度。
6.关节接触面压力和软骨单位面积压力
- 将两侧的股骨和胫骨标本固定在固定装置上的笔直位置并进行预紧力测试。测量膝关节的大致范围，将压敏纸切成相同的形状，并用保鲜膜密封。
- 将密封的压敏纸放在胫骨和股骨关节之间，以5mm/min的压力和50N的最大压力对膝关节进行压力测试。 保持压力 2 分钟，直到压力敏纸稳定着色时达到 50 N。
- 2分钟后，取出压敏纸，将彩色表面固定在A4尺寸的纸上，并在放置比例的情况下获取图像。
- 将图像上传到计算机。使用参考软件进行面积测量和不规则图形的多段测量。测量股骨和胫骨关节内外的压力并记录结果。
7. Safranin O/Fast Green 膝关节软骨染色
- 针灸干预结束后，取软骨 - 软骨下骨复合物组织并将其嵌入石蜡中。将准备好的组织蜡块切片并准备载玻片。用环境脱蜡溶液（I）和环境脱蜡溶液（II）将制备的组织载玻片脱蜡，每次15分钟;然后，依次浸入二甲苯和无水乙醇（1：1），无水乙醇（I），95%乙醇，85%乙醇和75%乙醇中，每步2-5分钟;最后，将它们浸泡在蒸馏水中15分钟。
- 进行染色。
- 用Fast Green溶液染色载玻片1分钟。在此过程中，将载玻片从溶液中取出并在显微镜下观察它们，直到组织染成深绿色。
- 分色：用超纯水冲洗多余的Fast Green溶液。将载玻片快速浸泡在1%醋酸溶液中5-10秒。 再次，用超纯水冲洗载玻片。
- 将载玻片浸入Safranine O溶液中10-15分钟，直到软骨染成红色。
- 脱水并澄清组织，密封载玻片，并在显微镜下观察它们。
- 将载玻片依次浸泡在75%乙醇，85%乙醇，95%乙醇和100%乙醇中3-5秒。
- 将载玻片连续浸入环境脱蜡溶液（I）和环境脱蜡溶液（II）中10分钟。取出载玻片，将中性树脂介质放在载玻片的前面，避开组织。将盖玻片的边缘放在载玻片上，然后慢慢放下以覆盖中性香脂。去除空气，避免气泡。擦去多余的二甲苯和中性香脂，让它在室温下静置过夜。
- 在显微镜下观察载玻片并获取图像。对于每组，选择六个兔膝软骨样本，并为每个样本随机选择四个不同的观察区域进行评估。根据Mankin方法对每组的软骨组织学进行评分（表1）。
8. 统计分析
- 将数据表示为平均值±标准差 （
± s）。 - 执行单因素方差分析 （ANOVA） 和 LSD 检验，以确定多组比较的统计显着性。
- 当 P < 为 0.05 时，考虑具有统计学意义的差异。
± s）。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
股四头肌和肌腱力学性能实验结果
为了评估针灸学对KOA兔股四头肌力学性能的影响，我们分别使用了实时横波弹性超声成像和肌肉张力换能器。与对照组相比，KOA组股四头肌Young模量降低（P < 0.05）。与KOA组相比，针灸组的Young模量增加（P < 0.05，图3A）。股四头肌收缩能力方面，与对照组相比，KOA组股四头肌单次收缩幅度和股四头肌强直收缩幅度均显著降低（P < 0.05，P < 0.01）。 与KOA组相比，针灸切开术组股四头肌单次收缩幅度和强直收缩幅度显著增加（P < 0.05，P < 0.01，图3B，C）。 这些结果表明，针灸术可以改善KOA兔股四头肌的杨氏模量和肌肉收缩力。
为了评估针灸术对KOA兔股四头肌肌腱力学性能的影响，我们对股四头肌肌腱进行了拉伸试验和应力松弛试验。股四头肌肌腱拉伸特性方面，与对照组相比，KOA组股四头肌肌腱极限负荷和最大位移显著降低（P < 0.01，P < 0.01），KOA组股四头 肌肌腱刚度呈下降趋势（P > 0.05）。与KOA组相比，针灸组股四头肌肌腱极限负荷和最大位移显著降低（P < 0.01，P < 0.01），针灸组股四头肌 肌腱硬度呈上升趋势（P > 0.05，图4A-C）。在应力松弛率方面，与对照组相比，KOA组股四头肌肌腱应力松弛率降低（P < 0.05）。与KOA组相比，针灸组股四头肌肌腱应力松弛率增加（P < 0.05，图4D）。这些结果表明，针灸可以改善KOA兔股四头肌肌腱的拉伸和应力松弛特性。
压力和单位面积压力对软骨接触面及软骨形态的实验结果
在软骨接触面最大压力方面，与对照组相比，KOA组软骨接触面最大压力差异无统计学意义（P > 0.05），但呈下降趋势。与KOA组相比，针灸组软骨接触面最大压力差异无统计学意义（P > 0.05），但呈上升趋势（图5A）。在软骨接触面单位面积压力方面，与对照组相比，KOA组单位面积最大压力差异无统计学意义（P > 0.05），但呈下降趋势。与对照组相比，针灸组单位面积最大压力差异无统计学意义（P > 0.05），但呈上升趋势（图5B）。这些结果表明，针灸干预有增加软骨接触面最大压力和单位面积压力的趋势，表明对软骨应力环境有积极影响。
为了评估针灸切开术对软骨形态的影响，我们使用了番红红O-Fast Green染色。对照组软骨表面光滑;各层软骨细胞排列整齐有序;浅表软骨细胞排列成纺锤形;软骨细胞的中层和深层呈柱状排列;潮汐线清晰完整;并且没有形成翳（图6A）。KOA组软骨表面粗糙或有剥落缺损;浅表软骨细胞数量减少;软骨细胞层次结构和排列紊乱;中层软骨细胞出现脱水、收缩和坏死征象;观察到软骨细胞聚集;潮汐线模糊或扭曲，可见骨折;在某些地区可以看到重复的潮汐线;血管可能已经穿过潮汐线进入非钙化层软骨;或形成翳（图6B）。针灸组软骨表层相对光滑;软骨细胞结构正常;各层软骨细胞排列相对整齐;潮汐线清晰或偶尔有重复的潮汐线;没有形成翳（图6C）。在软骨形态学评分方面，与对照组相比，KOA组的软骨Markin评分显著提高（P < 0.01）。与KOA组相比，针灸组软骨Markin评分显著降低（P < 0.01， 图6D）。这些结果表明，KOA兔的软骨完整性受损，针灸干预可以延缓软骨的退化，对软骨有保护作用。
图 1：改进的 Videman 方法建立膝骨关节炎模型。 （A） 建立KOA模型所需的材料。（B） 使用医用压敏胶带覆盖兔子的左后肢。（C） 将聚合物绷带缠绕在兔子的左后肢上。（D，E）使用夹板固定兔子的膝关节和踝关节。（F） 缠绕金属丝网，防止兔子啃食。请点击这里查看此图的较大版本.
图2：针灸介入操作方法。 （A）兔子左后肢膝关节的皮肤准备。（B） 选择插入点并使用手术皮肤标记标记位置。（三）使用医用碘伏消毒。（D） 加压和分离，以避开神经和血管。（E） 刺穿针灸术并进行手术。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：股四头肌的机械性能。 （A）股四头肌杨氏模量分析;（二）股四头肌单次收缩幅度分析;（三）股四头肌强直收缩幅度分析。值是标准差±均值，每组 N = 6。与对照组相比： *P < 0.05， **P < 0.01;与对应模型组相比： #P < 0.05 和 ##P < 0.01。缩写：KOA=膝骨关节炎。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4：股四头肌肌腱的机械性能。 （A）股四头肌肌腱极限负荷分析;（二）股四头肌肌腱最大位移分析;（三）股四头肌肌腱刚度分析;（D）股四头肌肌腱的应力松弛。值是标准差±均值，每组 N = 6。与对照组相比： *P < 0.05， **P < 0.01;与对应模型组相比： #P < 0.05， ##P < 0.01。缩写：KOA=膝骨关节炎。 请点击这里查看此图的较大版本.
图5：软骨接触面上的压力。 （A）软骨接触面上最大压力的分析;（二）软骨接触面单位面积压力分析。值是标准差±均值，每组 N = 6。缩写：KOA=膝骨关节炎。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：用 Safranin O-Fast green 和 markin 评分对软骨进行染色。 （A）对照组，（B）模型组，（C）针灸切开组，（D）软骨Markin评分分析。值是标准差±均值，每组 N = 6。与对应对照组比较：**P < 0.01;与对应模型组相比：##P < 0.01。比例尺 = 50 μm （A-C）。缩写：KOA=膝骨关节炎。请点击这里查看此图的较大版本.
| 一.结构 | 三、染色 | ||
| 一个。正常 | 0 | 一个。正常 | 0 |
| b.表面不规则性 | 1 | b.略有减少 | 1 |
| c. Pannus 和表面不规则性 | 2 | c. 适度减少 | 2 |
| d. 裂缝到过渡区 | 3 | d. 严重减少 | 3 |
| e.裂缝到放射状区域 | 4 | e.未注明染料 | 4 |
| f.裂隙至钙化区 | 5 | ||
| g.完全混乱 | 6 | ||
| II. 细胞 | 四、潮汐标志完整性 | ||
| 一个。正常 | 0 | 一个。完整 | 0 |
| b.弥漫性细胞增生 | 1 | b.被血管交叉 | 1 |
| c.克隆 | 2 | ||
| d. 细胞发育减退 | 3 | ||
表 1：修改后的 Mankin 评分。
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Discussion
合适的动物模型是实现实验目标和阐明特定科学问题的关键因素之一。本研究基于针灸学中的“宗进控制骨骼和润滑关节”和“机械失衡”理论，旨在解释针灸治疗中“调节肌肉和肌腱治疗骨骼疾病”治疗KOA背后的科学内涵。换句话说，针灸术通过调节膝关节周围软组织的力学特性来延缓退化并保护软骨，从而改善软骨的异常机械环境。KOA动物模型一般分为两类：自发模型和诱导模型。由于建模持续时间相对较长且局限性较大，自发 KOA 模型的使用较少。诱导 KOA 模型可以通过手术方法（例如改良 Hulth 方法、半月板切除术、前交叉韧带断裂、关节内注射和关节固定）建立。手术方法，包括切断内侧副韧带、前交叉韧带、切除内侧半月板等结构，用于破坏膝关节的稳定性，这将导致内部机械失衡和关节表面之间的直接摩擦，从而诱发KOA11。这种类型的模型更适合于创伤性关节炎的研究。关节内注射将药物输送到膝关节腔，诱导炎症、软骨细胞代谢紊乱和关节腔内软骨细胞的毒性反应，从而发展 KOA，而对关节应力影响不大12。关节固定通过限制膝关节的运动导致膝关节周围的肌肉和韧带萎缩，导致关节应力的变化，从而发展和加剧关节软骨变性，从而建立 KOA 模型12。
改良的Videman方法是一种关节固定方法，更符合人膝关节肌肉无力引起的KOA的病理过程，如膝关节肌肉和韧带的废用性萎缩，将膝关节固定在过度伸展的位置，导致关节应力和软骨退化的变化。与导致关节不稳定导致KOA的手术方法相比，改良的Videman方法更符合KOA的自然发病机制，其中肌腱损伤是第一阶段，其次是肌腱和骨病;因此，它更适合本研究13.由于针灸术治疗早期或中期KOA的效果较为明显，成型时间为6周，与中期KOA的病理变化一致。在模型诱导过程中，长时间过度伸展制动会导致膝关节周围肌肉萎缩，左后肢的不适往往会导致兔子啃咬模型器具。由于模型器具可能会松动，因此需要定期检查兔子型设备的密封性并及时加固。此外，要时刻注意兔子的四肢供血、肿胀、皮肤病变、消化道症状，必要时取下模型器具。由于兔子在这个过程中处于麻醉状态，因此需要让兔子保持温暖，并实时关注兔子的状态，直到兔子醒来。
针灸术在现有针灸针的基础上，还具有手术刀功能，采用针灸的概念穿透人体，具有优于针灸针的切割和分离效果，同时给人体带来的创伤远小于手术刀14。针灸学认为，KOA的根本原因是膝关节周围软组织损伤导致的机械失衡。因此，用针灸术治疗KOA的关键是恢复膝关节的机械平衡。在治疗点的选择上，一方面，针灸术是以经络筋理论为基础，以痛部位为穴位。另一方面，针灸术以现代解剖学和生物力学为指导，认为膝关节周围的软组织损伤会导致粘连和收缩，从而破坏膝关节的机械平衡并在关节中产生高应力点。因此，组织粘附、收缩和高应激点通常作为治疗点15,16。
软组织的生物力学分析表明，肌腱和骨骼的附着点大多是软组织应力集中的地方，也称为应力集中，并且容易产生粘连、挛缩和脐带状结节等病理产物17。此外，临床实践证明，触诊发现的压痛点常与肌腱和骨骼的附着点重叠。因此，本研究选择了股内侧肌、股外侧肌、股直肌、股二头肌和鹅肌滑囊的肌腱插入。虽然针灸对组织的创伤较小，但它仍然是一种侵入性干预方法。在干预过程中，必须严格遵循针灸切开术的四步程序：位置、方向、按压松开和穿刺。此外，用户必须注意每次干预的放松程度和治疗频率。建议每周一次释放每个治疗点2-3次，以防止对组织造成过度损伤。针灸干预完成后，再次对兔子左后肢的膝关节进行消毒，并在针灸切入点贴上创可贴。
稳定的膝关节是维持机械平衡和进行正常生理运动的先决条件18.肌肉和肌腱是维持膝关节稳定性的重要因素，是决定肌肉在收缩和被动拉动中的不同力学性能的粘弹性组织结构，是肌肉力学性能的重要组成部分，保证了肌肉的正常运动功能。弹性模量是软组织机械性能的指标，与股四头肌的机械功能变化呈正相关 19.在生理学上，骨骼肌收缩包括两种形式：单次收缩和强直性收缩。前者是肌肉活动的基本单位，而后者主要产生骨骼肌的平滑运动。因此，单次收缩和强直收缩的最大振幅通常用于评估肌肉收缩功能。
废用性骨骼肌萎缩导致强直收缩减少和最大自主收缩，表明肌肉收缩能力下降20。肌肉力量的下降会损害肌腱的功能，表现为肌腱粘弹性降低和肌腱抵抗变形能力下降8。在病理条件下，肌腱的应力松弛和拉伸性能会降低，导致膝关节失去平衡并加速KOA的发展。因此，本研究选取股四头肌弹性模量、单次收缩幅度、股四头肌强直收缩幅度、股四头肌肌腱极限负荷、最大位移、刚度等拉伸特性以及股四头肌肌腱的应力松弛来评价针灸对股四头肌力学性能的影响。采用软骨承载区应力压力试验和膝关节软骨Safranin O/Fast Green染色，评估针灸治疗是否改善了股四头肌的力学性能，并对软骨起到了保护作用。实验结果表明，针灸术结合“调节肌腱治疗骨病”理论，可改善软骨的应激环境，延缓软骨退化，通过调节股四头肌肌腱的力学性能，对软骨有保护作用。
这个实验有一定的局限性。一方面，我们没有评估膝关节错位及其对膝关节生物力学失衡的影响。另一方面，本研究选择改良的Videman左后肢伸展固定方法进行KOA建模，通过调节膝关节周围软组织的力学性能来阐明针灸切开术在延缓软骨变性中的作用。然而，针灸术在由韧带和半月板撕裂等创伤因素引起的膝骨关节炎中的作用尚未得到研究。此外，针灸介入是一种封闭的微创手术。在这项研究中，触诊和针灸切开术干预都是在不暴露病变组织的情况下在非直视条件下进行的。为了减少主观因素对实验结果的影响，触诊和针灸干预均由同一人员进行。因此，尽管存在一定的局限性，但它们并不影响本研究结论的可靠性。
综上所述，本文详细描述了采用改良的Videman方法（左后肢伸展固定）和针灸干预的KOA模型诱导。通过对股四头肌弹性模量和收缩功能、股四头肌肌腱力学特性、关节软骨承载面积的力和压力、膝关节软骨的Safranin O/Fast Green染色等实验，分析了针灸治疗KOA的机理。研究针灸术改善软组织生物力学特性的机制可能为KOA和其他运动相关全身损伤的治疗提供新的见解。
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Disclosures
作者没有需要披露的利益冲突。
Acknowledgments
本研究得到了国家自然科学基金（第82074523,82104996号）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acupotomy | Beijing Zhuoyue Huayou Medical Devices Co., Ltd. | 0.4 x 40 mm | |
| Connect Cast Orthopedic Casting Tape | Suzhou Connect Medical Technology Co.,Ltd. | KCP06 | 15.0 cm x 360 cm |
| Double-sided Foam Tape | Deli Group Co.,Ltd. | NO.30416 | 36 mm x 5 yard x 2.5 mm |
| Environmental Dewaxing Solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1128 | |
| Ethanol absolute | Beijing Hengkangda Medicine Co., Ltd. | ||
| Fast Green solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1031 | |
| Fast grenn FCF | Sigma,America | 2353-45-9 | |
| Fatigue testing machine | BOSE, America | Bose Electro Force 3300 | |
| Four-channel physiological recorder | Chengdu Instrumeny Frctory | RM-6420 | |
| FPD-305E | Fuji, Japan | ||
| FPD-306E | Fuji, Japan | ||
| Hematoxylin solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1005 | |
| Medical iodophor disinfectant | Shan Dong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | ||
| Medical Tape | Shandong Rongjian Sanitary Products Co., Ltd. | 200402 | 1.5 x 500 cm |
| Muscle tension transducer | Chengdu Instrumeny Frctory | JH-2204005, 50 g | |
| Prescale | Fuji, Japan | ||
| Real-time SWE ultrasound diagnostic instrument | SuperSonic Imagine SA,France | SuperSonic Imagine AixPlorer | |
| Rhamsan gum | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | WG10004160 | |
| Safranine O | Sigma,America | 477-73-6 | |
| Safranine O solution | Wuhan Servicebio Technology Co.,Ltd. | G1015 | |
| Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) | IBM, America |
References
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