Summary
이 프로토콜은 유도만능줄기세포(iPSC)에서 인간 파골세포의 분화를 제시하고 파골세포 및 파골세포 전구체의 특성 분석 방법을 설명합니다.
Abstract
이 프로토콜은 인간 iPSC의 증식 및 패시징과 파골세포로의 분화에 대해 자세히 설명합니다. 첫째, iPSC는 배아체 유도에 추가로 사용하기 위해 단세포 현탁액으로 해리됩니다. 중배엽 유도 후 배아체는 조혈 분화를 거쳐 부유 조혈 세포 집단을 생성합니다. 그 후, 수확된 조혈 세포는 대식세포 콜로니 자극 인자 성숙 단계를 거치고 마지막으로 파골세포 분화를 거칩니다. 파골세포 분화 후, 파골세포는 메틸 그린 핵 염색과 함께 TRAP에 대한 염색을 특징으로 합니다. 파골세포는 다핵, TRAP+ 다핵으로 관찰됩니다. 이들의 식별은 카텝신 K 염색에 의해 더욱 뒷받침될 수 있습니다. 뼈 및 미네랄 흡수 분석은 기능적 특성 분석을 가능하게 하여 진정한 파골세포의 정체성을 확인합니다. 이 프로토콜은 인간 파골세포와 iPSC를 구별하는 강력하고 다재다능한 방법을 보여주며, 대량의 기능성 인간 파골세포가 필요한 응용 분야에 쉽게 채택할 수 있습니다. 뼈 연구, 암 연구, 조직 공학 및 내보철물 연구 분야의 응용 프로그램을 구상할 수 있습니다.
Introduction
파골세포(occteoclast, OC)는 조혈 유래 1,2, 다용도 세포 유형으로, 뼈 질환 연구 3,4, 암 연구 5,6, 조직 공학 7,8, 내보철물 연구 9,10 등의 분야에서 연구자들이 일반적으로 사용합니다. 그럼에도 불구하고, 기능적 OC를 생성하기 위해서는 단핵 전구체를 다핵 OC로 융합하는 것이 필요하기 때문에 OC 분화는 어려울 수 있다11. NF-κB 리간드의 수용체 활성제(RANKL) 및 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF)와 같은 여러 생물학적 요인이 OC 분화에 필요합니다. M-CSF는 세포 증식, 세포 생존 및 RANK 발현 12,13,14에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 보고되었습니다. 반면에 RANKL은 RANK에 결합하여 골쇄골 형성을 유도하는 다운스트림 신호 캐스케이드를 활성화합니다. 활성화는 TNF 수용체 관련 인자 6 (TRAF6)을 통해 매개되며, 이는 B 세포 억제제, 알파 (IκB-α), NF-kB 이량체16,17에 결합하는 결합 단백질에서 카파 광 폴리펩티드 유전자 인핸서의 핵 인자의 분해를 유도합니다. 따라서 IκB-α 분해는 NF-kB 이량체를 방출하고, 이 이량체는 핵으로 전위되어 전사 인자 c-Fos 및 활성화된 T 세포의 핵 인자 1(NFATc1)의 발현을 유도합니다. 이것은 차례로 다수의 OC 분화 관련 단백질15,18의 전사를 유발합니다. DC-Stamp 및 Atp6v0d2와 같은 상향 조절 단백질은 OC 전구체의 세포-세포 융합을 매개하여 세포융합 형성을 유도합니다 19,20,21.
인간 일차 세포와 관련하여 CD34+ 및 CD14+ PBMC는 현재 OC22로 분화하는 데 가장 널리 사용되는 세포 유형입니다. 그러나, 이러한 접근법은 공여체23으로부터 수확된 세포의 CD34+ 집단 내의 이질성 및 이들의 제한된 확장성에 의해 제한된다. 인간 iPSC는 OC에 대한 대체 소스를 제공합니다. 24 무한정 전파 될 수 있기 때문에 OC 생산의 확장 가능성과 업스케일링이 가능합니다. 이를 통해 많은 수의 OC를 구별할 수 있어 OC 연구를 용이하게 할 수 있습니다.
iPSC를 OC로 분화하기 위한 몇 가지 프로토콜이 발표되었습니다 25,26,27. 전체 분화 과정은 iPSC 증식 부분, 중배엽 및 조혈 분화 부분, OC 분화로 나눌 수 있습니다. 분화 공정 전에 iPSC를 전파하면 분화 전에 OC 생산을 업스케일링할 수 있습니다. 중배엽 및 조혈 분화에 관한 몇 가지 접근법이 존재합니다. 전통적으로 배아체(EB) 형성은 조혈 세포를 분화하는 데 사용되어 왔지만, 단층 기반 접근법은 EB 유도가 필요하지 않은 또 다른 조혈 분화 전략입니다. 그럼에도 불구하고 단층 기반 시스템은 EB 기반 접근 방식이 OC의 차별화에 더 강력하다는 것을 발견했기 때문에 추가 최적화가 필요한 것으로 보입니다.
여기서는 EB 기반 프로토콜을 사용하여 OC와 인간 iPSC의 차이점을 설명합니다. 이 프로토콜은 Rössler et al.26 에서 채택되었으며 분화 과정에서 견고성을 높이고 동결 보존을 허용하도록 수정되었습니다. 첫째, 조혈 세포는 분화 10일 후 한 번만 채취했습니다. 그런 다음 조혈 세포를 동결 보존하여 분화 과정에서 더 많은 유연성을 허용했습니다. 또한 OC 분화를 위해 조혈 세포 파종 밀도를 1 x 105 에서 2 x 105 cells/cm2 로 늘렸습니다. 보다 최근의 인간 iPSC 무혈청 배지(hiPSC-SFM, 재료 표 참조)를 사용하고, 0.1% 젤라틴 대신 200-300μg/mL의 기저막 추출물( 재료 표 참조)로 웰 코팅을 수행했습니다. 페니실린/스트렙토마이신은 배지에 첨가되지 않았습니다.
Rössler et al.26에 의한 프로토콜은 원래 iPSC에서 조혈 분화를 위해 EB 형성을 사용하는 대식세포 분화 프로토콜(28)로 조정되었습니다. EB 형성은 조혈 분화를 위해 연구자들에 의해 오랜 시간 동안 사용되어 왔지만29,30, EB 유도의 여러 방법이 자발적 응집, 둥근 바닥 웰 플레이트에서의 원심분리, 행잉 드롭 배양, 생물 반응기 배양, 원추형 튜브 배양, 느린 회전 측면 용기 및 마이크로몰드 겔 배양31과 같은 여러 가지 방법이 문헌에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 둥근 바닥 웰 플레이트에서 해리된 iPSC의 원심분리를 사용하여 단일 iPSC 세포를 서로 근접하게 만들고 후술하는 바와 같이 구(EB) 형성을 허용합니다.
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Protocol
알림: 이 프로토콜에 사용된 모든 시약은 재료 표에서 찾을 수 있습니다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 매체는 사용 전에 37°C로 사전 평형을 이뤘습니다. 모든 원심분리 단계는 37°C에서 가장 느린 가속/감속 모드를 사용하여 수행됩니다. 달리 명시되지 않는 한, 상층액은 항상 일회용 파스퇴르 유리 피펫을 사용하여 제거됩니다.
1. 인간 iPSC의 해동 및 전파
- iPSC를 해동하기 하루 전에 6웰 플레이트의 웰에 200-300μg/mL 농도의 기저막 추출물 1mL를 코팅합니다. 웰 플레이트를 4°C에서 밤새 놓습니다.
- 다음날 세포를 해동하고 P1000 피펫을 사용하여 15mL 튜브에 옮깁니다. 적하하여 15mM HEPES와 함께 5-7mL의 DMEM/F-12를 추가합니다.
- 세포를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리기에서 세포를 부드럽게 제거하고 세포 펠릿을 방해하지 않도록 하십시오.
- 파스퇴르 유리 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하고 넓은 보어 팁이 있는 P1000을 사용하여 1mL의 hiPSC-serum free 배지(10μM의 Rho kinase(ROCK) 억제제 Y-27632를 함유한 hiPSC-SFM)에 세포를 재현탁시킵니다.
- 전날 코팅된 웰에서 기저막 추출물을 흡인하고(단계 1.1) 10μM Y-27632가 포함된 hiPSC-SFM 1mL를 웰에 전달합니다. 재현탁된 iPSC를 웰에 추가하여 웰당 최종 부피 2mL에 도달합니다.
- 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에 넣기 전에 플레이트를 소용돌이쳐 iPSC 응집체를 고르게 분포시킵니다.
- hiPSC-SFM을 사용하여 격일로 전체 배지 변화를 수행합니다(ROCK 억제제 Y-27632 추가 없이). iPSC는 일반적으로 전파 3-4일 후에 70-80%의 밀도에 도달합니다.
2. iPSC 통과
- iPSC를 통과시키기 하루 전, 200-300μg/mL 농도의 기저막 추출물로 6웰 플레이트의 웰을 코팅합니다. 웰 플레이트를 4°C에서 밤새 놓습니다.
알림: 세포가 약 70-80% 밀도에 도달했는지 확인합니다. iPSC가 과밀화(80% 이상의 밀도)를 얻지 않도록 하면 자발적인 분화가 촉진됩니다. - 10 μL 또는 20 μL 피펫 팁 또는 셀 스크레이퍼를 사용하여 실체현미경 아래에서 분화된 영역 또는 죽은 iPSC 응집체가 많은 영역을 제거하여 iPSC의 패시에이징을 시작합니다. 분화된 영역은 색상이 더 짙거나 더 하얗게 나타납니다.
알림: 긁어낸 세포 응집체는 여전히 웰 바닥에 부분적으로 부착될 수 있습니다. - 넓은 보어 P1000 피펫으로 웰 바닥을 여러 번 세척하여 웰 바닥에 부분적으로 부착되어 있을 수 있는 골재를 제거합니다.
- 분리된 iPSC 응집체를 포함하는 iPSC가 배양된 사용된 배지는 폐기하십시오. 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척 단계를 두 번 더 반복합니다.
- 다음으로, 웰당 1mL의 5U/mL Dispase를 추가합니다. iPSC 콜로니의 가장자리는 웰 플레이트에서 들어 올려지며, 이는 실온에서 3-5분 배양 후 실체현미경으로 관찰할 수 있습니다.
- 약간 분리된 응집체가 빠지지 않도록 Dispase를 조심스럽게 제거하고 15mM HEPES와 함께 1mL의 DMEM/F-12를 추가합니다. 일회용 셀 리프터를 사용하여 골재를 작은 크기로 자릅니다. iPSC 응집체 크기의 일관성은 줄기 세포 통과 도구를 사용하여 개선할 수 있습니다.
- 웰의 배지로 얇게 썬 iPSC 응집체를 씻어내고 5mL 혈청학적 피펫 또는 넓은 보어 팁이 있는 P1000을 사용하여 응집체와 함께 배지를 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
- DMEM/F-12로 웰을 헹구고 iPSC 응집체가 있는 배지를 15mL 튜브로 옮깁니다.
- 얇게 썬 iPSC 응집체를 200 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 파스퇴르 유리 피펫으로 상층액을 제거하고 2mL의 hiPSC-SFM을 추가하여 5mL 혈청학적 피펫 또는 넓은 보어 팁이 있는 P1000을 사용하여 iPSC를 제거 및 재현탁합니다.
- 사전 코팅된 웰 플레이트에서 남은 기저막 추출물을 흡인하고 6웰 플레이트의 각 웰에 1mL의 hiPSC-SFM을 추가합니다.
- 넓은 보어 팁이 있는 P1000을 사용하여 최종 부피가 웰당 2mL의 hiPSC-SFM이 되도록 iPSC를 6웰 플레이트의 새 웰로 옮깁니다. iPSC 라인에 따라 분할 비율을 최적화해야 합니다. 여기서는 1:6 분할 비율이 사용되었습니다.
- 실체현미경으로 부유 골재와 응집체 크기에 대한 웰을 확인하십시오. 이상적으로 응집체 크기는 50-200μm 사이여야 합니다.
- 응집체를 옮긴 후 웰 플레이트를 소용돌이쳐 플레이트 전체에 세포를 고르게 분포시키고 37°C에서 5% CO2 에서 70-80% 밀도가 될 때까지 배양합니다.
3. iPSC 동결
- iPSC 세포를 다시 동결하기 위해, 위에서 설명한 바와 같이 통과 세포(프로토콜 단계 "2. iPSC의 패세이징"). 세포를 콜로니로 자르고 웰 바닥에서 씻어낸 후(2.10단계) 슬라이스된 응집체를 200 x g 에서 3분 동안 회전시킵니다. 상층액을 흡인합니다.
- 6웰 플레이트의 웰당 1mL의 무혈청 동결 보존 배지를 15mL 튜브에 추가하고 보어 팁이 넓은 P1000을 사용하여 슬라이스된 응집체를 재현탁합니다.
- 세포를 사전 표지된 cryotube로 옮깁니다. 튜브를 닫고 튜브를 4°C에서 미리 냉각된 냉동 보존 용기로 옮깁니다. -80°C에서 24-48시간 동안 셀을 보관하십시오.
- 장기 보관을 위해 극저온을 액체 질소로 옮깁니다.
참고: OC 차별화 프로세스의 개략적인 요약은 그림 1에 나와 있습니다.
4. 배아체 유도
- EB 유도를 위해 위에서 설명한 대로 충분한 iPSC를 배양하고 확장합니다.
참고: OC 생산은 배아체의 수를 증가시킴으로써 증가할 수 있으며, 이는 차례로 조혈 세포의 전반적인 더 높은 수율을 생성합니다. 70-80% 융합 iPSC의 웰 1개는 6웰 플레이트 웰의 웰당 약 8.4 x 105 세포를 산출합니다. 하나의 배아체를 형성하기 위해서는 12,500개의 단세포 iPSC가 필요합니다. - iPSC 배양물에서 사용한 배지를 흡인하고 iPSC 콜로니를 D-PBS로 헹굽니다.
- 실온으로 예열된 0.5mL의 단일 세포 해리 시약을 6웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 배양 용기를 소용돌이쳐 전체 웰 표면을 코팅합니다. 배양 용기를 37°C에서 5-8분 동안 배양합니다.
- 인큐베이터에서 용기를 꺼내고, 단세포 해리 시약을 흡인하고, 50ng/mL 인간 뼈 형태 형성 단백질 4(hBMP4), 50ng/mL 인간 혈관 내피 성장 인자-165(hVEGF), 20ng/mL 인간 줄기 세포 인자(hSCF)가 포함된 hiPSC-혈청이 없는 배지로 구성된 1단계 분화 배지 1mL를 웰에 추가합니다. 및 10μM Y-27632.
- Stage 1 배지로 웰을 헹구어 세포를 부드럽게 분리합니다. 해리된 iPSC를 15mL 코니컬 튜브에 풀링합니다.
- 1단계 분화 배지 1mL를 웰에 추가하고 남아 있는 세포를 씻어내거나 쉽게 씻겨 나가지 않는 콜로니에는 세포 스크레이퍼를 사용합니다.
- 모든 세포를 튜브로 옮긴 후 실온에서 200 ×g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 형성합니다. 5mL 혈청학적 피펫 또는 넓은 보어 팁이 있는 P1000을 사용하여 총 2mL의 사전 평형화된 Stage 1 분화 배지에서 세포를 흡입하고 재현탁합니다.
- 혈구계 또는 자동 세포 계수 장치를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 단일 세포 현탁액이 들어 있는 15mL 튜브에 배지를 추가하여 1단계 분화 배지 100μL의 둥근 바닥 초저 부착 96웰 플레이트에 웰당 12,500개의 세포를 플레이트합니다.
알림: 현미경에서 세포는 세포가 웰 전체에 분산되어 있는 단일 세포 현탁액으로 나타납니다. - 96웰 플레이트를 100 x g에서 3분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 세포는 현미경으로 볼 때 스페로이드와 비슷해지기 시작해야 합니다. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 24시간 동안 넣습니다.
- 1일차와 2일차에 배지의 절반을 1단계 분화 배지로 변경합니다. 효율성을 높이려면 멀티채널 피펫을 사용하여 사용한 Stage 1 분화 배지 50μL를 페트리 접시에 폐기합니다.
- 96웰 플레이트에서 배지를 폐기한 후 실체현미경 아래에서 실수로 제거되었을 수 있는 EB가 있는지 확인합니다. 보어 팁이 넓은 P1000 피펫을 사용하여 실수로 제거한 EB를 96웰 플레이트로 옮깁니다.
- 50μL의 새로운 Stage 1 분화 배지를 멀티채널 피펫을 사용하여 둥근 바닥 초저 부착 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
5. 조혈 분화
- 조혈 분화를 시작하기 하루 전에 6웰 플레이트의 웰에 200-300μg/mL 농도의 기저막 추출물 1mL를 코팅합니다. 웰 플레이트를 4°C에서 밤새 놓습니다.
참고: 각 웰은 이 프로토콜의 이후 시점에서 8개의 EB를 수신합니다. 준비된 EB의 수에 따라 코트 웰이 그에 상응합니다. - 2mM 울트라글루타민, 55μM 2-메르캅토에탄올, 25ng/mL 인간 인터루킨 3(hIL-3) 및 100ng/mL 인간 대식세포 집락 자극 인자(hM-CSF)를 첨가한 조혈 기저 배지로 구성된 2단계 분화 배지 3mL로 과잉 기저막 추출물을 흡인하고 6웰 플레이트의 웰을 프리필합니다.
- 보어 팁이 넓은 P1000을 사용하여 8개의 EB를 6웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 옮긴 후 눈이나 실체현미경으로 각 웰에 8개의 EB가 있는지 확인합니다.
참고: 1일이 지나면 유동 EB가 유정 바닥에 부착됩니다. 다음 5-7일 안에 조혈 세포로 구성된 부유 세포 집단이 보일 것입니다. 조혈 분화 기간은 7일부터 다양할 수 있습니다. 10일 동안의 분화 결과, 큰 CD45+, CD14+ 및 CD11b+ 하위 집단으로 구성된 조혈 집단이 나타났습니다. - Stage 2 분화 배지로 5일 동안 처리한 후 사용한 배지를 제거하고 50mL 코니컬 튜브에 분주하여 배지 교체를 수행합니다. 피펫을 천천히 사용하여 가능한 한 적은 부유 세포를 제거하고 전단 응력을 가능한 한 낮게 유지합니다. 실체현미경으로 피펫팅하면 세포가 우발적으로 제거되는 것을 방지할 수 있습니다.
- 즉시 1mL의 신선한 Stage 2 분화 배지를 웰에 추가합니다. 분화 과정의 이 시점에서 이미 존재할 수 있는 부유 조혈 세포를 회수하려면 분배된 배지를 버리지 마십시오. 오히려, 사용한 배지로 튜브를 300 x g 에서 5분 동안 회전시키고 상층액을 흡인합니다.
- 새로운 Stage 2 분화 배지를 튜브에 추가하고 사용한 배지와 함께 옮겨졌을 수 있는 세포를 분리하기 위해 재현탁합니다.
- 회수된 세포와 함께 새로운 Stage 2 분화 배지 2mL를 이전에 Stage 2 분화 배지 1mL로 채웠던 각 웰에 추가합니다.
- 조혈 분화 10일차에 많은 수의 부유 조혈 세포가 있는지 확인합니다. 50mL 튜브에 모아 수확합니다. 10% DMSO, 50% FBS 및 40% 배지에서 다시 동결하거나 세포를 OC로 분화시키는 데 즉시 사용할 수 있습니다.
6. M-CSF 성숙 및 OC 분화
- 200,000 cells/cm2 농도의 세포를 조직 배양 처리된 웰 플레이트에 종자하고 10% FBS 및 50ng/mL hM-CSF가 보충된 alpha-MEM으로 처리합니다.
- 기능적 분석 또는 이미징을 수행하려면 파종 후 3일 후에 보어 팁이 넓은 P1000을 사용하여 미리 예열된 PBS로 37°C로 세척하여 M-CSF 성숙 세포를 분리합니다. 세포를 완전히 분리하려면 반복적인 세척 단계가 필요할 수 있습니다.
- 넓은 보어 팁이 있는 P1000과 300 x g 에서 5분 동안 원심분리기를 사용하여 분리된 세포를 15mL 튜브로 옮깁니다. 상층액을 버리십시오.
- 10% FBS, 50ng/mL hM-CSF 및 80ng/mL hRANKL이 보충된 alpha-MEM으로 구성된 OC 분화 배지로 세포 펠릿을 재현탁 및 용해시킵니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수 장치를 사용하여 세포를 계수하고 기능적 분석 또는 이미징(즉, 골흡수 분석, 이미징을 위한 커버슬립 슬라이드 등)에 적합한 배양기에서 200,00-250,000 cells/cm2 의 밀도로 M-CSF 성숙 세포를 다시 시드합니다.
- OC 분화 배지로 7-9일 동안 분화시킵니다. 2-3일마다 새로운 OC 분화 배지로 완전한 웰 배지 교체를 수행합니다.
참고: 다핵 OC는 일반적으로 5-7일 후에 나타납니다.
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Representative Results
분화 과정 전반에 걸친 세포 형태 모니터링
아래에 설명된 모든 결과는 OC 분화를 위해 MCND-TENS2 iPSC 라인을 사용하여 생성되었습니다. 이 iPSC 라인은 이전에 여러 연구에서 사용되었다32,33. 그럼에도 불구하고 다른 iPSC 라인도 이 차별화 프로토콜과 함께 성공적으로 사용되었습니다.
정기적인 육안 평가는 OC로의 분화 과정 전반에 걸쳐 iPSC의 다양하고 뚜렷한 형태학적 특성을 보여줍니다(그림 2). iPSC 콜로니(그림 2A)는 원심분리 전에 둥근 바닥 웰 플레이트 전체에 걸쳐 개별 세포로 나타나는 단일 세포 현탁액으로 해리되었습니다(그림 2B). 원심분리(프로토콜의 4.9단계) 후 세포는 둥근 바닥 초저 부착 웰 플레이트의 중앙에 모여 연속적으로 구를 형성합니다(배아체, EB, 그림 2C). EB는 중배엽 분화 과정 전반에 걸쳐 크기가 2-3배 증가하고(그림 2D) 4일간의 분화 기간이 끝나면 눈에 쉽게 보입니다(그림 2E). EB는 조혈 분화를 위해 6웰 플레이트의 웰로 이송된 후 웰 플레이트 바닥과 접착 및 융합되는 것을 볼 수 있습니다(프로토콜의 5.3단계, 그림 2F). 7-8일 후, 많은 양의 부유 조혈 세포가 배양 배지에서 볼 수 있게 됩니다(그림 2G). 조혈 세포를 수확하고 재도금한 후 M-CSF 성숙 단계가 이어지고 OC 분화가 시작됩니다(프로토콜의 6.4단계). 5-6일 이내에 크고 투명한 세포체를 가진 다핵 세포가 먼저 눈에 띄게 됩니다(그림 2H). 이 단계에서 많은 수의 단핵 세포가 여전히 보입니다. OC 분화가 2-3일 더 진행되면 OC는 인접 세포와 추가로 융합하여 더 많은 핵을 가진 큰 다원형을 형성합니다(그림 2I).
EB 유래 조혈 인구 평가
조혈 분화는 다양한 시간 동안 수행할 수 있습니다. 7일에서 최대 9주까지의 기간이 문헌에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜에서는 10일 동안 조혈 분화가 수행됩니다. 10일간의 조혈 분화에서 초기 CD34+ (0.53%, 그림 3A)의 수가 적고 중기 CD43+ (48.5%, 그림 3B)의 조혈 전구 세포가 더 많이 생성되는 것을 발견했습니다. 더욱 중요한 것은 충분한 양의 CD45+ (96.2%, 그림 3C), CD14+ (33%, 그림 3D) 및 CD11b+ (35.9%, 그림 3E) HPC가 10일의 처리 기간 후에 생성되어 OC로 더 많이 분화하는 데 성공했다는 것입니다. 그러나 조혈 분화를 위한 사이토카인 치료 기간(프로토콜의 5.4단계)은 적절한 양의 CD45+, CD14+ 및 CD11b+ 세포를 생성하기 위해 iPSC 라인에 따라 조정 및 최적화되어야 할 수 있습니다.
평균적으로 600만 개의 조혈 세포가 8개의 EB로 각 웰에서 10일 동안 분화된 후 수확되었습니다.
OC 형태 및 활성 평가
OC 분화 후 OC를 형태학적, 기능적으로 평가할 수 있습니다. OC 전구체는 M-CSF 성숙 단계 후 챔버 슬라이드 또는 커버슬립 슬라이드에 다시 파종되어 TRAP 또는 Cathepsin K에 대한 염색 시 이미지 품질을 개선합니다. OC 분화 후 효소 TRAP 염색은 큰 다핵 TRAP 양성 OC를 보여줍니다(그림 4A). 또한, 약간 TRAP 양성 단핵 세포가 다핵 OC 사이에 산재되어 있는 것을 볼 수 있습니다. RANKL을 추가하지 않은 음성 대조군은 융합된 다핵 OC를 표시하지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 소수의 약간 TRAP 양성 단핵 세포를 묘사할 수 있습니다(그림 4B).
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM) 이미지는 DAPI 핵 염색(파란색)과 함께 Cathepsin K(청록색) 및 F-액틴(빨간색)에 대해 염색된 OC를 보여줍니다(그림 4C, 4D). 프로토콜에 따라 RANKL로 처리할 때 대형 다핵 OC를 볼 수 있으며, 이는 광범위한 F-액틴 세포골격 구조와 Cathepsin K에 대한 양성 염색을 나타냅니다(그림 4C). 반면에 RANKL을 추가하지 않은 음성 대조군은 융합된 다핵 전지를 나타내지 않습니다.
OC는 흡수 활성을 측정하여 기능적으로 추가로 평가할 수 있습니다. 뼈 또는 미네랄 흡수 분석은 흡수 활성을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서 OC 전구체를 인산칼슘으로 코팅된 웰에 파종하고 말단으로 분화했습니다. 미네랄 코팅이 재흡수된 넓은 영역은 청회색으로 보입니다(그림 4E). 다양한 크기의 흡착 피트를 식별할 수 있습니다. 재흡수되지 않은 나머지 인산칼슘 코팅은 갈색으로 보입니다. 흡수 구덩이의 존재는 분화된 다핵 세포의 정체를 OC로 확인합니다. 또한 흡수 활성을 평가하고 비교하기 위해 흡수 피트를 추가로 정량화할 수 있습니다. 전체 우물 표면적에 대한 재흡수된 광물의 총 면적은 백분율 측정으로 정량화할 수 있습니다. 또한 흡수 피트의 크기와 수를 추가로 정량화할 수 있습니다. 치료되지 않은 음성 대조군은 흡수 구덩이를 나타내지 않았습니다(그림 4F).
그림 1: 인간 iPSC와의 파골세포 분화 과정을 도식적으로 나타낸 그림. Hannah Blümke가 Affinity Designer 2.1.1을 사용하여 그린 그림입니다. 도면은 이전에 사용된 도면(33)을 활용한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 파골세포에 대한 인간 iPSC의 분화 과정 전반에 걸친 현미경 이미지. (A) 전파 전반에 걸친 미분화 iPSC 콜로니. (B) 원심분리 전에 단일 세포 현탁액으로 해리된 후 둥근 바닥 웰의 iPSC. (C) 원심분리 후 중앙에서 수집된 단일 세포 iPSC. (D) EB는 4일간의 중배엽 분화 기간 동안 크기가 커집니다. (E) 중배엽 분화에 따른 눈에 보이는 배아체. (F) 배아체를 기저막 추출물로 코팅된 6-웰 플레이트로 옮긴 후, 배아체가 웰 바닥과 부착 및 융합되는 것을 볼 수 있습니다. (G) 조혈 분화 5-7일 후, 배지에서 많은 수의 부유 조혈 세포를 관찰할 수 있습니다. (H) M-CSF 성숙 후, 3-4개의 핵을 가진 첫 번째 파골세포는 RANKL로 분화한 지 5-7일 후에 나타납니다. (I) 파골세포 분화가 끝나면 큰 다핵 세포를 관찰할 수 있습니다. 스케일 바: A, D, F, G = 200 μm, B, C, H, I = 50 μm, E = 1 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 유세포 분석을 사용한 배아체 유래 조혈 세포의 표면 마커 분석. 마커 발현을 통해 조혈 세포를 분석하고 단일항 및 살아있는 세포에 대한 게이팅 후 하위 집단을 식별할 수 있습니다. (A) 온토유전학적으로 초기 CD34+ 조혈 전구 세포 집단은 이 프로토콜과 함께 매우 적거나 결핍되어 있습니다. (B) CD43+ 세포는 전체 인구의 약 50%를 차지합니다. (C) 후기 CD45+ 조혈 전구 세포는 조혈 인구의 96.2%로 가장 큰 부분을 차지합니다. (디, 마) 보다 직접적인 CD14+ 및 CD11b+ OC 전구체는 각각 33%와 36%를 차지합니다. 빨간색: 염색되지 않은 음성 대조군, 파란색: isotype 대조군, 노란색: 각 마커 항체로 염색된 세포. 플롯은 이전에 발표된 데이터를 사용합니다33. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: iPSC 분화 인간 파골세포의 형태학적 및 기능적 평가. (A) 파골세포 분화 후 TRAP 염색은 크고 다핵화된 TRAP 양성 파골세포를 보여줍니다. 약간 TRAP 양성 단핵 세포는 다핵 파골세포 사이에 산재되어 있는 것을 볼 수 있습니다. (B) TRAP에 대해 염색된 RANKL을 추가하지 않은 음성 대조군은 융합된 다핵 파골세포를 나타내지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 소수의 약간 TRAP 양성인 단핵 세포를 묘사할 수 있다. (C) DAPI 핵 염색(파란색)과 함께 F-액틴(빨간색) 및 카텝신 K(청록색)로 염색된 커버슬립 슬라이드에서 파골세포 분화 조혈세포의 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 이미지는 큰 다핵 카텝신 K 양성 파골세포를 보여줍니다. (D) RANKL을 추가하지 않은 음성 대조군은 더 낮은 세포 밀도에서 (B) 단핵 전지와 유사하게 나타납니다. (E) 기능 평가는 파골세포의 흡수 활성을 평가하여 수행할 수 있습니다. 이를 위해 파골세포 분화는 뼈 또는 미네랄 흡수 분석에서 수행됩니다. 위상차 모드에서 도립 광시야 현미경으로 획득한 타일 웰 이미지는 인산칼슘 광물층의 넓은 흡수 영역을 보여줍니다. 흡수 활성은 전체 면적에 대한 흡수 면적을 측정하여 추가로 정량화할 수 있습니다. (F) RANKL을 추가하지 않은 음성 대조군은 흡수 영역을 표시하지 않습니다. 눈금 막대: A, B = 100 μm, C, D = 50 μm, E, F = 1 mm. 이미지는 이전에 발표된 데이터에서 편집되었다33. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 iPSC를 OC로 구별할 수 있는 신뢰할 수 있고 강력한 방법을 제공합니다. 그럼에도 불구하고 차별화 프로세스 전반에 걸쳐 발생할 수 있는 몇 가지 함정이 있습니다. 상이한 조직 기원의 세포로부터 생성된 인간 iPSC 라인은 이 프로토콜(33)을 사용하여 성공적으로 분화되었다. iPSC를 다시 동결할 때(프로토콜 단계 "3. Freezing back iPSCs"), passaging 지점의 웰 하나를 다시 하나의 cryovial로 얼렸습니다. 해동 시(프로토콜 단계 "1. 인간 iPSC의 해동 및 전파"), 하나의 극저온 이물질을 6웰 플레이트의 단일 웰로 해동했습니다. iPSC 라인에 따라 약간 다르게 작동하며 확산 속도도 다릅니다. 분할 비율은 그에 따라 조정되어야 합니다.
EB 유도를 위해 iPSC를 패시징하거나 iPSC를 단세포 현탁액으로 해리할 때, 중배엽 및 조혈 분화의 효과와 효율성을 개선하기 위해 자발적으로 분화된 콜로니 또는 죽은 세포의 응집체를 제거하는 것이 중요합니다. 이것은 셀 스크레이퍼, P10 또는 P20 피펫의 피펫 팁, 또는 파스퇴르 피펫(35)으로 제작된 스크래핑 도구를 사용하여 실체현미경으로 수행할 수 있습니다.
상술한 바와 같이, 이 프로토콜은 EB 유도를 위해 iPSC 콜로니를 단일세포 현탁액으로 해리시키는 것을 포함하며, 다른 프로토콜과 함께, iPSC는 EB 유도를 위해 원심분리될 응집체로 남는다(36). EB 크기, 세포 수, 모양 및 형태는 모두 분화에 영향을 미치는 것으로 보고되었습니다 37,38,39. 따라서, 우리는 단세포 현탁액으로의 해리가 원심분리 후 크기와 모양에서 더 나은 EB-to-EB 균일성을 허용하고, 따라서 조혈 세포 생산의 보다 일관된 결과를 허용한다는 가설을 세웠다31.
EB 유도를 위한 다른 방법들이 설명되었다. 세포 생존을 향상시키기 위해 ROCK 억제제와 함께 단일세포 현탁액을 사용하는 이러한 방법은 EB 크기 및 분화 결과를 조절하는데 유리한 것으로 보고되었다31.
이 프로토콜에 설명된 둥근 바닥 96웰 플레이트 EB 유도 방법은 EB의 대규모 생산에 적합하며 OC 생산의 업스케일링을 허용합니다. 분화 과정을 촉진할 수 있는 잠재력을 가진 배아체 유도 단계 없이 조혈 분화를 위한 보다 새로운 방법이 최근에 기술되었다32. 그럼에도 불구하고, 이들 프로토콜은 OC 분화(33)를 위해 아직 확립되지 않았다.
위에서 언급한 프로토콜에서는 조혈 분화 5일차의 배지 변화를 설명합니다. 소수의 부유 세포는 분화 4-5일차에 이미 나타날 수 있습니다. 부유 전지가 폐기되는 것을 방지하기 위해 배지를 튜브에 수집하고 폐기하기 전에 원심 분리해야 합니다. 그런 다음 튜브 바닥의 세포 펠릿을 신선한 배지로 제거하고 6웰 플레이트의 웰로 다시 옮겨야 합니다. 그러나 OC 분화에서 초기 부유 세포 집단의 중요성은 여전히 결정되어야 합니다.
조혈 세포의 생산은 유세포 분석을 사용하여 평가할 수 있습니다. CD45+, CD14+ 및 CD11b+ 세포의 높은 수율은 파골세포 분화에 바람직하다33. 채취된 부유 조혈 세포의 냉동 보존은 일반적으로 제한된 회수율과 낮은 세포 생존율로 인해 어려운 것으로 보고되었습니다40,41. 무혈청 조혈 세포 확장 배지 50%(재료 표 참조), 40% FBS 및 10% DMSO로 구성된 동결 보존 배지에서 조혈 세포를 냉동 보존함으로써 해동 후 약 90.3%± 2.62 SD(n = 7)의 세포 생존율로 세포를 회수할 수 있었습니다.
골쇄골 형성은 미네랄 및 뼈 흡수가 가능한 다핵 파골세포를 형성하기 위해 여러 단핵 OC 전구체의 융합을 필요로 합니다. 뮤린 OC-전구체 세포주는 단순히 OC 형성을 유도하기 위해 RANKL의 첨가를 필요로 하는 반면(42), 인간 전구체는 세포 생존 및 증식을 위해 추가적인 M-CSF를 필요로 한다(43). OSCAR는 OC 감별법에서 포함된 추가 수용체로 최근에 발견되었습니다, 비록 유형 I 교원질만 리간드로 지금까지 확인되었더라도. iPSC-유래 OC를 이용한 OSCAR에 대한 연구는 여전히 제한적이지만, 쥐 세포주에서 초생리학적 in vitro RANKL 및 M-CSF 농도는 OSCAR 활성화(44)의 필요성을 우회하는 것으로 보이며, in vivo 에서 OSCAR의 활성화는 골쇄골 형성(osteoclastogenesis)45에 필요한 costimulatory 신호인 것으로 보인다. 고려해야 할 추가 요소는 웰 플레이트 표면입니다. 화학적46 및 물리적47 표면 특성은 파골세포 분화에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며 성공적인 분화를 촉진하거나 방해할 수 있습니다. 전구체 집단 내의 특정 이질성은 또한 OC의 성공적인 융합에 중요한 것으로 보이는데, 이는 CD47 및 DC-STAMP와 같은 상이한 융합 관련 인자들이 파골세포 융합(48)의 상이한 단계에서 작용하기 때문이다.
결론적으로, 이 프로토콜은 인간 OC와 iPSC를 구별하여 OC 연구를 촉진하고 가속화할 수 있도록 합니다.
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Disclosures
저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
저자들은 Giachelli 연구소의 기술적인 도움과 지원에 감사를 표하고 싶습니다. 컨포칼 현미경 및 광시야 현미경 이미지를 얻는 데 도움을 주신 W. M. Keck Microscopy Center와 Keck Center 관리자인 Dr. Nathanial Peters에게 감사드립니다. 또한 기술 지원 및 도움을 주신 UW Flow Core Facility와 Flow Core Facility 관리자인 Aurelio Silvestroni에게도 감사드립니다. 마지막으로, 일러스트레이션과 그래픽 디자인을 지원해 주신 Hannah Blümke에게 감사드립니다.
자금은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 R35 HL139602-01을 통해 제공되었습니다. 또한 W. M. Keck Center의 기기 자금 지원을 위한 NIH S10 보조금 S10 OD016240와 UW Flow Core Facility의 기기 자금 조달을 위한 NIH 보조금 1S10OD024979-01A1을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-10ML | |
| Antibody - Anti-Cathepsin K | Abcam | ab19027 | |
| Antibody - APC-conjugated Anti-Human CD45 | BD | 555485 | |
| Antibody - APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | |
| Antibody - BV711-conjugated Anti-Human CD14 | BD | 563372 | |
| Antibody - BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD | 563125 | |
| Antibody - Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647 | Abcam | ab150079 | |
| Antibody - PE-conjugated Anti-Human CD14 | R&D Systems | FAB3832P-025 | |
| Antibody - PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11b | R&D Systems | FAB16991P-025 | |
| Antibody - PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34 | BD | 560710 | |
| Antibody - PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557872 | |
| Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11b | Biolegend | 301308 | |
| Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl | Biolegend | 400118 | |
| Antibody - PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 550795 | |
| Antibody - PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43 | BD | 563521 | |
| Bone Resorption Assay Kit | CosmoBioUSA | CSR-BRA-24KIT | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher | 16812556 | |
| Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract | R&D Sytems | 3434-010-02 | Basal membrane extract |
| DAPI | R&D Systems | 5748/10 | |
| Dispase (5 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Stem Cell | 36254 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537-500ML | |
| Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4) | STEMCELL Technologies | 78211 | |
| Human IL-3 | STEMCELL Technologies | 78146.1 | |
| Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF) | STEMCELL Technologies | 78150.1 | |
| Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL) | STEMCELL Technologies | 78214.1 | |
| Human Stem Cell Factor (hSCF) | STEMCELL Technologies | 78155.1 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | Biolegend | 422301 | |
| Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165) | STEMCELL Technologies | 78073 | |
| Invitrogen Rhodamine Phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| MEM α, nucleosides, no phenol red | ThermoFisher | 41061029 | |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 05855 | Serum free cryopreservation medium |
| mTeSR Plus medium | STEMCELL Technologies | 100-0276 | Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM) |
| Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 174925 | Round bottom ultra-low attachment 96-well plate |
| P1000 Wide Bore Tips | ThermoFisher | 2079GPK | |
| ROCK-Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| StemSpan SFEM | StemCell | 09650 | Hematopoietic cell culture medium |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher | 12563011 | Single-cell dissociation reagent |
| Ultraglutamine | Bioscience Lonza | BE17-605E/U1 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Bioscience Lonza | 04-418Q | Hematopoietic basal medium |
| µ-Slide 8 Well High | Ibidi | 80806 |
References
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