Article de méthode

Étude de la diaphonie entre les cellules endothéliales adipeuses adipeuses et les adipocytes dans le tissu adipeux sous-cutané humain

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DOI :

10.3791/66608

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5 avril 2024

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1Leeds Institute of Cardiovascular and Metabolic Medicine, University of Leeds

Dans cet article

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole pour isoler, cultiver et phénotyper des cellules endothéliales microvasculaires à partir de tissu adipeux sous-cutané humain (hSATMVECs). De plus, nous décrivons un modèle expérimental de diaphonie hSATMVEC-adipocyte.

Résumé

Les cellules endothéliales microvasculaires (MVEC) jouent de nombreux rôles essentiels, notamment le contrôle du tonus vasculaire, la régulation de la thrombose et l’angiogenèse. L’hétérogénéité significative du génotype et du phénotype des cellules endothéliales (CE) dépend de leur lit vasculaire et de l’état pathologique de l’hôte. La possibilité d’isoler les MVEC à partir de lits vasculaires spécifiques à des tissus spécifiques et de groupes de patients individuels offre la possibilité de comparer directement la fonction des MVEC dans différents états pathologiques. Ici, en utilisant du tissu adipeux sous-cutané (SAT) prélevé au moment de l’insertion de dispositifs électroniques implantables cardiaques (CIED), nous décrivons une méthode pour l’isolement d’une population pure de MVEC de tissu adipeux sous-cutané humain fonctionnel (hSATMVEC) et un modèle expérimental de diaphonie hSATMVEC-adipocyte.

Les hSATMVEC ont été isolés à la suite de la digestion enzymatique de SAT par incubation avec des billes magnétiques enrobées d’anticorps anti-CD31 et du passage à travers des colonnes magnétiques. Les hSATMVEC ont été cultivés et passés sur des plaques recouvertes de gélatine. Les expériences ont utilisé des cellules aux passages 2 à 4. Les cellules ont conservé les caractéristiques classiques de la morphologie EC au moins jusqu’au passage 5. L’évaluation par cytométrie en flux a montré une pureté de 99,5 % du hSATMVEC isolé, défini comme CD31+/CD144+/CD45-. Les hSATMVEC isolés chez les témoins ont eu un temps de doublement de la population d’environ 57 h, et la prolifération active a été confirmée à l’aide d’un kit d’imagerie de la prolifération cellulaire. La fonction isolée de hSATMVEC a été évaluée à l’aide de leur réponse à la stimulation de l’insuline et de leur potentiel de formation de tubes angiogéniques. Nous avons ensuite établi un modèle de co-culture hSATMVEC-adipocytes sous-cutanés pour étudier la diaphonie cellulaire et démontré un effet en aval de hSATMVEC sur la fonction adipocytaire.

hSATMVEC peut être isolé à partir de SAT prélevés au moment de l’insertion du CIED et sont d’une pureté suffisante pour phénotyper expérimentalement et étudier la diaphonie hSATMVEC-adipocyte.

Introduction

Les cellules endothéliales (CE) sont des cellules squameuses qui tapissent la surface interne de la paroi des vaisseaux sanguins sous forme de monocouche. Ils ont de nombreux rôles essentiels, notamment le contrôle du tonus vasculaire, la régulation de la thrombose, la modulation de la réponse inflammatoire et la contribution à l’angiogenèse1. Compte tenu de l’importance des cellules endothéliales dans la physiologie cardiométabolique, elles sont fréquemment utilisées à des fins expérimentales pour approfondir la compréhension de la physiopathologie et pour examiner de nouveaux traitements pharmacologiques des maladies cardiométaboliques.

Cependant, il existe une énorme hétérogénéité dans la morphologie, la fonction, l’expression des gènes et la composition de l’antigène des cellules endothéliales en fonction de l’origine de leur lit vasculaire2. Alors que les cellules endothéliales des grosses artères sont les mieux adaptées aux études d’athérosclérose, les cellules endothéliales des petits vaisseaux, appelées cellules endothéliales microvasculaires (MVEC), sont plus adaptées aux études d’angiogenèse2. La compréhension de la base moléculaire de l’hétérogénéité endothéliale peut fournir des informations précieuses sur les thérapies vasculaires spécifiques au lit. La fonction endothéliale microvasculaire diffère également de manière significative dans de nombreuses maladies, notamment le diabète, les maladies cardiovasculaires et les infections systémiques 3,4. Par conséquent, la capacité d’isoler des cellules endothéliales à partir de groupes de patients définis permet une comparaison directe de leur fonction cellulaire endothéliale et de la diaphonie cellulaire5.

Dans cet article, nous décrivons une nouvelle méthode d’isolement des MVEC humains à partir du tissu adipeux sous-cutané (hSATMVEC) prélevé au moment de l’insertion d’un dispositif électronique implantable cardiaque (CIED). Les isolats hSATMVEC suite à la digestion enzymatique de tissu adipeux sous-cutané (SAT) ont été cultivés et passés sur des plaques recouvertes de gélatine. Nous décrivons ensuite une gamme de tests de phénotypage qui ont été appliqués avec succès aux hSATMVECs afin de valider leur phénotype et de démontrer leur utilisation dans les tests de routine sur les cellules endothéliales. Enfin, nous décrivons une application des hSATMVECs dans un modèle expérimental de diaphonie hSATMVECs-adipocytes.

Protocole

Les échantillons de tissus humains utilisés dans la technique décrite ont été prélevés sur des patients subissant une insertion de CIED indiquée par les lignes directrices, conformément à la pratique clinique de routine, au Leeds Teaching Hospitals NHS Trust (Leeds, Royaume-Uni). Le protocole de l’étude, ainsi que toute la documentation, a été approuvé par le comité d’éthique local (11/YH/0291) avant l’inscription des participants. L’étude a été menée dans le respect des principes de la Déclaration d’Helsinki.

1. Population de patients

  1. Obtenez du tissu adipeux sous-cutané (SAT) frais lors de l’implantation CIED à partir du SAT recouvrant le muscle grand pectoral.
  2. Isolez les échantillons SAT dans des conditions stériles et manipulez les échantillons de tissus après le prélèvement dans une hotte à flux laminaire dans des conditions aseptiques strictes pour éviter la contamination bactérienne.

2. Isolement et culture de cellules endothéliales

REMARQUE : La Figure 1 présente un schéma d’isolement hSATMVEC.

  1. Pour l’isolement du hSATMVEC, utilisez un minimum de 250 mg de tissu adipeux sous-cutané (SAT) frais obtenu lors de l’implantation du CIED à partir d’un SAT recouvrant le muscle grand pectoral (voir Figure 1).
    REMARQUE : L’utilisation de plus grandes quantités de SATMVEC frais augmente le rendement de hSATMVEC pendant l’isolement et présente les meilleures chances de réussite de l’isolement et de la culture de hSATMVEC.
  2. Placez immédiatement SAT dans une solution de stockage de tissus de tri cellulaire activé magnétique (MACS) glacée dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL avant de le transférer au laboratoire.
    REMARQUE : Pour avoir les meilleures chances de réussite de l’isolement, l’isolement hSATMVEC doit être effectué dès que possible. Cependant, le SAT peut être stocké jusqu’à 24 heures sur la glace avant d’être isolé si nécessaire.
  3. Préparez une solution de travail de collagénase/dispase de 1 mg/mL comme suit.
    1. Tout d’abord, reconstituer 500 mg de poudre lyophilisée de collagénase/dispase dans 5 mL d’eau stérile pour former une solution mère de collagénase/dispase à une concentration de 100 mg/mL.
    2. Pour chaque isolement hSATMVEC, diluer 100 μL de solution mère de collagénase/dispase dans 10 mL de solution de sel équilibré Hanks' froid pour obtenir une solution de travail de 1 mg/mL.
  4. Dans une armoire à flux laminaire, à l’aide de deux scalpels, hacher les tissus en3 morceaux de ~1 mm dans 500 μL de solution de collagénase/dispase à 1 mg/mL sur le couvercle d’une boîte de Pétri, triturer et transférer dans un tube à centrifuger propre de 50 mL.
  5. Lavez le couvercle de la boîte de Pétri avec 4,5 ml de solution fraîche de collagénase/dispase à 1 mg/ml et ajoutez-la dans le tube à centrifuger de 50 ml. Laisser digérer 30 min à 37 °C dans un rotateur tubulaire à 20 tr/min. Arrêtez le processus de digestion en ajoutant 10 ml de substrat de croissance EC complet MV.
  6. Triturez le mélange digéré et passez-le dans un tamis à cellules de 70 μm. Rincer le tamis avec 10 ml de tampon d’albumine sérique saline - bovine tamponnée à 0,5 % de phosphate. Centrifuger l’échantillon à 300 x g pendant 10 minutes à température ambiante et jeter le surnageant. Répétez cette étape avec 5 ml supplémentaires de PBS-BSA à 0,5 %.
  7. Ensuite, retirez les cellules mortes à l’aide d’un kit d’élimination des cellules mortes. Pour ce faire, incubez la pastille de cellule dans 200 μL de billes d’élimination des cellules mortes (vortex avant utilisation) pendant 15 min à température ambiante (RT) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
  8. Fixez une colonne LS avec un filtre de 30 μm à l’aimant séparateur et placez un tube de centrifugation de 15 ml en dessous. Lavez une fois la colonne magnétique avec 1 mL de tampon de liaison pour l’élimination des cellules mortes avant d’ajouter la suspension d’échantillon/bille et laissez-la passer passivement sous l’effet de la gravité.
  9. Ensuite, lavez la colonne en ajoutant 0,5 ml de tampon de liaison et laissez-le passer passivement à travers la colonne. Répétez ce lavage quatre fois.
  10. Prélever l’éluat sous forme de fraction de cellules vivantes, faire tourner les cellules à 300 x g à RT pendant 10 min, puis laver et remettre en suspension la pastille obtenue dans 400 μL de PBS-BSA à 0,5 %.
  11. Ajouter 20 μL de billes magnétiques enrobées d’anti-CD31 dans les cellules suspendues et incuber pendant 20 min à 4 °C. Après l’incubation, centrifuger l’échantillon à 300 x g pendant 5 min à RT et jeter le surnageant. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 μL de PBS-BSA à 0,5 %.
  12. Fixez une colonne MS avec un filtre de 30 μm à l’aimant séparateur et placez un tube de centrifugation de 15 ml en dessous. Amorcez la colonne avec 500 μL de PBS-BSA à 0,5 %. Répétez cette étape deux fois.
  13. Ajoutez la suspension cellule-microbille et laissez-la passer sous l’effet de la gravité. Lavez trois fois la colonne avec 500 μL de PBS-BSA à 0,5 %. Le flux dans le tube de centrifugation sous la colonne contient la fraction CD31- .
  14. Pour recueillir la fraction CD31+ (c’est-à-dire la fraction contenant des hSATMVEC), retirez la colonne MS de l’aimant du séparateur et placez-la dans un tube à centrifuger neuf de 15 mL. Ajouter 1 mL de PBS-BSA à 0,5 % et, en une seule action douce, appliquer le piston de la colonne pour libérer les hSATMVEC capturés.
  15. Centrifuger l’échantillon à 300 x g pendant 5 min à RT et jeter le surnageant. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 1 mL de milieu de croissance EC complet MV et répartir la solution cellulaire de 1 mL entre un ou deux puits (selon la taille de la pastille) d’une plaque à 24 puits recouverte de gélatine à 2 % (passage 0).
    REMARQUE : Ne vous inquiétez pas s’il y a peu de cellules adhérentes dans les premiers jours suivant l’isolement.
  16. Changez de support tous les 3 jours. Cellules de culture à 37 °C avec 5% de CO2. Une fois que les cellules isolées atteignent ~80% de confluence (2-4 semaines), passez-les sur un seul puits d’une plaque à six puits (passage 1).
    REMARQUE : Les passages subséquents peuvent replacer les cellules d’un puits donneur confluent vers les puits récepteurs. Des expériences ont été réalisées sur des cellules de génération de passage 2 à 4 après que les cellules aient démontré une pureté de >99% par cytométrie en flux (voir rubrique 3). Les cellules ont conservé la morphologie endothéliale typique au moins jusqu’au passage 5.

3. Cytométrie en flux

  1. Avant la cytométrie en flux, vérifiez visuellement les hSATMVECs pour vous assurer qu’ils semblaient confluents et morphologiquement représentatifs. Effectuer une évaluation par cytométrie en flux des hSATMVECs au passage 2, en utilisant des cellules provenant d’un seul puits d’une plaque à 6 puits.
  2. Lavez les cellules deux fois avec du PBS en ajoutant bien 500 μL de PBS et en aspirant à chaque fois. Ensuite, ajoutez 300 μL/puits de solution chaude de trypsine/EDTA (0,25 %). Incuber à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 2 min.
  3. Une fois détaché, neutraliser la solution de trypsine/EDTA avec 700 μL de milieu de croissance EC complet MV et transférer dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
  4. Centrifuger la suspension cellulaire à 400 x g pendant 8 min à RT. Jeter le surnageant sans déranger la pastille. Ensuite, mettez la pastille de cellule en suspension dans un tampon MACS de 1 mL et répartissez-la entre deux tubes de microcentrifugation de 1,5 mL étiquetés témoin non coloré et échantillon coloré (500 μL par puits).
  5. Ajouter 500 μL supplémentaires de tampon MACS dans chaque tube de microcentrifugation, avant de centrifuger à nouveau à 400 x g pendant 8 min à RT.
  6. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 μL de tampon MACS pour un contrôle non coloré et un cocktail de coloration de 100 μL (tableau supplémentaire 1) pour l’échantillon coloré. Colorer les cellules avec CD45-FITC (le marqueur pan-leucocytaire), ainsi que CD144-PE et CD31-PerCP (qui sont exprimés par les cellules endothéliales).
  7. Agiter brièvement les cellules en suspension pendant 5 s, puis incuber à 4 °C pendant 10 min. Ensuite, ajoutez 1 ml de tampon MACS dans chaque tube, centrifugez à nouveau à 400 x g pendant 8 min à RT et jetez le surnageant.
  8. Enfin, mettez la pastille de cellule en suspension dans 500 μL de tampon MACS et transférez-la dans un tube de microcentrifugation frais de 1,5 mL. Placez le tube étiqueté dans une glacière couverte prête à être analysée.
    REMARQUE : Toutes les analyses de cytométrie en flux incluses ont été effectuées sur un système de cytomètre en flux Beckman Coulter Cytoflex à 4 lasers (en utilisant uniquement le laser d’excitation de 488 nm).
  9. Réglez la longueur d’onde d’émission maximale et le filtre pour chaque fluorochome comme suit : CD45-FITC - émission maximale 520 nm, filtre 525/50 ; CD144-PE - émission maximale 578 nm, filtre 585/40 ; CD31-PerCP - émission maximale 675 nm, filtre 655-730.
  10. Comme l’illustre la figure 2, enregistrez les données de 10 000 cellules par échantillon dans une porte singulet (P2). Vérifiez que P1 entoure un amas de cellules majeur et que la plupart de ces cellules se trouvent dans la porte singulet P2. S’assurer que le témoin non coloré a un minimum de cellules CD45-CD144+CD31+ en pourcentage de singulets.
  11. Enregistrer le pourcentage de singlets de cellules CD45-CD144+CD31+ dans l’échantillon coloré.

4. Temps de doublement des cellules endothéliales et prolifération cellulaire (Figure 3)

  1. Aux passages 2 et 3, comptez le nombre de hSATMVEC viables pour chaque échantillon à l’aide de l’hémocytométrie. Notez la date et l’heure de chaque comptage cellulaire.
  2. Calculez le nombre de doublements de population entre ces points selon l’équation : temps de doublement = (durée x log(2))/(log (concentration finale)-log(concentration initiale)).
    REMARQUE : Un calculateur en ligne est disponible à https://doubling-time.com/compute.php.
  3. Évaluez la prolifération des hSATMVECs à l’aide d’un kit d’imagerie de la prolifération cellulaire disponible dans le commerce. Semez les hSATMVECs à une densité de 20 000 cellules par puits dans une plaque de 24 puits et laissez-les passer la nuit dans un milieu de croissance EC complet MV pour récupérer.
  4. Le lendemain, ajouter la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) dans chaque puits dilué dans un milieu de croissance EC complet MV à une concentration finale de 10 μM. Incuber à 37 °C (5 % CO2) pendant 2 h.
  5. Retirez le support contenant de l’EdU et lavez bien chaque puits deux fois avec du PBS. Fixez les cellules avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 minutes à RT. Lavez chaque puits deux fois avec du PBS et ajoutez 500 μL de Triton X-100 à 0,5 % dans un tampon salin tris-tamponné (TBS). Laisser incuber à RT pendant 20 min.
    REMARQUE : Cela perméabilise la membrane cellulaire, permettant l’entrée de l’azoture marqué au fluor Alexa 488 dans la cellule.
  6. Préparez le cocktail azoté étiqueté Alexa fluor 488 selon les instructions du fabricant, en fonction du nombre de puits (voir6). Lavez chaque puits deux fois avec du PBS avant d’ajouter 100 μL de cocktail azoté marqué Alexa fluor 488 et incubez pendant 30 min à RT à l’abri de la lumière.
    REMARQUE : Le cocktail azoté étiqueté Alexa fluor 488 réagit avec l’EdU dans une réaction de clic.
  7. Retirez le cocktail azoté étiqueté Alexa fluor 488 et lavez-le deux fois avec du PBS. Ajouter 500 μL d’iodure de propidium par puits et incuber pendant 20 min à RT.
    REMARQUE : Cette étape permet de contre-colorer les noyaux (proliférants et non proliférants) en rouge.
    Retirez l’iodure de propidium, lavez deux fois avec du PBS et laissez chaque puits dans 500 μL de PBS pour l’imagerie.
  8. Imagez chaque puits dans 4 champs de haute puissance à un grossissement de 10x, avec une excitation/émission de 495/519 nm pour l’azoture de 488 nm (voir Figure 3C).
    REMARQUE : Les images des figures ont été capturées à l’aide d’un système d’analyse de cellules vivantes à un grossissement de 10x avec un temps d’exposition de 800 ms.
  9. Compter le nombre de cellules en prolifération (vert) et exprimer en pourcentage (%) du nombre total de cellules dans chaque champ de forte puissance (moyenne de 4 régions par puits).

5. Formation du tube cellulaire endothélial

  1. Leave Matrigel (matrice de membrane basale ; BMM) à décongeler pendant la nuit sur de la glace. Le lendemain, avec la plaque sur la glace, ajoutez 160 μL de BMM dans chaque puits d’une plaque de 24 puits au besoin. Inclinez la plaque pour obtenir une couverture complète de chaque puits avec BMM. Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2 à prendre pendant la préparation des cellules.
  2. Ensemencer les hSATMVECs à 100 000 cellules (dans 1 mL de milieu) par puits. Pipette sur le côté du puits et prendre soin de pipeter lentement pour éviter que la matrice ne se détache. Incuber la plaque à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 4 h.
    REMARQUE : À ce stade, la plaque est prête à être imagée. L’imagerie de phase sur le système d’analyse de cellules vivantes à un grossissement de 10x a été utilisée dans 5 zones de puits différentes (voir Figure 3D).
  3. Comptez le nombre de tubes entiers dans chaque champ de haute puissance et calculez une valeur moyenne pour chaque échantillon.

6. Stimulation insulinique du hSATMVEC

  1. Culture hSATMVEC dans une plaque à 6 puits à 37 °C avec 5% de CO2. Une fois confluent, retirez le milieu de croissance des cellules endothéliales complet MV et lavez-le deux fois avec du PBS.
  2. Ajouter 500 μL de milieu de famine sérique (milieu de croissance des cellules endothéliales MV sans suppléments) dans chaque puits et laisser incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 4 h. Pendant ce temps, préparez des aliquotes de 500 μL de concentrations croissantes d’insuline (0-150 μM) préparées dans un milieu de famine sérique.
  3. Après avoir été privé de sérum pendant 4 h, retirez le milieu des puits, ajoutez 1 ml de milieu contenant de l’insuline (avec des concentrations croissantes) dans chaque puits et incubez pendant 10 min à 37 °C avec 5 % de CO2.
  4. Laver deux fois avec du PBS à froid avant d’ajouter 100 μL de tampon de lyse des protéines contenant des inhibiteurs de protéase et de phosphatase pour lyser les cellules pour les protéines. Quantifier la protéine à l’aide du dosage des BCA.
    REMARQUE : Dans l’expérience décrite ci-dessous, des lysats cellulaires ont été incubés pendant 30 minutes dans un bain de glace et centrifugés à 20 000 x g pendant 15 minutes. Avant l’électrophorèse, des échantillons de protéines ont été bouillis pour dénaturer les protéines à 95 °C pendant 5 min. Les protéines ont été résolues sur un gel de Bis-Tris NuPAGE 4-12 % et transférées sur une membrane de nitrocellulose. L’analyse par immunotransfert a été effectuée conformément aux protocoles standard à l’aide d’anticorps phosphoprotéiques et d’anticorps protéiques totaux pertinents (selon les instructions du fabricant). Un anticorps secondaire Ig/HRP approprié a été utilisé pour détecter l’anticorps primaire (selon les instructions du fabricant). Les niveaux de protéines ont été quantifiés à l’aide d’une densitométrie basée sur l’intensité des bandes de chaque échantillon. La ß-actine a été utilisée comme contrôle de la charge le cas échéant.

7. Mise en place d’une co-culture hSATMVEC-adipocytes (Figure 4)

REMARQUE : Dans les résultats ci-dessous, des préadipocytes sous-cutanés blancs humains disponibles dans le commerce au passage 2 provenant d’un seul donneur mâle caucasien ont été utilisés dans tous les dosages adipocytaires. Les préadipocytes ont d’abord été étendus à partir du flacon fourni par le fournisseur (passage 0) en douze cryoflacons contenant des milieux de congélation cryo-SFM (passage 1).

  1. Chaque plaque de co-culture de 24 puits nécessite un cryoflacon de préadipocytes (passage 1). Décongeler rapidement chaque flacon et chaque plaque dans une fiole T75 contenant de 12 à 15 mL de milieu chaud PGM-2 (contenant 10 % de FBS, 30 μg/mL de L-glutamine et 15 ng/mL de GA-1000 SingleQuots). Changer de média tous les 3 jours jusqu’à ce que 90% de confluent.
  2. Une fois que 90 % sont confluents, laver les préadipocytes sous-cutanés blancs humains avec du PBS, puis ajouter 1 ml de solution de trypsine/EDTA (0,25 %). Laisser à RT pendant 2 min et confirmer le détachement par microscopie optique. Ajouter 23 mL de milieu PGM-2 pour neutraliser la trypsine/EDTA et faire une solution de 24 mL en suspension de préadipocytes.
  3. Mettre 1 mL de solution sous-cutanée de préadipocytes blancs humains en suspension dans chaque puits d’une plaque compagnon de co-culture de 24 puits et faire croître jusqu’à la confluence (généralement 2-3 jours).
  4. Pendant la croissance jusqu’à la confluence, préparer des milieux de différenciation des préadipocytes (PDM). Pour préparer le PDM, préparez une crosse 2x PDM en ajoutant un mélange exclusif d’insuline, de dexaméthasone, d’indométacine et d’isobutyl-méthylxanthine à un milieu de base de PGM. Diluez 2x PDM dans un rapport de 1:1 avec des PGM pour obtenir 1x PDM.
  5. Une fois confluents, différencier les préadipocytes blancs sous-cutanés humains en changeant le milieu en 1 mL de 1x milieu PDM dans chaque puits (jour 0). Laissez les préadipocytes blancs sous-cutanés humains incuber à 37 °C 5 % de CO2 pendant 10 jours (sans changement de milieu) pour se différencier complètement. Surveiller la différenciation à l’aide de la microscopie en phase optique (voir Figure 4B).
    REMARQUE : Les adipocytes différenciés ne peuvent pas être évacués et peuvent être utilisés pour des dosages du jour 10 au jour 12. La différenciation adipocytaire peut être mesurée par amplification de leptine, d’adiponectine et de PPAR-γ.
  6. Au jour 6 de la différenciation, amorcer des hSATMVECs à une densité de 5 x 104 cellules par insert dans un milieu de croissance EC complet de 500 μL MV sur des inserts de transpuits (membrane de 0,4 μM). Placez les inserts transwell dans un puits contenant 500 μL de milieu de croissance EC complet MV () et faites-les croître jusqu’à la confluence à 37 °C avec 5 % de CO2.
  7. Au jour 10, lorsque les adipocytes sont complètement différenciés, retirer la moitié du milieu PDM de chaque puits et transférer les inserts de transpuits contenant le hSATMVEC confluent dans leur propre milieu (ECGM-MV) dans chaque puits (voir Figure 4A).
  8. Laissez les cellules en co-culture pendant 24 heures avant de retirer les inserts de transpuits et d’effectuer des tests évaluant la fonction adipocytaire.
    REMARQUE : À ce stade, les adipocytes peuvent également être lysés pour l’isolement des protéines ou de l’ARN si nécessaire.

8. Absorption du glucose par le 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-désoxyglucose (2-NBD)-glucose adipocytaire

  1. Après 24 h de co-culture, retirer les inserts cellulaires contenant hSATMVEC. Ensuite, ajoutez du glucose 2-NBD dans le milieu de chaque puits pour obtenir une concentration finale de 20 μM. Protéger de la lumière et incuber pendant 30 min à 37 °C avec 5% de CO2.
  2. Laver les cellules deux fois dans du PBS et fixer les adipocytes à l’aide de 500 μL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant 15 min à RT. Laver les cellules trois fois dans du PBS avant de laisser dans 100 μL de PBS.
    REMARQUE : À ce stade, les adipocytes sont prêts à être imagés. Dans les figures incluses, l’imagerie de phase et la lumière verte (excitation 440-480 nm/émission 504-544 nm) ont été obtenues sur le système d’analyse de cellules vivantes à un grossissement de 10x dans quatre champs de forte puissance (voir Figure 4C).
  3. Quantifiez le niveau d’absorption de glucose en quantifiant le pourcentage vert de la surface totale à l’aide du seuillage dans ImageJ (ou tout autre logiciel similaire).

Résultats

Pureté et phénotype hSATMVEC
Les hSATMVEC isolés chez les patients témoins (c’est-à-dire les personnes sans antécédents de maladie cardiométabolique) étaient à 99,5 % CD31 + CD144 + CD45- sur la cytométrie en flux (Figure 2). Les hSATMVEC isolés avaient une morphologie semblable à celle d’un pavé typique des CE (Figure 3A). Les hSATMVECs ont eu un temps moyen de doublement de la population de 56,6 h ± 8,1 h (moyenne ± SEM, n = 10) (Figure 3B), et la réplication active de l’ADN dans les hSATMVECs a été confirmée à l’aide d’un kit d’imagerie de prolifération cellulaire (Figure 3C).

hSATMVEC s’est comporté comme des MVEC fonctionnels et a formé des tubes dans Matrigel (Figure 3D). L’expression relative des protéines clés impliquées dans la voie de signalisation de l’insuline Akt-eNOS est illustrée à la figure 3E. Les eNO et Akt ont tous deux montré une augmentation de la phosphorylation induite par l’insuline, représentée par le rapport entre les protéines phosphorylées et les protéines totales normalisées en ß-actine (figure 3E).

Co-culture hSATMVEC-adipocytes
Un modèle illustratif de la co-culture hSATMVEC-adipocytes peut être vu dans la figure 4A. Au fur et à mesure que les préadipocytes blancs sous-cutanés humains se différencient, on remarquera le développement de vacuoles lipidiques (Figure 4B), qui peuvent être quantifiées par coloration au Rouge O Huile (Figure 4B).

La figure 4C montre l’imagerie illustrative par contraste de phase et fluorescence (excitation 440-480 nm/émission 504-544 nm) d’adipocytes différenciés après 30 min d’incubation avec 20 μM de glucose 2-NBD. L’absorption de glucose peut être quantifiée en mesurant la surface verte en pourcentage de la surface totale des cellules.

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Figure 1 : Schéma illustrant la récolte et le traitement des hSATMVECs Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Résultat typique de l’analyse par cytométrie en flux des hSATMVECs en culture. (A) Nuage de points de la zone de diffusion latérale (SSC-A) et de la zone de diffusion vers l’avant (FSC-A) montrant le déclenchement (boîte rouge) des hSATMVECs en culture autour d’une densité de population cellulaire spécifique. (B) Nuage de points de la largeur de diffusion vers l’avant (FSC-Width) et FSC-A montrant le déclenchement (boîte rouge) des hSATMVECs cultivés autour d’une densité de population cellulaire spécifique. (C) Histogramme montrant la fluorescence des cellules fermées à CD45-FITC. (D) Nuage de points de l’intensité de fluorescence de CD144-PE (axe x) et CD31-PerCP (axe y). (E) Histogramme montrant la fluorescence des cellules fermées à CD144-PE. (F) Histogramme montrant la fluorescence des cellules fermées à CD31-PerCP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : phénotype de hSATMVEC. (A) Image de microscopie optique de hSATMVEC près de la confluence montrant un aspect de pavé. (B) Temps de doublement de hSATMVEC - Microscopie optique d’HATEC prise à 24 h d’intervalle, démontrant l’étendue de la prolifération cellulaire. (C) Prolifération de hSATMVEC. Microscopie à fluorescence de hSATMVEC avec iodure de propidium et EdU/Alexa-fluor 488 chez des sujets témoins. (D) Formation du tube hSATMVEC à partir de sujets témoins (images prises à un grossissement de 4x). (E) Stimulation de l’insuline des HATEC - montrant l’expression relative de l’Akt phosphorylé (sérine 473) à l’Akt total (panneau de gauche) de l’eNOS phosphorylé (sérine 1177) à l’eNOS total (panneau de droite) à des concentrations croissantes d’insuline avec des transferts Western illustratifs inférieurs à l’actine B. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± MEB. La taille des échantillons se trouve sous chaque panneau. Abréviations : 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU), cellules endothéliales microvasculaires du tissu adipeux sous-cutané humain (hSATMVEC), erreur type de la moyenne (MEB). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Co-culture hSATMVEC-adipocytes. (A) Image schématique de la co-culture hSATMVEC-adipocytes. (B) Différenciation des adipocytes. Le panneau de gauche montre les préadipocytes au jour 0 et le panneau de droite montre les adipocytes différenciés au jour 10 après l’ajout de PDM. La figure du bas montre la quantité de lipides stockée dans les adipocytes et les préadipocytes colorés au rouge d’huile. Le panneau de gauche montre l’imagerie de phase des adipocytes après co-culture et incubation avec 20 μM de glucose 2-NBD pendant 30 min. Le panneau de droite montre une imagerie verte à partir de laquelle l’absorption de glucose (en % vert de la surface totale) peut être quantifiée. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Abréviations : Jour 10 (J10), tissu adipeux sous-cutané humain, cellules endothéliales microvasculaires (hSATMVEC), milieu de différenciation des préadipocytes (PDM) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau supplémentaire 1 : Cocktail de coloration pour la cytométrie en flux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Cette étude décrit une technique d’isolement de hSATMVEC prélevé à partir de SAT lors de l’implantation de routine de CIED. Nous démontrons que le hSATMVEC isolé a une grande pureté, exprime les protéines transmembranaires CD144 et CD31 spécifiques de l’EC, et ne montre aucune expression significative du leucocyte CD45. Nous montrons ensuite que, de manière reproductible et fiable, les hSATMVEC isolés prolifèrent et peuvent être utilisés expérimentalement pour étudier la machinerie intracellulaire impliquée dans la signalisation de l’insuline et l’angiogenèse. En plus de pouvoir les cultiver de manière isolée, ils peuvent également être utilisés en co-culture pour étudier la diaphonie hSATMVEC-adipocyte.

Les cellules endothéliales utilisées dans la recherche fondamentale et translationnelle proviennent généralement de gros vaisseaux, tels que l’aorte et la veine ombilicale humaine, ou la microvascularisation. Ces sources ont toutes deux leurs propres limitesrespectives 7,8 ; Les cellules endothéliales des gros vaisseaux sont soit difficiles d’accès (dans le cas du tissu aortique), soit dérivées de tissus néonatals présentant une physiologie et une exposition environnementale potentiellement différentes9. L’utilisation de cellules endothéliales isolées à partir de tissus prélevés lors de l’implantation du CIED permet d’étudier et d’expérimenter la physiologie cellulaire au sein de groupes spécifiques de patients du monde réel. Les CIED sont implantés pour une variété d’indications, notamment chez les patients atteints de bradyarythmies, d’insuffisance cardiaque et de prévention primaire et secondaire des tachyarythmies ventriculaires10. Ces patients présentent souvent de multiples comorbidités, notamment le diabète, l’obésité et les maladies coronariennes, qui sont au cœur de la recherche cardiovasculaireà l’échelle mondiale. De plus, bien que les données illustratives de cet article concernent des patients témoins, nous avons appliqué ces techniques pour isoler et étudier SATMVEC chez une gamme de patients, y compris ceux atteints d’insuffisance cardiaque avancée et/ou de diabète sucré de type 2.

Il n’est pas rare que nous rencontrions des problèmes avec de faibles rendements hSATMVEC après une tentative d’isolement cellulaire. Ce risque peut être considérablement réduit en utilisant un volume initial plus important de SAT pour isoler hSATMVEC. De plus, nous le rencontrons plus fréquemment chez les personnes atteintes de maladies cardiométaboliques, et en particulier de diabète.

L’une des limites de cette technique est que les hSATMVEC isolés ne peuvent subir qu’un nombre limité de passages. D’après notre expérience, après le passage 5, quel que soit le phénotype du patient, la prolifération de hSATMVEC ralentit considérablement. De plus, les hSATMVEC isolés à l’aide de cette technique ne prolifèrent pas bien lorsqu’ils sont trop peu peuplés ; par conséquent, nous recommandons de ne pas transmettre hSATMVEC à un rapport supérieur à 1:6. Comme mentionné à la page 1. Nous avons réussi à décongeler et à réanimer hSATMVEC stocké dans de l’azote liquide jusqu’à 4 ans, et d’après notre expérience, le risque de réanimation est plus grand lorsqu’il est cryoconservé à un nombre de passage inférieur (nous cryoconservons généralement hSATMVEC au passage 2).

Les tissus prélevés lors de l’insertion du CIED sont librement disponibles et peuvent être prélevés sans préjudice pour le patient. Par conséquent, une source facile d’accès et relativement non invasive de cellules endothéliales provenant de ces groupes de patients est très bénéfique pour mener des recherches ciblées. Bien que les images représentatives de cet article proviennent de patients « témoins » (c’est-à-dire des patients sans diagnostic d’insuffisance cardiaque ou de diabète, bien qu’avec une indication pour l’implantation d’un CIED), nous avons réussi à isoler, cultiver et co-cultiver des SATMVECs de patients atteints d’insuffisance cardiaque, de diabète et d’une combinaison de ces pathologies. De plus, ces techniques peuvent également être appliquées à d’autres lits microvasculaires, y compris le muscle squelettique, et nous optimisons actuellement un modèle de diaphonie MVEC-myocyte du muscle squelettique.

Les hSATMVECs peuvent être isolés à partir de tissus humains prélevés au moment de l’insertion du CIED et sont d’une pureté suffisante pour être utilisés expérimentalement pour étudier le dysfonctionnement microvasculaire et l’interaction croisée entre les cellules endothéliales et les adipocytes chez les personnes avec et sans maladie cardiométabolique.

Déclarations de divulgation

SS a reçu un soutien non financier, des cachets de conférenciers et des honoraires d’AstraZeneca. RC a reçu des honoraires de conférencier de Janssen Oncology. L’OIB a reçu des honoraires de conférenciers de Novartis.

Remerciements

Nous sommes très reconnaissants envers le Département de bioimagerie de la Faculté des sciences biologiques (Université de Leeds, Royaume-Uni) pour l’utilisation de l’installation de cytométrie en flux, qui a été financée par une subvention du Conseil de recherches en biotechnologie et en sciences biologiques (BBSRC BB/R000352/1). SS a été soutenu par une bourse de formation en recherche clinique de la British Heart Foundation (FS/CRTF/20/24071). CL a été soutenu par une bourse de doctorat de la British Heart Foundation (FS/19/59/34896). LDR a été soutenu par le prix Diabetes UK RD Lawrence Fellowship (16/0005382). Le CMR a été soutenu par une bourse de recherche clinique intermédiaire de la British Heart Foundation (FS/12/80/29821). MTK est professeur de recherche cardiovasculaire et sur le diabète à la British Heart Foundation (CH/13/1/30086) et titulaire d’une subvention du programme de la British Heart Foundation (RG/F/22/110076)

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
170L CO2Incubateur GS Biotech170G-014
2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose)InvitrogenN13195
4 % PARAFIX fixateur histologique tamponnéVWR ChemicalsPRC/R/38/1
Akt (tAkt) Rabbit  ; 1:1000Cell Signalling Technology9272
BD Venflon Pro Safety 14 g x 45 mm, Orange, 50/pqtMedisave393230
Solution d’albumine sérique bovine, 7,5 %MerckA8412-100ML
CD144  ;( VE-Cadhérine) Anticorps anti-humain, PE, REAfinityMiltenyi Biotec130-118-495
CD31 Anticorps anti-humain, PerCP-Vio 700, REAfinityMiltenyi Biotec130-110-811
CD31 MicroBead Kit, humain, 1 kitMiltenyi Biotec130-091-935
CD45 Anticorps anti-humain, FITC, REAfinityMiltenyi Biotec130-110-769
Extraction cellulaire BufferInvitrogenFNN0011
Centrifuge 5804 REppendorf5805000060
Click-iT EdU Kit de prolifération cellulaire pour l’imagerie, Alexa Fluor 488 colorantInvitrogenC10337Kit d’imagerie de prolifération cellulaire
Collagénase/Dispase, 500 mgRoche/Merck11097113001
Corning Matrigel Matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit (GFR)Corning  ;354230Membrane basale
Matrix Corning 100 mm TC Boîte de cultureCorning  ;
Costar Plaques à 24 puits transparentes traitées TC, emballées individuellement,Corning stériles  ;3526
Costar Plaques à 6 puits transparentes traitées TC, emballées individuellement,Corning stériles  ;3516
CytoFLEX S &ndash ; 4 Cytomètre à flux laserBeckman
Kit d’élimination des cellules mortesMiltenyi Biotec130-090-101
Dulbecco&prime ; s Saline tamponnée au phosphateMerckD8537-500ML
EASYstrainer Tamis cellulaire pour tubes de 50 mL, 70 & micro ; m mesh, Bleu, stérile, 50/pqtGreiner Bio-One542070
Endothélial Cell Growth Medium MVPromoCellC-22020
Eppendorf Safe-Lock microtubes à essaiMerckEP0030120094
Solution d’acide éthylènediaminetétraacétiqueMerckE8008-100ML
Falcon 24 Well TC-Treated Cell Polystyrène Perméable Companion Plate, avec couvercle, Stérile, 1/paquet, 50/caisseAppleton WoodsCF537
Falcon Support perméable pour plaque à 24 puits avec 0,4 & micro ; m Membrane PET transparente, stérile, 1/paquet, 48/caisseAppleton WoodsCF521
Milieu de congélation Cryo-SFMPromoCellC-29912
Solution de gélatine, 2 % dans l’eauMerckG1393-100ML
Gibco Antibiotique-antimycosique (100x), 100mLFisher Scientific11570486
Gibco TrypLE Select Enzyme (1x), sans rouge de phénolFisher Scientific
Hanks&prime ; Solution saline équilibréeMerckH6648-500ML
Cellules préadipocytaires sous-cutanées humainesLonzaPT-5020
Incucyte ZOOMEssen BioScienceSystème d’analyse de cellules vivantes
Solution d’insuline humaineMerckI9278-5ML
LS Colonnes, 25/pqtMiltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MACS Solution de stockage de tissusMiltenyi Biotec130-100-008
Rotateur de tube MACSmixMiltenyi Biotec130-090-753Rotateur
de tube MS Colonnes, 25/pqtMiltenyi Biotec130-042-201
NuPAGE 4&ndash ; 12 % Bis-Tris GelInvitrogenNP0322BOX
OctoMACS SéparateurMiltenyi Biotec130-042-109
PGM-2 Croissance des préadipocytes Medium-2 BulletKitLonzaPT-8002
Phospho (Ser1177) eNOS Rabbit 1:1000Technologie de signalisation cellulaire9570
Phospho-Akt (Ser473) Rabbit  ; 1:1000Technologie de signalisation cellulaire4060
Filtres de pré-séparation 30 & micro ; m, 50/pqtMiltenyi Biotec130-041-407
Solution de coloration à l’iodure de propidium (PI)/RNaseTechnologie de signalisation cellulaire4087
Séparateur QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
Scalpel jetable stérile 10VWRI501
Tube à bouchon à vis, 15 ml, (LxØ ;) : 120 x 17 mm, PP, avec impressionSarstetd62.554.502
Bouchon à vis, 50 ml, (LxØ ;) : 114 x 28 mm, PP, avec impressionSarstedt62.547.254
Tube à vis, 50 ml, (LxØ ;) : 114 x 28 mm, PP, avec impressionSarstetd62.547.254
Total eNOS Souris 1:1000BD Biosciences610297
Triton X-100, BioUltra, pour la biologie moléculaireMerck93443-500ML
&beta ;-Actine (C4) Souris 1:5000Santa Cruz Biotechnology  ; Réf. Sc-47778
43016712563029

Références

  1. Bierhansl, L., et al. Central role of metabolism in endothelial cell function and vascular disease. Physiology. 32 (2), 126-140 (2017).
  2. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), a006429(2012).
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  4. Brown, O. I., Bridge, K., Kearney, M. T. Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases in glucose homeostasis and diabetes-related endothelial cell dysfunction. Cells. 10 (9), 2315(2021).
  5. Luk, C., Haywood, N. J., Bridge, K. I., Kearney, M. T. Paracrine role of the endothelium in metabolic homeostasis in health and nutrient excess. Front Cardiovasc Med. 26 (9), 882923(2022).
  6. Click-iT EdU Imaging Kits. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Fmp10338.pdf (2024).
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  8. Ades, E. W., et al. HMEC-1: establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. J Invest Dermatol. 99 (6), 683-690 (1992).
  9. Chi, J. T., et al. Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (19), 10623-10628 (2003).
  10. Brignole, M., et al. 213 ESC Guidelines on cardiac pacing and cardiac resynchronization therapy. Eur Heart J. 34 (29), 2281-2329 (2013).
  11. Greenspon, A. J., et al. Trends in permanent pacemaker implantation in the United States from 1993 to 2009: Increasing complexity of patients and procedures. J Am Coll Cardiol. 60 (16), 1540-1545 (2012).
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Mots-clés

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