Chromatographie par échange d'ions

La chromatographie par échange d’ions est largement utilisée dans la séparation et l’isolement des composés chargés, en particulier les grandes biomolécules.

Ce type de chromatographie liquide utilise une colonne de billes de phase stationnaire emballées, appelée résine. La technique sépare les analytes en fonction de leur affinité avec la résine chargée.

Il existe deux types principaux de cette technique. Dans la chromatographie échangeuse de cations, la résine chargée négativement est utilisée pour lier les analytes chargés positivement. De même, dans l’échange d’anions, les analytes chargés négativement se lient à la résine chargée positivement. Les composés non liés sont lavés à travers la colonne, et l’analyte peut ensuite être collecté dans un récipient séparé.

Cette vidéo présentera les bases de la chromatographie par échange d’ions et démontrera la technique en séparant un mélange de protéines en laboratoire.

La phase stationnaire est un élément clé d’une séparation réussie. Les résines échangeuses de cations fortes présentent généralement des groupes fonctionnels fortement acides, tels que l’acide sulfonique. Les résines échangeuses de cations faibles présentent des groupes faibles, tels que les acides carboxyliques.

De même, les résines échangeuses d’anions fortes utilisent des bases fortes, comme les amines quaternaires, tandis que les résines échangeuses d’anions faibles utilisent des amines secondaires ou tertiaires. Le choix de la résine dépendra des propriétés du mélange d’échantillons et de l’analyte d’intérêt.

Les tampons utilisés, collectivement appelés phase mobile, sont également importants pour la séparation, notamment en termes de pH. Pour les protéines, le pH est choisi en fonction de son point isoélectrique, ou pI. À un pH égal au pI de la protéine, la protéine est neutre. Au-dessus du pI, il aura une charge négative nette, tandis qu’en dessous du pI, il aura une charge positive nette. Le pH du tampon doit être sélectionné de manière à ce que la protéine soit correctement chargée et capable de se lier à la phase stationnaire.

La chromatographie par échange d’ions est généralement un processus en quatre étapes. Tout d’abord, une colonne garnie contenant de la résine échangeuse d’anions ou de cations est équilibrée à l’aide d’un tampon. Pour les colonnes échangeuses d’anions, il s’agit de protoner la résine, en s’assurant qu’elle est chargée positivement.

Ensuite, l’échantillon est chargé sur la colonne. Le tampon doit avoir une faible conductivité, car les espèces chargées peuvent entrer en compétition avec l’échantillon pour les interactions avec la résine. Les composés de charge opposée se lient à la résine. Les molécules qui ne sont pas chargées, ou qui portent la même charge, restent non liées.

Dans la troisième étape, la colonne est lavée avec un tampon supplémentaire pour retirer les composants non liés de la colonne, laissant la liaison derrière.

Enfin, la quatrième étape est l’élution de l’analyte lié. Ceci est accompli soit en utilisant un gradient de sel, où la concentration de sel est progressivement augmentée, soit en utilisant un tampon à élution de sel élevée.

Les molécules faiblement liées seront éluées en premier, car la faible teneur en sel perturbera plus facilement leur liaison ionique avec la résine. Les composés qui sont plus fortement liés s’éluent avec des concentrations de sel plus élevées.

Maintenant que les bases de la chromatographie d’échange d’ions ont été esquissées, jetons un coup d’œil à son utilisation dans la séparation de deux protéines.

Tout d’abord, pour préparer le mélange de protéines à la séparation, ajoutez 0,2 ml de tampon de liaison et agitez au vortex pour bien mélanger. Ensuite, centrifugez le mélange pour éliminer toute mousse. Pour préparer la colonne d’échange de cations, fixez-la verticalement sur un support annulaire et laissez la résine se déposer.

Ouvrez le capuchon supérieur de la colonne, puis le bas. Laissez le tampon s’égoutter par gravité dans un tube situé en dessous.

Pour préparer la colonne, équilibrez-la en chargeant un volume-colonne de tampon, dans ce cas 0,3 mL. Laissez le tampon s’égoutter de la colonne dans un flacon de déchets. Une fois qu’un volume de colonne de mémoire tampon est sorti, répétez l’étape d’équilibration.

Pour exécuter l’expérience, placez un tube à centrifuger de 2 ml étiqueté « Unbound 1 » sous la colonne. Chargez soigneusement 0,1 mL de l’échantillon de protéines sur le dessus de la colonne.

Une fois l’échantillon chargé, lavez-le avec une colonne-volume de tampon et laissez-le s’écouler jusqu’au bout. Répétez l’opération pour un total de 5 lavages. Collectez chaque lavage dans son propre tube, étiqueté « Unbound 1 » à « 5 ». ? Pour les 2 derniers lavages, centrifugez la colonne pendant 10 s pour vous assurer que toutes les espèces non liées s’échappent de la colonne. Placez la colonne dans un nouveau tube de prélèvement à centrifuger de 2 ml et étiquetez-la « Bound 1 ». Chargez 1 volume-colonne de tampon d’élution sur le dessus de la colonne. Centrifuger pendant 10 s à 1 000 x g.

Répétez l’étape d’élution 2 fois de plus pour assurer la collecte de l’analyte lié. Étiquetez les tubes « Bound 2 » et « 3 ». ? Notez tout changement de couleur ou observation sur les fractions.

Dans cet exemple, l’hémoglobine et le cytochrome C ont été séparés. L’hémoglobine a un pI de 6,8, tandis que le cytochrome C a un pI de 10,5. Dans le tampon pH 8,1, l’hémoglobine est chargée négativement et ne se lie pas à la colonne. À l’inverse, le cytochrome C est chargé positivement à un pH de 8,1 et se lie à la colonne.

L’hémoglobine, une protéine de couleur brunâtre, a été trouvée dans les fractions non liées, tandis que le cytochrome C, une protéine de couleur rougeâtre, a été observé dans la fraction liée.

Il existe de nombreuses formes de chromatographie liquide, chacune ayant des capacités différentes pour séparer les composants d’un mélange.

Dans cet exemple, la chromatographie sur colonne a été utilisée pour séparer un mélange d’ADN simple et double brin. L’hydroxyapatite, ou HA, est une forme cristalline de phosphate de calcium couramment utilisée comme phase stationnaire en raison de ses ions calcium chargés positivement. Dans ce cas, la colonne HA était idéale pour la séparation de l’ADN car elle peut se lier au squelette chargé négativement de l’ADN.

Une autre forme de chromatographie sur colonne fréquemment utilisée pour séparer les protéines est la chromatographie d’affinité métallique immobilisée, ou IMAC. Dans l’IMAC, la phase stationnaire possède un ligand avec un ion métallique, qui se lie à une étiquette histidine sur la protéine d’intérêt.

Tous les autres composants du mélange sortent de la colonne. La protéine est ensuite éluée avec une solution d’imidazole, qui a une structure similaire à celle de l’histidine, et se lie plus fortement à l’ion métallique.

Une application courante de la chromatographie sur colonne est la chromatographie liquide à haute performance, ou HPLC. L’HPLC est largement utilisée en chimie analytique pour l’identification et la séparation de composés biologiques et non biologiques dans un mélange.

La HPLC est similaire à la chromatographie sur colonne démontrée dans cette vidéo, sauf qu’elle est automatisée et fonctionne à des pressions très élevées. Cela permet d’utiliser des billes de phase stationnaire plus petites, avec un rapport surface/volume plus élevé. Ainsi, il est possible d’améliorer les interactions entre la phase stationnaire et les composants de la phase mobile.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la chromatographie par échange d’ions. Vous devriez maintenant comprendre les concepts qui se cachent derrière, les 4 étapes impliquées et certaines techniques connexes.

Merci d’avoir regardé !