3.11: Électrophorèse capillaire (EC)

1. CE Instrumentation Setup

1. Allumer l’instrument CE et l’ordinateur. En utilisant le logiciel de l’ordinateur, allumez la source de lumière pour l’analyse des UV pour lui permettre de se réchauffer. Un logiciel a un indicateur lorsque la lampe est prête à l’emploi (lampe icône devient couleur).
2. Faire un fichier de méthodes. Définissez les paramètres importants pour le marquage CE en cours d’exécution. Dans cette analyse, les températures de stockage de la cartouche et échantillon sont 35 ° C. La longueur d’onde de détection UV est 214 nm.
3. Écrire un programme de temps. Le programme se compose généralement des étapes de rinçage (pour nettoyer le tube capillaire avant l’analyse), étapes de l’injection, puis une étape de l’électrophorèse. Pour l’étape de rinçage, effectuer 2 rinçages pendant 1 min à l’aide de 20 lb/po2 de pression. Le premier rinçage est avec NaOH, qui permet de s’assurer que les groupes silanol sur la paroi capillaire sont déprotonés. Le second rinçage est avec exécution buffer (tampon de borate de 0,025 M ici) pour vous assurer que le tube capillaire est gauche équilibrée avec tampon.
4. Pour l’injection, injection sous pression sert à 0,5 lb/po2 pendant 5 s.
5. Pour l’étape de l’électrophorèse, les conditions étaient de séparation voltage : 20 kV, temps : 5 min, une polarité normale. Pour chaque étape, également indiquer quel flacon est l’entrée et quel flacon est la sortie. Enregistrez le fichier de méthodes après que tous les paramètres sont entrés.

2. préparation des normes et des échantillons de soude

1. Faire des solutions mères de 500 ppm de l’aspartame, la caféine et l’acide benzoïque dans l’eau. Faire 50 mL de chacun, à l’aide d’une fiole jaugée.
2. Préparer une solution standard de 150 ppm aspartame, caféine 150 ppm et 100 ppm d’acide benzoïque dans une fiole jaugée de 10 mL.
3. Faites des solutions de caféine standard de 200 ppm, 100 ppm, 150 ppm et 50 ppm à un fioles jaugées de 10 mL.

3. exécuter les exemples sur le marquage CE

1. Placer les flacons contenant des normes ou des échantillons de soude dans le porte-flacon échantillon. Assurez-vous d’écrire quel exemple se trouve dans quel slot. Deux machines à sous ont l’ion borate forme courir le tampon et la solution de rinçage de NaOH 0,1 M.
2. Dans le fichier de la méthode, une entrée qui slot le premier flacon est dans.
3. Acquérir un même essai, en veillant à saisir toutes les informations données le programme de visites.
4. Continuer à acquérir des données, changer le flacon d’entrée pour chaque échantillon. Exécuter la combinaison standard, les 3 concentrations de caféine et un Pepsi et diète Pepsi échantillon.
5. Insérez la cible dans l’instrument et choisir l’instrument approprié.
6. Analyser les données sur l’ordinateur. Calculer des pics et les normes de superposition et les échantillons réels pour aider à identifier les sommets. Faire une courbe d’étalonnage pour les données de la caféine.

L’électrophorèse capillaire, ou CE, est une technique utilisée en analyse chimique pour séparer les molécules d’un champ électrique en fonction de leur taille et de leur charge.

L’électrophorèse capillaire est réalisée dans un tube de diamètre submillimétrique, appelé capillaire, qui contient une solution d’électrolyte en écoulement. L’échantillon est injecté dans le capillaire et un champ électrique est appliqué. Les molécules sont ensuite séparées en fonction de la différence de vitesse, qui est influencée par la charge, la taille et la viscosité du solvant. La CE est idéale pour la séparation des molécules chargées et a une résolution supérieure à celle de la chromatographie liquide haute performance, ce qui la rend plus efficace et plus sensible.

Cette vidéo présentera les bases de l’électrophorèse capillaire et démontrera son utilisation en déterminant la composition d’une boisson gazeuse.

Dans l’EC, un champ électrique est appliqué à un capillaire rempli d’un électrolyte. Le champ électrique induit une charge positive à l’entrée du capillaire, et une charge négative à la sortie.

L’électrolyte circule à l’intérieur du capillaire, induit par le champ électrique. Cet écoulement, appelé écoulement électro-osmotique, est causé par le mouvement d’une couche discrète d’ions salins chargés positivement le long des parois capillaires chargées négativement.

Lorsque le courant électrique traverse le capillaire, les cations le long de la paroi se déplacent vers l’extrémité négative. Ce flux d’ions tire la solution au centre à travers le tube.

Les molécules de l’échantillon sont ensuite séparées en fonction de leur vitesse dans le capillaire. Cette vitesse, appelée mobilité électrophorétique, dépend de la charge et de la taille des molécules, ainsi que de la mesure dans laquelle elles sont attirées ou repoussées par un champ électrique.

Les molécules chargées positivement s’écoulent plus rapidement dans le capillaire, car elles sont plus attirées par le potentiel à la sortie. Les molécules chargées négativement s’écoulent beaucoup plus lentement, car elles sont plus attirées par le potentiel à l’entrée. Les molécules neutres sont entraînées avec le flux en vrac. Ainsi, l’ordre des molécules sortant du capillaire est chargé positivement, neutre, puis chargé négativement. De plus, le flux d’électrolyte tire les molécules plus petites plus rapidement que les molécules plus grosses en raison des forces de frottement.

Les molécules sont enregistrées par un détecteur, tel que UV-Vis, à la sortie de la colonne, et sont visualisées dans un graphique de l’intensité du signal du détecteur en fonction du temps, appelé électrophérogramme.

Les électrophérogrammes peuvent fournir une gamme d’informations ; comme le nombre de composés différents présents dans un échantillon et la quantité de chaque substance.

Maintenant que vous avez vu un bref résumé de l’électrophorèse capillaire, voyons comment elle est réalisée en laboratoire.

Tout d’abord, allumez l’instrument d’électrophorèse capillaire et l’ordinateur. Allumez ensuite le détecteur UV pour lui permettre de se réchauffer.

Définissez les paramètres d’exécution de l’expérience. Tout d’abord, réglez la température de la cartouche et du stockage de l’échantillon à 35 ? C et la longueur d’onde pour la détection UV à 214 nm.

Ensuite, réglez les deux étapes de rinçage. Le premier rinçage se fait avec de l’hydroxyde de sodium pour s’assurer que les groupes silanol sur la paroi capillaire sont protonés. Le deuxième rinçage utilise un tampon de coulée pour équilibrer le capillaire. Ensuite, réglez l’échantillon à injecter à 0,5 psi pendant 5 s.

Réglez l’étape d’électrophorèse, en sélectionnant la tension de séparation. Dans ce cas, utilisez 20 kV pendant 5 min en utilisant une polarité normale, c’est-à-dire que le champ électrique est positif à l’entrée et négatif à la sortie.

Tout d’abord, préparez des solutions mères de 50 ml d’aspartame, de caféine et d’acide benzoïque à 500 parties par million dans de l’eau.

À partir des solutions mères, préparez une solution étalon de 150 ppm d’aspartame, 150 ppm de caféine et 100 ppm d’acide benzoïque.

Ensuite, préparez 4 solutions standard de caféine à 50, 100, 150 et 200 ppm. Ces échantillons seront utilisés pour réaliser une courbe d’étalonnage. Pour plus d’informations, consultez la vidéo de cette collection sur les courbes d’étalonnage.

Enfin, préparez les échantillons de soude en les dégazant avec de l’azote. Les échantillons de soude seront analysés sans dilution.

Placez les flacons contenant des échantillons standard ou de soude dans le support du flacon. Placez également les flacons contenant le tampon d’écoulement et la solution de rinçage à l’hydroxyde de sodium dans le porte-échantillon. Assurez-vous de noter l’emplacement de chacun.

Dans le logiciel de l’instrument CE, indiquez les fentes contenant les deux solutions de rinçage et le premier flacon d’échantillon. Maintenant, exécutez le premier échantillon.

Ensuite, exécutez l’étalon de combinaison, les 4 concentrations de caféine et un échantillon de soda régulier et diététique en changeant le flacon d’entrée.

Une fois que toutes les solutions ont été séparées, analysez les données.

Tout d’abord, utilisez les normes pour identifier les pics dans les échantillons de soude. Une comparaison des trois pics observés dans l’échantillon de soda light aux normes montre que la caféine, l’aspartame et l’acide benzoïque sont présents dans le soda light. Dans l’échantillon de soda ordinaire, seul le pic de caféine est présent, mais pas les pics d’aspartame et d’acide benzoïque.

Ensuite, calculez l’aire du pic pour chaque solution étalon de caféine et faites une courbe d’étalonnage. La courbe d’étalonnage de la caféine peut être utilisée pour calculer la concentration de caféine dans chaque échantillon.

L’électrophorèse capillaire est utilisée pour de nombreuses séparations spécialisées dans les milieux universitaires et industriels.

L’EC est souvent utilisé comme composant des tests de contrôle de la qualité de l’industrie pharmaceutique. Les médicaments, qu’il s’agisse de petites molécules ou de produits biologiques, peuvent être soumis à l’électrophorèse capillaire pour voir si des produits secondaires sont présents. Il peut également être utilisé pour déterminer si les protéines sont correctement repliées, car le repliement peut affecter la charge protéique.

L’EC peut également être utilisé pour séparer l’ADN. À l’aide d’une plaque de micropuits et de plusieurs réseaux de capillaires, les chercheurs peuvent augmenter le débit d’une seule expérience, comme illustré ici. Les fragments d’ADN ont été séparés en fonction de leur taille, avec une résolution allant jusqu’à 1 paire de bases. Cela rend possible le séquençage de fragments d’ADN, ainsi que la détermination d’autres paramètres tels que les variantes du nombre de copies, qui sont utilisés pour diagnostiquer des maladies génétiques potentielles.

Une protéine peut être modifiée par divers groupes fonctionnels qui sont chimiquement attachés à différents endroits. Différentes copies d’une même protéine peuvent varier avec différentes modifications, ce qui changera la charge et la taille de chaque protéine. Le passage des protéines purifiées à travers un CE attaché à un spectromètre de masse peut séparer les protéines en fonction des modifications présentes, et également identifier le type et l’emplacement de la modification.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à l’électrophorèse capillaire. Vous devriez maintenant comprendre comment l’EC sépare les molécules en fonction de la charge et de la masse, et comment analyser un échantillon sur l’EC en laboratoire.

Merci d’avoir regardé !