Microscopie confocale à fluorescence : une technique pour localiser les protéines dans les fibroblastes de souris

1. Matériaux

Tampons

1. Tampon de lavage : 1 X saline stérile tamponnée de phosphate (PBS) sans calcium ni magnésium
2. Tampon de fixation : 1% de paraformaldehyde en PBS
3. Tampon de perméabilisation : 0,1 % Triton X-100 en PBS
4. Tampon de blocage : 1% d'albumine de sérum bovin dans PBS
5. Milieu de croissance cellulaire : DMEM complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS), pénicilline/streptomycine, et L-glutamine

équipement

6. Hotte d'écoulement laminaire
7. Incubateur humidifié (37oC, 5% CO₂)
8. Microscope à balayage laser confocal; ici, Nikon Eclipse Ti laser

Matériaux et réactifs

9. Diapositives de culture cellulaire chambrée
10. Médias de montage anti-fade avec DAPI (pour les noyaux de coloration)
11. Verre de couverture de microscope
12. Lingettes de tâche délicates
13. Pipettors et conseils

Réagents spécifiques d'assay

14. Cellules adhérentes (cellules primaires ou lignées cellulaires); ici, des fibroblastes de souris transfectés avec CD1d ont été employés (LCD1).
15. Anticorps primaires pour détecter les cibles cellulaires; ici, rat anti-souris CD107a (LAMP-1) et souris anti-souris CD1d ont été utilisés.
16. Anticorps secondaires conjugués au fluorophore spécifiques aux isotypes d'anticorps primaires; ici anti-rat IgG conjugué à Alexafluor 488 et anti-souris IgG conjugué à Alexafluor 647 ont été utilisés.

2. Protocole

Préparation à la coloration des anticorps

Cellules d'ensemencement

1. Resuspendre les cellules d'intérêt dans les médias de croissance.
2. Ensuite, ensemencez 500 ll de la suspension cellulaire/par puits dans les puits d'une glissière de chambre à 4 puits. (Ici, les cellules LCD1 ont été ensemiées à 2,5x10⁵ cellules/chambre dans 500 ll de supports de croissance. La densité d'ensemencement peut varier d'une lignée cellulaire à l'autre).
3. Incuber la glissière de chambre pendant la nuit dans un incubateur de CO₂ de 5 % à 37 oC, pour permettre aux cellules d'adhérer au verre.
4. Le lendemain, aspirez les supports de chaque puits, puis lavez les cellules 1X avec 500 L de PBS.

fixation

5. Pour fixer les cellules, ajouter une solution de paraformaldéhyde de 500 l 1 % dans chaque puits et incuber pendant 15 min à température ambiante.
6. Après l'incubation, recueillir le paraformaldéhyde dans un contenant de déchets liquides dangereux approprié.
7. Ensuite, lavez les cellules 3 fois avec 500 L PBS pour enlever les restes du fixatif.

Perméabilisation

8. Perméabilisez les cellules en couvant avec un tampon/puits de perméabilisation de 500 l l pendant 15 minutes à température ambiante.
9. Ensuite, lavez les cellules brièvement 3 fois avec 500 L de PBS.

Blocage

10. Incuber les cellules dans chaque puits avec un tampon de blocage de 500 l pendant 1 heure à 4 oC, pour bloquer la liaison non spécifique des anticorps.

Incubation primaire d'anticorps

11. Aspirez le tampon de blocage des chambres de diapositives.
12. Ensuite, ajoutez 500 L de solution d'anticorps primaire diluée aux cellules. (Ici, anti-CD107a (LAMP-1) a été dilué 1:500 et anti-CD1d a été utilisé non dilué (1H6 anticorps monoclonaux a été gentiment fourni par le Dr Randy Brutkiewicz)).
13. Incuber les toboggans pendant la nuit à 4oC.

Remarque : Si vous probez pour plus d'une cible, assurez-vous que les anticorps primaires sont différents isotypes. Les concentrations d'anticorps recommandées varient d'un fabricant à l'autre et doivent être titrées avant d'être utilisées.

Incubation secondaire d'anticorps

14. Aspirez la solution d'anticorps primaire des puits.
15. Laver les chambres de puits 4 fois avec 500 L PBS.
16. Ensuite, ajoutez 500 L de la solution d'anticorps secondaire diluée à chaque puits. (Ici, les anticorps secondaires- anti-souris IgG Alexafluor 647 et anti-rat IgG Alexafluor 488 ont été dilués 1:2000 dans le tampon de blocage).
17. Incuber à température ambiante pendant 1 h dans l'obscurité.
18. Après l'incubation, aspirez la solution d'anticorps secondaire.
19. Laver les chambres 4 fois avec 500 L PBS pour enlever tout anticorps secondaire non lié.

Remarque : Les concentrations d'anticorps recommandées varient d'un fabricant à l'autre et doivent être titrées avant d'être utilisées. Si l'on cherche plus d'une cible, les anticorps secondaires doivent être conjugués à différents fluorophores avec des spectres d'excitation/émission uniques. Gardez également à l'esprit l'excitation/émission de la contretache nucléaire (c.-à-d. DAPI) tout en sélectionnant les fluorophores. La sélection de fluorophore peut être affectée par la configuration laser du microscope confocal utilisé. La configuration laser de la machine dictera quels fluorophores sont appropriés pour l'expérience.

3. Les couvertures de montage

1. Tout d'abord, retirez soigneusement les chambres de la glissière.
2. Ensuite, maintenez la glissière à l'angle au-dessus d'une lingette délicate de tâche et retirez le fluide des bords sans toucher les cellules.
3. Ajouter 1 goutte de milieu de montage antifade, contenant la tache nucléaire DAPI, sur chaque section de cellules.
4. Ensuite, placez un bordereau de 20 mm x 60 mm sur la glissière en la tenant sur les bords à l'aide du bout des doigts. (Éviter la formation de bulles sur les cellules, car elles interfèrent avec l'imagerie).
5. Essuyez tout support de montage supplémentaire sur les côtés avec une manette délicate et rangez les diapositives dans l'obscurité à température ambiante jusqu'à une semaine.

4. Imagerie confocale

Échantillons d'image sur un microscope à balayage laser confocal. Pour les données présentées dans la figure 2, le Nikon Eclipse Ti A1R a été utilisé avec le logiciel NIS Elements Advanced Research. La section suivante détaille la procédure de capture d'images à l'aide du logiciel susmentionné.

1. Pour commencer l'imagerie des cellules, ouvrez le logiciel de recherche avancéeNIS Elementsen cliquant sur l'icônelogicielle NIS.
2. Ensuite, sur la fenêtre de contrôle cliquez sur 'TiPad' onglet et choisissez l'objectif souhaité pour l'imagerie. (Ici, le premier objectif 40x a été utilisé).
3. Chargez la diapositive avec des cellules sur la scène et centrez-la sous la lentille.
4. Maintenant, sur l'onglet 'A1plus Compact GUI',configurez les lasers appropriés pour les fluorophores utilisés. Cliquez sur le symbole de l'engrenage pour ouvrir le menu de teinture et de réglages spectrals et sélectionnez les canaux nécessaires et définir le laser pour chaque canal.
5. Ensuite, sélectionnez les émissions appropriées dans le menu déroulant sous le premier miroir dichroïque.
6. Ensuite, sous 'A1plus Compact GUI' fenêtre, cliquez sur 'Ch. Series' pour mettre en place la série de canaux de ligne, qui met en place si les lasers utilisés tirera sur l'échantillon simultanément ou séquentiellement. (Ici, les laissez-passer séquentiels ont été choisis, à commencer par le canal 1, suivi par le canal 2, puis 4).
7. Après cela, commencez à numériser en cliquant sur l'icône 'Arrow tip'sur le dessus. À ce stade, alors que l'imagerie est en direct, sous 'A1plus Compact GUI' fenêtre, cliquez sur l'échelle coulissante et modifier la taille du sténopé pour assurer la limitation de la lumière de mise au point. (Ici, le réglage le plus bas disponible (0,5), a été utilisé).
8. Ensuite, ajustez les paramètres «haute tension» et «offset» sous chaque laser à des niveaux appropriés, en utilisant les échelles coulissantes pour permettre la détection de la coloration spécifique tout en limitant toute coloration de fond potentielle. Si un échantillon de coloration positive est disponible, commencez par l'imagerie de cet échantillon pour chaque canal afin de s'assurer que les réglages laser donnent des rapports signaux/bruit optimaux.
   Attention : une intensité laser élevée pendant de longues périodes peut provoquer le photoblanchiment.
9. Après avoir défini les valeurs HV et offset optimales pour chaque laser, cliquez sur l'onglet 'ND Acquisition'et sélectionnez ensuite l'icône 'Z'pour configurer les paramètres de la série Z. Ensuite, lors de l'acquisition d'une image en direct de l'échantillon, d'abord définir le fond en trouvant le bas de l'image et en cliquant sur le bouton«bas»puis trouver la position supérieure de l'échantillon et cliquez sur le bouton'haut'. Définir la taille de l'étape soit en tapant spécifiquement la taille d'étape préférée en m pour chaque étape ou en spécifiant le nombre total d'étapes nécessaires.
10. Une fois que les paramètres de la série Z ont été réglés, sélectionnez la résolution de taille/pixel désirée de l'image. Pour ce faire, cliquez sur la fenêtre 'A1plus Compact GUI' et sous l'icône 'taille' sélectionnez la résolution désirée. Pour diminuer le bruit de l'image, on peut sélectionner le menu déroulant à côté du symbole'' ' pour faire la moyenne du nombre d'images sélectionnées.
11. Maintenant, cliquez sur l'onglet 'Run now' sur le menu 'ND Acquisition' afin de commencer à imagerie de l'échantillon.
12. Une fois l'imagerie terminée, enregistrez l'image en cliquant sur 'File', puis 'Save As', qui exportera le fichier d'image avec l'extension'.nd2'. Enfin, répétez le processus pour chacun des autres échantillons.