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Source: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1
1 Département de microbiologie et d'immunologie, University of Maryland School of Medicine et Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, Baltimore, Maryland 21201
2 Center for Biomedical Engineering and Technology, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, Maryland 21201
La microscopie par fluorescence confocale est une technique d'imagerie qui permet une résolution optique accrue par rapport à la microscopie d'épifluorescence « à champ large » classique. Les microscopes confocals sont capables d'obtenir une meilleure résolution optique x-y grâce à la « numérisation laser » - généralement un ensemble de miroirs à tension contrôlée (miroirs de galvanomètre ou de « galvo ») qui dirigent l'éclairage laser à chaque pixel du spécimen à la fois. Plus important encore, les microscopes confocals atteignent une résolution z-axiale supérieure en utilisant un sténopé pour enlever la lumière de mise au point provenant d'endroits qui ne sont pas dans le z-plan étant numérisé, permettant ainsi au détecteur de recueillir des données à partir d'un z-plan spécifié. En raison de la haute résolution Z réalisable dans la microscopie confocale, il est possible de recueillir des images à partir d'une série de z-planes (également appelé z-stack) et de construire une image 3D à travers un logiciel.
Avant de discuter du mécanisme d'un microscope confocal, il est important de considérer comment un échantillon interagit avec la lumière. La lumière est composée de photons, des paquets d'énergie électromagnétique. Un photon empiéchant sur un échantillon biologique peut interagir avec les molécules qui composent l'échantillon de l'une des quatre façons : 1) le photon n'interagit pas et passe à travers l'échantillon; 2) le photon est réfléchi/dispersé; 3) le photon est absorbé par une molécule et l'énergie absorbée est libérée sous forme de chaleur par des processus collectivement connus sous le nom de carie non radiative; et 4) le photon est absorbé et l'énergie est alors rapidement réémise en tant que photon secondaire par le processus connu sous le nom de fluorescence. Une molécule dont la structure permet l'émission de fluorescence est appelée fluorophore. La plupart des échantillons biologiques contiennent des fluorophores endogènes négligeables; par conséquent, les fluorophores exogènes doivent être utilisés pour mettre en évidence les caractéristiques d'intérêt dans l'échantillon. Pendant la microscopie de fluorescence, l'échantillon est éclairé avec la lumière de la longueur d'onde appropriée pour l'absorption par le fluorophore. Lors de l'absorption d'un photon, un fluorophore est dit être «excité» et le processus d'absorption est appelé «excitation». Lorsqu'un fluorophore abandonne l'énergie sous la forme d'un photon, le processus est connu sous le nom d'« émission », et le photon émis est appelé fluorescence.
Le faisceau lumineux utilisé pour exciter un fluorophore est focalisé par la lentille objective d'un microscope et converge à un « point focal » où il est focalement focal. Au-delà du point focal, la lumière diverge à nouveau. Les poutres entrantes et sortantes peuvent être visualisées comme une paire de cônes touchant au point focal (voir la figure 1, panneau gauche). Le phénomène de diffraction impose une limite à la façon dont étroitement un faisceau de lumière peut être concentré - le faisceau se concentre réellement à un endroit de taille finie. Deux facteurs déterminent la taille de la tache focale : 1) la longueur d'onde de la lumière, et 2) la capacité de collecte de lumière de la lentille objective, qui se caractérise par son ouverture numérique (NA). Le «spot» focal s'étend non seulement dans le plan x-y, mais aussi dans la direction z, et est en réalité un volume focal. Les dimensions de ce volume focal définissent la résolution maximale réalisable par l'imagerie optique. Bien que le nombre de photons soit le plus grand dans le volume focal, les chemins de lumière conique au-dessus et au-dessous de la mise au point contiennent également une densité plus faible de photons. N'importe quel fluorophore dans le chemin de lumière peut ainsi être excité. Dans la microscopie conventionnelle (à champ large), les émissions des fluorophores au-dessus et au-dessous du plan focal contribuent à la fluorescence hors foyer (un « fond brumeux »), ce qui réduit la résolution et le contraste de l'image, comme le montre la figure 1, le cube rouge représentant l'émission de fluorophore au-dessus du plan focal (étoile rouge) qui a comme conséquence la fluorescence hors-focus (en haut à droite). Ce problème est amélioré dans la microscopie confocale, en raison de l'utilisation d'un trou d'épingle. (figure 2, en bas à droite). Tel que représenté à la figure 3, le trou d'épingle permet aux émissions provenant du point focal d'atteindre le détecteur (à gauche), tout en empêchant la fluorescence hors foyer (à droite) d'atteindre le détecteur, améliorant ainsi à la fois la résolution et le contraste.
Figure 1. Résolution optique de l'épifluorescence par rapport à la microscopie confocale. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Le faisceau lumineux utilisé pour exciter un fluorophore est focalisé par la lentille objective d'un microscope et converge à un volume focal, puis diverge (à gauche). L'étoile rouge représente le plan focal d'un échantillon qui est représenté tandis que le carré rouge représente l'émission de fluorophore au-dessus du plan focal. Lors de la capture d'une image de cet échantillon à l'aide d'un microscope épifluorescent, l'émission du carré rouge flou sera visible et contribuera à un « fond brumeux » (en haut à droite). Les microscopes confocals ont un trou d'épingle qui empêche la détection de la lumière émise à l'extérieur du plan focal, éliminant le « fond brumeux » (en bas à droite).
Figure 2. Effet de trou d'épingle dans la microscopie confocale. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Bien que l'intensité la plus élevée de la lumière d'excitation soit au point focal de la lentille (gauche, ovale rouge), d'autres parties de l'échantillon ne se trouve pas dans le point focal (droite, étoile rouge) obtiendront la lumière et la fluoresce. Afin d'éviter que la lumière émise par ces régions floues n'atteigne le détecteur, un écran muni d'un sténopé est présent devant le détecteur. Seule la lumière dans le foyer (à gauche) émise par le plan focal est capable de traverser le sténopé et d'atteindre le détecteur. La lumière hors foyer (à droite) est bloquée avec le sténopé et n'atteint pas le détecteur.
Figure 3. Principaux composants d'un microscope à balayage laser confocal. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Par souci de simplicité, la description mécaniste d'un microscope confocal sera limitée à celle du Nikon Eclipse Ti A1R. Bien qu'il puisse y avoir des différences techniques mineures entre les différents microscopes confocal, l'A1R sert bien comme un bon modèle pour décrire la fonction de microscope confocal. Le faisceau lumineux d'excitation, produit par un tableau de lasers à diodes, est reflété par le miroir dichroïque primaire dans l'objectif, qui concentre la lumière sur le spécimen en cours d'image. Le miroir dichroïque primaire réfléchit sélectivement la lumière d'excitation tout en permettant à la lumière à d'autres longueurs d'onde de passer à travers. La lumière rencontre alors les miroirs de balayage qui balaient le faisceau lumineux à travers le spécimen d'une manière x-y, illuminant un seul (x,y) pixel à la fois. La fluorescence émise par les fluorophores au pixel lumineux est recueillie par l'objectif et passe à travers le miroir dichroïque primaire pour atteindre un tableau de tubes photomultiplicateurs (PMT). Les miroirs dichroiques secondaires dirigent la lumière d'émission vers le PMT approprié. La lumière d'excitation dispersée par l'échantillon dans l'objectif est réfléchie par le miroir dichroïque primaire vers le spécimen, et donc empêchée d'entrer dans la détection voie légère et d'atteindre les PMT (voir la figure 3). Cela permet de quantifier la fluorescence relativement faible sans contamination par la lumière dispersée du faisceau lumineux d'excitation, qui est généralement des ordres de grandeur plus intenses que la fluorescence. Parce que le sténopé bloque la lumière de l'extérieur du volume focal, la lumière arrivant au détecteur provient d'un étroit, sélectionné z-plan. Par conséquent, les images peuvent être recueillies à partir d'une série de z-planesadjacents; cette série d'images est souvent appelée « z-stack ». En utilisant le logiciel approprié, une pile zpeut être traitée pour générer une image 3D du spécimen. Un avantage particulier de la microscopie confocale est la capacité de distinguer la localisation subcellulaire de la coloration. Par exemple, la différenciation entre la coloration de membrane de la coloration intracellulaire, qui est très provocante avec la microscopie conventionnelle d'épifluorescence (1, 2, 3).
La préparation de l'échantillon est une facette importante de l'imagerie confocale. Une force des techniques de microscopie optique est la flexibilité d'imager des cellules vivantes ou fixes. Lorsque vous tentez de produire des images 3D, en raison du nombre d'images qui doivent être acquises pour une z-pile, la difficulté de maintenir la santé cellulaire, et le mouvement des cellules vivantes et de leurs organites, l'utilisation de cellules fixes est typique. La procédure pour fixer et tacher des cellules pour la fluorescence confocale est semblable à celle conventionnellement employée dans l'immunofluorescence. Après la culture dans les diapositives de chambre ou sur les couvertures, les cellules sont fixées à l'aide de paraformaldéhyde pour préserver la morphologie cellulaire. La liaison non spécifique d'anticorps est bloquée utilisant l'albumine bovine de sérum, le lait, ou le sérum normal. Afin de maintenir la spécificité des anticorps secondaires, la solution utilisée ne doit pas provenir de la même espèce dans laquelle les anticorps primaires ont été générés. Les cellules sont incubées avec des anticorps primaires qui lient l'antigène d'intérêt. Lors de l'étiquetage de plusieurs cibles cellulaires, les anticorps primaires doivent être dérivés d'une espèce différente. Les anticorps taguant un antigène sont alors liés par des anticorps secondaires fluorophore-conjugués. Les anticorps secondaires conjugués au fluorophore doivent être sélectionnés afin qu'ils soient compatibles avec les longueurs d'onde de l'excitation laser disponibles dans le microscope confocal. Lors de la visualisation de plusieurs antigènes, les spectres d'excitation/émission des fluorophores devraient différer suffisamment pour que leurs signaux puissent être discriminés par l'analyse microscopique. Le spécimen taché est ensuite monté sur une glissière pour l'imagerie. Un support de montage est utilisé pour prévenir le photoblanchiment et la déshydratation des spécimens. Si vous le souhaitez, un support de montage contenant une contre-tache nucléaire (p. ex. DAPI ou Hoechst) peut être utilisé (4).
Dans le protocole suivant, les fibroblastes de souris transfectés pour exprimer cD1d (LCD1) ont été souillés avec des anticorps reconnaissant CD1d et CD107a (LAMP-1). CD1d est un complexe d'histocompatibilité majeur 1 (MHC 1)-comme le récepteur présent sur la surface des cellules présentant d'antigène qui présente des antigènes. LAMP-1 (protéine de membrane associée lysosomal-1) est une protéine transmembranaire principalement présente dans les membranes lysosomal. Pour la présentation appropriée d'antigène, CD1d est trafiqué par le compartiment lysosomal de pH bas, ainsi LAMP-1 est employé comme marqueur du compartiment lysosomal pour ce protocole. En sondant les cellules LCD1 avec anti-CD1d et anti- LAMP-1 qui ont été produites dans différentes espèces, les anticorps secondaires avec des fluorophores uniques peuvent être utilisés pour déterminer la localisation de chaque protéine dans la cellule et si CD1d est présent dans le LAMP-1 positif compartiments lysosomal.
1. Matériaux
Tampons
équipement
Matériaux et réactifs
Réagents spécifiques d'assay
2. Protocole
Préparation à la coloration des anticorps
Cellules d'ensemencement
fixation
Perméabilisation
Blocage
Incubation primaire d'anticorps
Remarque : Si vous probez pour plus d'une cible, assurez-vous que les anticorps primaires sont différents isotypes. Les concentrations d'anticorps recommandées varient d'un fabricant à l'autre et doivent être titrées avant d'être utilisées.
Incubation secondaire d'anticorps
Remarque : Les concentrations d'anticorps recommandées varient d'un fabricant à l'autre et doivent être titrées avant d'être utilisées. Si l'on cherche plus d'une cible, les anticorps secondaires doivent être conjugués à différents fluorophores avec des spectres d'excitation/émission uniques. Gardez également à l'esprit l'excitation/émission de la contretache nucléaire (c.-à-d. DAPI) tout en sélectionnant les fluorophores. La sélection de fluorophore peut être affectée par la configuration laser du microscope confocal utilisé. La configuration laser de la machine dictera quels fluorophores sont appropriés pour l'expérience.
3. Les couvertures de montage
4. Imagerie confocale
Échantillons d'image sur un microscope à balayage laser confocal. Pour les données présentées dans la figure 2, le Nikon Eclipse Ti A1R a été utilisé avec le logiciel NIS Elements Advanced Research. La section suivante détaille la procédure de capture d'images à l'aide du logiciel susmentionné.
La microscopie par fluorescence confocale est une technique d'imagerie spécialisée pour la localisation d'une protéine ou d'un antigène d'intérêt dans un échantillon de cellules ou de tissus en étiquetant l'antigène avec un colorant fluorescent conjugué par anticorps et en détectant le signal fluorescent. Il offre une résolution spatiale plus élevée que la microscopie à fluorescence à large champ, à l'aide de deux trous d'épingle placés sur les plans focaux de la lentille objective, lui donnant le nom confocal. Il permet aux utilisateurs de visualiser la coloration à un niveau subcellulaire, comme la différenciation entre la coloration de la membrane de surface de la coloration intracellulaire.
Un microscope confocal suit un principe de base semblable à un microscope classique de fluorescence. Le faisceau d'une source lumineuse, généralement un laser pour confocal, est réfléchi par un miroir dichroïque et focalisé par une lentille objective sur l'échantillon. Cette lumière excite les fluorophores à émettre une longueur d'onde différente, qui remonte à travers l'objectif objectif et miroir dichroïque à un appareil photo ou un oculaire.
La résolution améliorée d'un microscope confocal est principalement due à la présence de deux trous d'épingle, qui sont de très petits trous pour que la lumière passe à travers sur les chemins d'excitation et d'émission de lumière. Les trous d'épingle sont placés stratégiquement au plan focal de la lentille objective. Maintenant, passons à un schéma de vue latérale de l'arrangement de microscope pour examiner le chemin de lumière. Après avoir traversé le trou d'épingle de l'excitation, le faisceau lumineux d'excitation a pour effet d'être originaire d'un point focal, ce qui permet à la lentille objective de concentrer la lumière jusqu'à un point sur l'échantillon. Le faisceau d'émission de ce point focal converge vers le trou d'épingle d'émission, ce qui lui permet de passer à travers. Maintenant, pendant l'excitation, les fluorophores dans le chemin de lumière, au-dessus et au-dessous du point focal, sont également légèrement excités. Tandis que la lumière d'émission provenant du point focal passe à travers le trou d'épingle, les émissions des points hors foyer convergent avant ou après le trou d'épingle d'émission, et sont donc bloquées, ce qui entraîne une diminution de la fluorescence de fond.
Le cycle d'excitation-émission-détection doit être répété pour chaque point d'imagerie dans la région d'intérêt, ce qui peut être fait de différentes façons. Par exemple, le confocal de balayage laser emploie des miroirs de balayage de galvanomètre, qui détournent la lumière d'excitation à différents angles. Par conséquent, balayer le faisceau lumineux à travers le spécimen dans le plan XY. Spinning disc confocal utilise un disque avec un tableau de trous d'épingle, qui tourne pour déplacer l'arrangement des trous d'épingle. Cela permet aux utilisateurs d'éclairer plusieurs petits points d'imagerie dans l'échantillon à chaque fois, couvrant progressivement toute la zone pendant la rotation du disque. En raison des trous d'épingle, l'image XY au détecteur représente un plan Z étroit. Par conséquent, les images peuvent être recueillies à partir d'une série de plans Z consécutifs, souvent appelés une pile Z. À partir de ces images, un logiciel approprié peut générer une représentation 3D du modèle de signal de fluorescence dans l'échantillon.
Dans ce protocole, vous observerez l'immunostaining des fibroblastes de souris, suivi de l'imagerie sur un microscope confocal pour visualiser différentiellement une protéine de surface cellulaire et une protéine lysosomal.
Pour commencer, en utilisant des techniques stériles, resuspendre les cellules d'intérêt dans 500 microlitres de support de croissance par puits, puis les ensemencer dans les puits d'une glissière de chambre à quatre puits. Ici, nous utilisons des fibroblastes de souris qui ont été transfectés pour exprimer la molécule antigène-présentation, CD1d. Pour permettre aux cellules d'adhérer au verre, placez la glissière de chambre dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5 % à 37 degrés Celsius, et incuber pendant la nuit. Le matin, aspirez les médias de chaque puits, puis lavez les cellules une fois avec 500 microlitres de PBS pendant quelques secondes.
Pour fixer les cellules, ajouter 500 microlitres de solution de paraformaldéhyde de 1 % dans chaque puits, et couver pendant 15 minutes à température ambiante. Après l'incubation, recueillir le paraformaldéhyde dans un contenant de déchets liquides dangereux approprié, puis enlever les restes du fixatif en lavant les cellules trois fois avec PBS pendant quelques secondes.
Pour permettre la pénétration des anticorps dans les cellules, ajouter 500 microlitres de tampon de perméabilisation à chaque puits, et incuber sur le banc pendant 15 minutes à température ambiante. Après la perméabilisation, lavez les cellules brièvement trois fois avec 500 microlitres de PBS. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon de blocage à chaque puits, et incuber pendant une heure à quatre degrés Celsius pour empêcher la liaison non spécifique d'anticorps.
Préparer les anticorps primaires, anti-CD1d et anti-LAMP-1, à des concentrations de travail appropriées. Ensuite, aspirez le tampon des puits et couvrez les cellules de chaque puits avec 500 microlitres de solution d'anticorps primaire dilué, puis incubez la glissière sur une surface plane pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, diluer les anticorps secondaires, dans ce cas un anticorps anti-souris et anti-rat avec des étiquettes fluorescentes distinctes, en bloquant tampon à des concentrations de travail appropriées. Ensuite, aspirez la solution d'anticorps primaire des puits, puis lavez les cellules quatre fois avec 500 microlitres de PBS. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de la solution d'anticorps secondaire diluée à chaque puits, et incubez à température ambiante pendant une heure dans l'obscurité. Après l'incubation, aspirez la solution d'anticorps secondaire et lavez les puits quatre fois avec 500 microlitres de PBS pour enlever tout anticorps secondaire non lié.
Pour monter les échantillons après le lavage final, détachez soigneusement et retirez les chambres de la glissière. Pour enlever le PBS résiduel, maintenez la glissière à un angle au-dessus d'une lingette délicate de tâche, et retirez le fluide des bords sans toucher les cellules. Une fois que l'excès de PBS est enlevé, ajouter une goutte de milieu de montage antifade, contenant la tache nucléaire DAPI, sur chaque section de cellules. Ensuite, prenez un bordereau de 20 par 60 millimètres, et en utilisant juste le bout des doigts commencer à abaisser le bordereau lentement sur l'un ou l'autre bord, en prenant soin d'éviter la formation de bulles sur les cellules. Essuyez tout support de montage supplémentaire sur les toboggans avec une lingette délicate et rangez les lames dans l'obscurité à température ambiante jusqu'à une semaine.
Pour commencer l'imagerie des cellules, cliquez d'abord sur l'icône logicielle NIS sur le bureau. Une fois dans la fenêtre de contrôle, cliquez sur l'onglet TiPad en haut et choisissez l'objectif souhaité pour l'imagerie. Ensuite, chargez la diapositive avec des cellules sur la scène, et centrez-la sous la lentille. Ensuite, sur l'onglet A1plus Compact GUI à côté de l'onglet TiPad, configurez les lasers appropriés pour les fluorophores utilisés. Cliquez sur le symbole de l'engrenage pour ouvrir le menu de teinture et de réglages spectrals. Une fois que le menu de teinture et de réglages spectrals est ouvert, sélectionnez les canaux nécessaires et fixez le laser pour chaque canal. Ensuite, sélectionnez les émissions appropriées dans le menu de descente sous le premier miroir dichroïque. Ensuite, sous la fenêtre A1plus Compact GUI, cliquez sur Ch.Series pour configurer la série de canaux de ligne, qui configure si les lasers utilisés tireront sur l'échantillon simultanément ou séquentiellement.
Après cela, commencez à numériser en cliquant sur l'icône de pointe de flèche sur le dessus. À ce stade, pendant que l'imagerie est en direct, sous la fenêtre A1plus Compact GUI, cliquez sur l'échelle coulissante, et modifier la taille du sténopé pour assurer la limitation de la lumière hors foyer. Ensuite, ajustez les réglages de haute tension et de décalage sous chaque laser à des niveaux appropriés en utilisant les échelles coulissantes pour permettre la détection de la coloration spécifique tout en limitant toute coloration de fond potentielle. Si un échantillon de coloration positive est disponible, commencez par l'imagerie de cet échantillon pour chaque canal afin de s'assurer que les réglages laser donnent des rapports signal-bruit optimaux. Après avoir défini les valeurs HV et offset optimales pour chaque laser, cliquez sur l'onglet Acquisition ND, puis sélectionnez l'icône Z pour configurer les paramètres de la série Z.
Ensuite, tout en acquérant une image en direct de l'échantillon, d'abord définir le fond en trouvant le bas de l'image et en cliquant sur le bouton du bas. Ensuite, trouvez la position supérieure de l'échantillon et cliquez sur le bouton supérieur. Définir la taille de l'étape soit en tapant spécifiquement la taille d'étape préférée en microns pour chaque étape ou en spécifiant combien d'étapes totales sont nécessaires. Pour sélectionner la résolution de taille/pixel souhaitée de l'image, cliquez sur la fenêtre Aiplus Compact GUI, et sous l'icône de taille, sélectionnez la résolution désirée.
Pour diminuer le bruit de l'image, vous pouvez sélectionner le menu déroulant à côté du symbole theta pour faire la moyenne du nombre d'images sélectionnés. Après cela, cliquez sur l'onglet Run Now sur le menu acquisition ND afin de commencer à imagerie de l'échantillon. Une fois l'imagerie terminée, enregistrez l'image en cliquant sur le fichier, puis enregistrez comme, qui exportera le fichier d'image avec l'extension point-nd2. Enfin, répétez le processus pour chacun des autres échantillons.
Dans cette expérience, les fibroblastes de souris exprimant le gène cD1d de glycoprotéine de surface ont été fixés, immunostained, et imaged sur un microscope confocal. Cette image montre une seule section d'une pile Z à un grossissement de 40X, où le CD1d est taché en rouge. L'échantillon a été costained avec LAMP-1, un marqueur lysosomal, en vert. La tache nucléaire DAPI a été employée pour montrer les noyaux des cellules.
Dans une image composite où les trois canaux différents sont fusionnés, l'apparition de jaunes résulte du chevauchement des canaux rouges et verts, et indique une zone où CD1d et LAMP-1 sont co-localisés dans les lysosomes. Les zones où une seule couleur est présente indiquent la présence de CD1d ou LAMP-1 sans co-localisation. Cette image montre un rendu 3D des cellules construites à partir d'images capturées dans la z-pile et cette méthode a permis la construction d'une vue latérale de ce groupe de cellules. Cette image suivante montre une tranche de la z-pile au grossissement 100X, démontrant les modèles d'expression de ces deux protéines plus en détail. La boîte rose sur le côté droit de l'image affiche la section transversale de la x-coordinate désignée par la ligne rose de l'image, qui représente la vue latérale à la ligne rose. De même, la boîte bleue sur le bas de l'image montre la section transversale de la y-coordinate désignée par la ligne bleue dans l'image, qui représente la vue avant à la ligne bleue. Le rendu 3D de l'image z-stack permet aux utilisateurs de visualiser l'image en 3D, en visualisant tous les plans x, y et z. Cela peut être utilisé pour étudier la co-localisation des différentes taches à différentes régions de la cellule.
La microscopie confocale à fluorescence est une technique d’imagerie spécialisée permettant de localiser une protéine ou un antigène d’intérêt dans un échantillon de cellule ou de tissu en marquant l’antigène avec un colorant fluorescent conjugué à un anticorps et en détectant le signal fluorescent. Elle offre une résolution spatiale plus élevée que la microscopie à fluorescence à champ large, à l’aide de deux sténopés placés dans les plans focaux de l’objectif, ce qui lui donne le nom de confocale. Il permet aux utilisateurs de visualiser la coloration à un niveau subcellulaire, comme la différenciation entre la coloration membranaire de surface et la coloration intracellulaire.
Un microscope confocal suit un principe de base similaire à celui d’un microscope à fluorescence classique. Le faisceau d’une source lumineuse, généralement un laser pour confocal, est réfléchi par un miroir dichroïque et focalisé par une lentille d’objectif sur l’échantillon. Cette lumière excite les fluorophores à émettre une longueur d’onde différente, qui retourne à travers la lentille de l’objectif et le miroir dichroïque jusqu’à une caméra ou un oculaire.
L’amélioration de la résolution d’un microscope confocal est principalement due à la présence de deux sténopés, qui sont de très petits trous permettant à la lumière de passer sur les trajets lumineux d’excitation et d’émission. Les sténopés sont stratégiquement placés dans le plan focal de l’objectif. Passons maintenant à un schéma de vue latérale de la disposition du microscope pour examiner le trajet de la lumière. Après être passé à travers le sténopé d’excitation, le faisceau lumineux d’excitation a pour effet de provenir d’un point focal, ce qui permet à la lentille de l’objectif de focaliser ensuite la lumière sur un point de l’échantillon également. Le faisceau d’émission de ce point focal converge au niveau du sténopé d’émission, ce qui lui permet de le traverser. Maintenant, pendant l’excitation, les fluorophores dans le trajet de la lumière, au-dessus et en dessous du point focal, sont également légèrement excités. Alors que la lumière d’émission provenant du point focal passe à travers le sténopé, les émissions des points flous convergent avant ou après le sténopé d’émission, et sont donc bloquées, ce qui réduit la fluorescence de fond.
Le cycle excitation-émission-détection doit être répété pour chaque point d’imagerie dans la région d’intérêt, ce qui peut être fait de différentes manières. Par exemple, le confocal à balayage laser utilise des miroirs à balayage galvanométrique, qui dévient la lumière d’excitation sous différents angles. Par conséquent, balayer le faisceau lumineux sur l’échantillon dans le plan XY. Le disque confocal en rotation utilise un disque avec un ensemble de sténopés, qui tourne pour décaler la disposition des sténopés. Cela permet aux utilisateurs d’éclairer plusieurs petits points d’imagerie dans l’échantillon à chaque fois, couvrant progressivement toute la surface au fur et à mesure que le disque tourne. En raison des sténopés, l’image XY au détecteur représente un plan Z étroit. Par conséquent, les images peuvent être collectées à partir d’une série de plans Z consécutifs, souvent appelée pile Z. À partir de ces images, un logiciel approprié peut générer une représentation 3D du motif du signal de fluorescence dans l’échantillon.
Dans ce protocole, vous observerez l’immunomarquage de fibroblastes de souris, suivi d’une imagerie au microscope confocal pour visualiser différentiellement une protéine de surface cellulaire et une protéine lysosomale.
Pour commencer, à l’aide de techniques stériles, réintroduisez les cellules d’intérêt dans 500 microlitres de milieu de croissance par puits, puis ensemencez-les dans les puits d’une lame de chambre à quatre puits. Ici, nous utilisons des fibroblastes de souris qui ont été transfectés pour exprimer la molécule présentatrice d’antigène, CD1d. Pour permettre aux cellules d’adhérer au verre, placez la lame de chambre dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius et incubez pendant la nuit. Le matin, aspirez le milieu de chaque puits, puis lavez une fois les cellules avec 500 microlitres de PBS pendant quelques secondes.
Pour fixer les cellules, ajoutez 500 microlitres de solution de paraformaldéhyde à 1 % dans chaque puits et incubez pendant 15 minutes à température ambiante. Après l’incubation, recueillez le paraformaldéhyde dans un contenant approprié pour les déchets liquides dangereux, puis retirez tous les restes du fixateur en lavant les cellules trois fois avec du PBS pendant quelques secondes.
Pour permettre aux anticorps de pénétrer dans les cellules, ajoutez 500 microlitres de tampon de perméabilisation dans chaque puits et incubez sur la paillasse pendant 15 minutes à température ambiante. Après la perméabilisation, lavez brièvement les cellules trois fois avec 500 microlitres de PBS. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon de blocage dans chaque puits et incubez pendant une heure à quatre degrés Celsius pour éviter la liaison d’anticorps non spécifiques.
Préparez les anticorps primaires, anti-CD1d et anti-LAMP-1, à des concentrations de travail appropriées. Ensuite, aspirez le tampon des puits et couvrez les cellules de chaque puits avec 500 microlitres de solution d’anticorps primaires diluée, puis incubez la lame sur une surface plane pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, diluez les anticorps secondaires, dans ce cas un anticorps anti-souris et anti-rat avec des marqueurs fluorescents distincts, dans un tampon bloquant aux concentrations de travail appropriées. Ensuite, aspirez la solution d’anticorps primaire des puits, puis lavez les cellules quatre fois avec 500 microlitres de PBS. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de la solution d’anticorps secondaire diluée dans chaque puits et incubez à température ambiante pendant une heure dans l’obscurité. Après l’incubation, aspirez la solution d’anticorps secondaires et lavez les puits quatre fois avec 500 microlitres de PBS pour éliminer tout anticorps secondaire non lié.
Pour monter les échantillons après le lavage final, détachez soigneusement et retirez les chambres de la lame. Pour éliminer le PBS résiduel, tenez la lame en biais au-dessus d’une lingette délicate et retirez le liquide des bords sans toucher les cellules. Une fois l’excès de PBS éliminé, ajoutez une goutte de milieu de montage anti-évasion, contenant le colorant nucléaire DAPI, sur chaque section de cellules. Ensuite, prenez une lamelle de 20 x 60 millimètres et, du bout des doigts, commencez à abaisser lentement la lamelle sur chaque bord, en prenant soin d’éviter la formation de bulles sur les cellules. Essuyez tout support de montage supplémentaire sur les diapositives à l’aide d’une lingette délicate et conservez les diapositives dans l’obscurité à température ambiante jusqu’à une semaine.
Pour commencer à imager les cellules, cliquez d’abord sur l’icône du logiciel NIS sur le bureau. Une fois dans la fenêtre de contrôle, cliquez sur l’onglet TiPad en haut et choisissez l’objectif souhaité pour l’imagerie. Ensuite, chargez la diapositive avec des cellules sur la platine et centrez-la sous l’objectif. Ensuite, dans l’onglet A1plus Compact GUI à côté de l’onglet TiPad, configurez les lasers appropriés pour les fluorophores utilisés. Cliquez sur le symbole de l’engrenage pour ouvrir le menu des paramètres de colorant et spectral. Une fois le menu des paramètres de colorant et spectral ouvert, sélectionnez les canaux nécessaires et réglez le laser pour chaque canal. Ensuite, sélectionnez les émissions appropriées dans le menu déroulant sous le premier miroir dichroïque. Ensuite, sous la fenêtre A1plus Compact GUI, cliquez sur Ch.Series pour configurer la série de canaux de ligne, qui définit si les lasers utilisés se déclencheront sur l’échantillon simultanément ou séquentiellement.
Après cela, commencez la numérisation en cliquant sur l’icône en forme de flèche en haut. À ce stade, pendant que l’imagerie est en direct, sous la fenêtre A1plus Compact GUI, cliquez sur l’échelle mobile et modifiez la taille du sténopé pour limiter la lumière floue. Ensuite, ajustez les paramètres de haute tension et de décalage sous chaque laser à des niveaux appropriés en utilisant les échelles coulissantes pour permettre la détection de la coloration spécifique tout en limitant toute coloration de fond potentielle. Si un échantillon de coloration positif est disponible, commencez par imager cet échantillon pour chaque canal afin de vous assurer que les paramètres laser produisent des rapports signal/bruit optimaux. Après avoir défini les valeurs HV et de décalage optimales pour chaque laser, cliquez sur l’onglet Acquisition ND, puis sélectionnez l’icône Z pour configurer les paramètres de la série z.
Ensuite, lors de l’acquisition d’une image en direct de l’échantillon, définissez d’abord le bas en trouvant le bas de l’image et en cliquant sur le bouton du bas. Ensuite, trouvez la position supérieure de l’échantillon et cliquez sur le bouton supérieur. Définissez la taille du pas en tapant spécifiquement la taille de pas préférée en microns pour chaque pas ou en spécifiant le nombre total de pas nécessaires. Pour sélectionner la taille/résolution en pixels souhaitée de l’image, cliquez sur la fenêtre Aiplus Compact GUI, et sous l’icône de taille, sélectionnez la résolution souhaitée.
Pour réduire le bruit de l’image, vous pouvez sélectionner le menu déroulant à côté du symbole thêta pour faire la moyenne du nombre d’images sélectionné. Après cela, cliquez sur l’onglet Exécuter maintenant dans le menu Acquisition ND afin de commencer à imager l’échantillon. Une fois l’imagerie terminée, enregistrez l’image en cliquant sur Fichier, puis sur Enregistrer sous, ce qui exportera le fichier image avec l’extension dot-nd2. Enfin, répétez le processus pour chacun des autres échantillons.
Dans cette expérience, des fibroblastes de souris exprimant le gène de la glycoprotéine de surface CD1d ont été fixés, immunocolorés et imagés au microscope confocal. Cette image montre une seule section d’une pile Z à un grossissement de 40X, où CD1d est coloré en rouge. L’échantillon a été co-coloré avec LAMP-1, un marqueur lysosomal, en vert. La coloration nucléaire DAPI a été utilisée pour montrer les noyaux des cellules.
Dans une image composite où les trois canaux différents sont fusionnés, l’apparition du jaune résulte du chevauchement des canaux rouge et vert, et indique une zone où CD1d et LAMP-1 sont co-localisés dans les lysosomes. Les zones où une seule couleur est présente indiquent la présence de CD1d ou LAMP-1 sans co-localisation. Cette image montre un rendu 3D des cellules construites à partir d’images capturées dans la pile z et cette méthode a permis de construire une vue latérale de ce groupe de cellules. L’image suivante montre une coupe de l’empilement z à un grossissement de 100X, démontrant les modèles d’expression de ces deux protéines plus en détail. La boîte rose sur le côté droit de l’image affiche la coupe transversale de la coordonnée x désignée par la ligne rose dans l’image, qui représente la vue latérale au niveau de la ligne rose. De même, la boîte bleue au bas de l’image montre la section transversale de la coordonnée y désignée par la ligne bleue dans l’image, qui représente la vue de face au niveau de la ligne bleue. Le rendu 3D de l’image z-stack permet aux utilisateurs de visualiser l’image en 3D, en visualisant tous les plans x, y et z. Cela peut être utilisé pour étudier la co-localisation des différentes taches dans différentes régions de la cellule.
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