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Microscopie à fluorescence : coloration par immunofluorescence des sections de tissus inclus en paraffine

Immunofluorescence Microscopy: Immunofluorescence Staining of Paraffin-Embedded Tissue Sections

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Immunology

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Immunofluorescence Microscopy: Immunofluorescence Staining of Paraffin-Embedded Tissue Sections

5.6: Antibody Generation: Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

5.8: Confocal Fluorescence Microscopy: A Technique to Determine the Localization of Proteins in Mouse Fibroblasts

53,562 Views

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09:56 min

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April 30, 2023

Overview

Source : Thomas Chaffee¹, Thomas S. Griffith^2,3,4, et Kathryn L. Schwertfeger^1,3,4
¹ Département de médecine de laboratoire et de pathologie, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Département d’urologie, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Centre du cancer maçonnique, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Center for Immunology, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Les analyses pathologiques des sections de tissu peuvent être employées pour obtenir une meilleure compréhension de la structure normale de tissu et pour contribuer à notre compréhension des mécanismes de la maladie. Les biopsies tissulaires, provenant de patients ou de modèles in vivo expérimentaux, sont souvent conservées en fixant dans la formaline ou le paraformaldéhyde et en s’intégrant dans la cire de paraffine. Cela permet un stockage à long terme et la section des tissus. Les tissus sont coupés en fines sections (5 m) à l’aide d’un microtome et les sections sont adhérences à des lames de verre. Les sections de tissus peuvent être tachées avec des anticorps, qui permettent la détection de protéines spécifiques dans les sections de tissu. La coloration avec des anticorps conjugués aux fluorophores (également connu sous le nom de fluorochromes) – composés qui émettent de la lumière à des longueurs d’onde spécifiques lorsqu’il est excité par un laser – est connu sous le nom d’immunofluorescence. La capacité de détecter des protéines dans une section peut fournir des informations telles que l’hétérogénéité de type cellulaire dans le tissu, l’activation de voies de signalisation spécifiques, et l’expression des biomarqueurs. Selon les fluorophores utilisés et le type de microscope disponible pour l’analyse, plusieurs couleurs peuvent être utilisées, ce qui permet l’analyse multiplexée des cibles.

Le protocole suivant décrit les étapes de base impliquées dans la coloration d’immunofluorescence des sections incorporées de tissu de paraffine. Il est important de noter que ce protocole n’inclura aucun détail sur la fixation du tissu, le processus d’enracinement de paraffine, ou la section des tissus. Une fois que les tissus ont été sectionnés et placés sur des lames de verre, ils sont réhydratés par une série d’incubations d’éthanol gradué (EtOH). Les sections sont incubées avec un réactif de blocage pour réduire la liaison non spécifique de l’anticorps à la section tissulaire. Les sections sont ensuite incubées avec un anticorps primaire qui peut ou non être directement étiqueté avec un fluorophore. Si l’anticorps primaire n’est pas étiqueté directement, les sections sont ensuite incubées avec un anticorps secondaire étiqueté avec un fluorophore. Différents anticorps peuvent exiger des conditions de coloration différentes, de ce fait, des suggestions pour l’optimisation des anticorps sont incluses. Après le lavage pour enlever tous les anticorps non liés, les diapositives sont montées avec des supports contenant DAPI pour étiqueter fluorescentement le noyau. Une fois que le support de montage a séché, les diapositives peuvent être imaginées à l’aide d’un microscope avec des lasers qui peuvent détecter les différents fluorophores.

Procedure

1. Mise en place

Le protocole de coloration typique comporte les étapes suivantes :
1. Réhydrater les sections de tissu sur les diapositives à l’aide d’une série d’éthanols classés.
2. Incuber les sections tissulaires à l’aide d’un tampon de blocage, ce qui aidera à bloquer la liaison non spécifique de l’anticorps au tissu et à réduire la fluorescence de fond.
3. Suppression du tampon de blocage et incubation de la section dans l’anticorps primaire, au moment où l’anticorps liera sa cible peptide.
4. Enlever l’anticorps primaire et laver les sections abondamment dans un tampon de lavage.
5. Incuber les sections avec un anticorps secondaire pour permettre la liaison à l’anticorps primaire, si l’anticorps primaire n’est pas directement étiqueté avec un fluorophore et un anticorps secondaire est nécessaire.
6. Laver l’anticorps secondaire des diapositives.
7. Montage des diapositives dans des supports de montage et leur permettant de sécher avant la visualisation sur un microscope fluorescent.
Les articles suivants sont nécessaires : porte-diapositives (verre ou plastique), bocaux, pipettes, stylo pap, chambre humide, pochettes de couverture et supports de montage avec DAPI.
Xylène est utilisé pour la réhydratation des diapositives. Le xylène est dangereux et doit être utilisé dans une hotte de fumée avec PPE approprié, y compris des gants et une blouse de laboratoire.
Recettes pour tampons, solutions et réactifs
1. Éthanols classés
  Éthanol – 160 mL 200 preuve EtOH et 40mL ddH₂O
  Éthanol – 140 mL 200 preuve EtOH et 60mL ddH₂O
2. Solution de récupération d’antigène
  10 mm de citrate de sodium, pH 6.0
3. Blocage du tampon
  Sérum de 100 L provenant d’un animal hôte à partir duquel l’anticorps secondaire a été fabriqué
  900 L 1X PBS
  Note: Il s’agit du volume pour 10 sections; ajuster le volume d’environ 100 l’amorti par section, au besoin.
4. Tampon de lavage (1X PBS)

2. Protocole

Réhydratation avec xylènes et éthanols
1. Placez les glissières dans un porte-diapositives, puis submergez les glissières dans la solution 100% Xylène isomers, en veillant à ce que les diapositives soient entièrement recouvertes de solution.
2. Incuber des glissières dans les isovers 100% Xylène pendant 3 min. Répétez deux fois pour un total de 3 incubations distinctes. Assurez-vous d’essuyer le porte-glisseur avec une serviette en papier avant de transférer à une nouvelle solution pour minimiser la contamination.
  Note: Il est recommandé que ces incubations soient effectuées dans trois contenants distincts.
3. Incuber les toboggans en 100% EtOH pendant 2 min. Répétez deux fois pour un total de 3 incubations distinctes.
  Note: Il est recommandé que ces incubations soient effectuées dans trois contenants distincts.
4. Incuber les toboggans en 95% EtOH pendant 2 min.
5. Incuber les toboggans en 80% EtOH pendant 2 min.
6. Incuber les toboggans en 70% EtOH pendant 2 min.
7. Incuber les diapositives en 1X PBS pendant 5 min.
(Facultatif) Récupération d’antigène pour démasquer les épitopes reconnus par l’anticorps primaire
Note 1 : Cette procédure dépend fortement de l’anticorps utilisé et il est recommandé que les procédures initiales d’optimisation soient effectuées pour déterminer l’exigence de récupération d’antigène.
Note 2 : Cette procédure n’a pas été effectuée avec la coloration F4/80 montrée ci-dessous. L’exigence de récupération d’antigène doit être optimisée avec chaque nouvel anticorps.
1. Placez les glissières dans un porte-glissière en plastique ou en verre résistant à la chaleur, et assurez-vous que la grille est remplie de glissières pour assurer une distribution uniforme de la chaleur. Des diapositives vierges peuvent être utilisées s’il y a moins d’échantillons que de fentes dans le rack.
2. Placez le support dans 1000 mL de solution antigène démasquée dans le bécher 2L – 10 mL d’antigène démasquant le stock à 990mL d’eau.
3. Cuire au micro-ondes à puissance élevée pendant 20 minutes au total, assurez-vous que les lames restent couvertes d’eau.
4. Refroidir les lames pendant 20 minutes dans le bécher.
5. Laver le toboggan dans des supports de glissière contenant ddH₂O pendant 5 min chacun. Répétez deux fois pour un total de 3 incubations distinctes à l’aide de ddH₂O frais à chaque fois. Les glissières peuvent être lavées dans le même porte-diapositive s’est lavée à chaque lavage.
6. Incuber les diapositives en 1X PBS pendant 5 min.
Cercle sections avec un stylo pap. Cela permettra l’utilisation d’un volume minimal de tampons nécessaires pour couvrir les sections de tissu. Ne laissez pas les sections de tissu se dessécher.
Ajouter un tampon de blocage à chaque section. La quantité de tampon nécessaire pour couvrir la section varie en fonction de la taille de la section, mais peut varier de 25 à 500 l. Un tampon suffisant devrait être utilisé pour former une perle qui couvre toute la surface de la section, y compris les bords.
Note: Le choix de la mémoire tampon de blocage peut varier en fonction de l’anticorps utilisé. Par exemple, 10 % de sérum de l’animal hôte dans lequel l’anticorps secondaire a été élevé peut être utilisé pour réduire la liaison non spécifique de l’anticorps secondaire (par exemple, le sérum de chèvre normal peut être utilisé si l’anticorps secondaire a été élevé dans la chèvre). L’optimisation du tampon de blocage doit être effectuée pour chaque anticorps primaire. Pour tacher les sections mammaires de tumeur avec F4/80, 0.1 ml de sérum normal de chèvre de 10% dans PBS a été employé.
Incuber les sections en bloquant le tampon dans une chambre humidifiée pendant 1 heure à température ambiante ou 4 oC jusqu’à 24 heures. La chambre humidifiée assure que les sections ne se dessèchent pas.
Retirez le tampon de blocage en le vidant de la glissière. Alternativement, le tampon de blocage peut être enlevé à l’aide d’une pipette, bien que prendre soin de ne pas toucher la section avec la pointe de pipette.
Diluer l’anticorps primaire en bloquant le tampon.
Note: La dilution correcte devra être déterminée pour chaque type d’anticorps et d’échantillon. L’optimisation comprendrait l’exécution d’une série de dilutions pour identifier les taches optimales. Pour tacher les sections mammaires de tumeur avec F4/80, des sections de tissu ont été incubées pendant la nuit à 4 oC dans l’anticorps anti-F4/80 de rat de 0.1 mL dilué 1:100 dans le sérum normal de chèvre de 1% dans PBS.
Ajouter l’anticorps primaire à chaque section et incuber dans une chambre humidifiée jusqu’à 16 heures (nuit) à 4 oC. Laissez au moins une section dans le tampon de blocage sans anticorps primaire pour servir de contrôle, ce qui aidera à identifier la liaison non spécifique par l’anticorps secondaire.
Égoutter l’anticorps primaire ou bloquer le tampon de la section, et laver les sections avec PBS en plaçant des diapositives dans un support de diapositives et en plaçant dans un support de diapositive avec 1x PBS. Laver 3 fois pendant 10 min à chaque fois.
Diluer l’anticorps secondaire 1:200 en bloquant le tampon. La dilution peut être optimisée en fonction de l’anticorps secondaire.
Ajouter l’anticorps secondaire à toutes les sections, y compris le contrôle, et couver pendant 1 heure dans une chambre humidifiée protégée de la lumière.
Égoutter l’anticorps secondaire des sections et laver 3 fois en PBS pendant 10 min à chaque fois.
Ajouter 2-3 gouttes de support de montage contenant DAPI sur les diapositives et placer un bordereau sur les échantillons. Si le support de montage n’est pas un type de milieu à séchage rapide, il peut être nécessaire de sceller les bords de la glissière avec de la cire de paraffine fondue ou du vernis à ongles pour prévenir les fuites et maintenir les échantillons à long terme.
Laissez les diapositives sécher toute la nuit dans l’obscurité et imagez les sections à l’aide d’un microscope fluorescent.

3. Analyse des données et résultats

Les sections tachées sont analysées à l’aide d’un microscope fluorescent. Les détails spécifiques de la capture et de l’analyse d’image dépendront des spécifications du microscope et du logiciel utilisé pour effectuer l’analyse. En règle générale, les images peuvent être prises comme des images en une seule couleur et superposées pour générer des images multicolores. Pourcentage de cellules positives peuvent être quantifiées en comptant le nombre de cellules tachées positivement et en divisant par le nombre total de cellules tachées de DAPI dans une section. Pour la coloration F4/80 des sections de tumeur mammaire, à l’aide du logiciel Leica Application Suite, version 3.8, sous l’onglet Acquire et en mode d’acquisition de la pariation d’images, DAPI et RFP ont tous deux été activés. L’exposition, le gain et le gamma ont été ajustés (20,0 ms, 1,0x et 1,53 respectivement pour le DAPI et 944,2 ms, 1,0x et 1,08 respectivement pour la DP), bien que cela varie d’une expérience à l’autre. Le bouton Acquire Overlay a été utilisé pour créer des images de la perceur des expositions DAPI et DFP.
L’image ci-dessous (Figure 1) montre un exemple d’image d’immunofluorescence d’une section tumorale tachée de F4/80, qui détecte un antigène sur les macrophages et autres cellules myéloïdes. La section a été montée à l’aide de supports de montage contenant du DAPI et les noyaux sont représentés en bleu.

La fonction d’une protéine dans une cellule dépend en grande partie de sa localisation appropriée dans la cellule. La microscopie d’immunofluorescence est une méthode par laquelle une protéine peut être visualisée à l’intérieur des cellules à l’aide de colorants fluorescents. Un colorant fluorescent est un fluorophore, c’est-à-dire une molécule qui absorbe l’énergie lumineuse à une longueur d’onde spécifique par un processus appelé excitation, puis libère immédiatement l’énergie à une longueur d’onde différente, connue sous le nom d’émission.

Les colorants fluorescents sont conjugués à un anticorps spécifique à la cible et introduits dans des cellules ou des tissus cultivés par immunostaining. Lorsque cet anticorps primaire se lie à la protéine d’intérêt, la protéine est étiquetée avec le colorant fluorescent. Alternativement, le colorant fluorescent peut être conjugué à un anticorps secondaire, au lieu de l’anticorps primaire, et l’anticorps secondaire se lie au complexe d’anticorps primaires protéiques pour étiqueter la cible. Après cela, l’échantillon est scellé dans un milieu de montage antifade pour préserver l’étiquetage de fluorescence et est ensuite prêt pour l’imagerie sur un microscope à fluorescence.

Un microscope à fluorescence est équipé d’une puissante source de lumière. Le faisceau lumineux passe d’abord à travers un filtre d’excitation, ce qui permet seulement à la lumière à la longueur d’onde d’excitation de passer à travers. La lumière d’excitation atteint alors un miroir spécialisé, appelé miroir dichroique ou un fendeur de faisceau, qui est conçu pour refléter sélectivement la longueur d’onde d’excitation vers une lentille objective. L’objectif concentre ensuite la lumière sur une petite région de l’échantillon. En atteignant l’échantillon, la lumière excite les fluorophores, qui émettent ensuite l’énergie lumineuse à une longueur d’onde différente. Cette lumière est transmise à travers la lentille objective au miroir dichroïque. Étant donné que la longueur d’onde d’émission est différente de la longueur d’onde d’excitation, le miroir dichroic permet à la lumière d’émission de passer à travers. Ensuite, il passe par un deuxième filtre, appelé filtre d’émission, qui élimine la lumière de toute autre longueur d’onde qui peut être présent. Après cela, les rayons lumineux atteignent maintenant l’oculaire ou la caméra, où ils présentent une image agrandie créée à partir de la lumière émise par les fluorophores spécifiques. Cette image représente l’emplacement de la protéine d’intérêt dans la cellule.

Les colorants fluorescents liant l’ADN sont souvent utilisés avec l’immunostaining pour étiqueter les noyaux comme point de référence dans les cellules. Plusieurs fluorophores différents, avec différentes longueurs d’onde d’émission d’excitation, peuvent être utilisés pour différentes protéines dans le même échantillon pour comparer la localisation des protéines.

Cette vidéo démontre la procédure pour la coloration immunofluorescente d’une protéine d’intérêt dans un échantillon de tissu suivi de l’imagerie de l’échantillon sur un microscope de fluorescence.

Avant de commencer le processus de coloration, les sections, qui ont été déshydratées pendant le processus d’intégration, doivent être réhydratées. Pour ce faire, d’abord, placez les diapositives dans un porte-diapositives, puis submergez complètement les diapositives dans des isores 100% Xlene. Laisser les glissières incuber pendant trois minutes. Ensuite, retirez les glissières du récipient, essuyez tout excès de Xylène avec un essuie-tout, et placez-les dans un nouveau bain de xylène dans un contenant frais, pendant trois minutes supplémentaires. Répétez cette incubation à chaque fois dans un nouveau récipient avec du xylène frais et essuyant les lames avec des essuie-tout avant de le transférer dans le nouveau récipient, pour un total de trois incubations. Ensuite, incubez les sections dans une série de solutions d’éthanol gradué, en commençant par 100% d’éthanol pendant deux minutes. Essuyez le toboggan à l’eau avec un essuie-tout et transférez les lames dans un nouveau contenant d’éthanol à 100 % pendant encore deux minutes. Poursuivre le cycle de lavage, essuyer l’excès d’éthanol avec un essuie-tout et transférer les glissières dans un nouveau bain, en suivant les concentrations indiquées d’éthanol pour le temps spécifié. Après le lavage final à l’éthanol, secouez la solution excédentaire et incubez les glissières en 1X PBS pendant cinq minutes.

Pour commencer le processus de coloration, d’abord, encerclez les sections avec un stylo PAP pour identifier la zone minimale que les tampons doivent couvrir. Une fois que les sections sont clairement marquées sur la diapositive, ajouter 100 microlitres de tampon de blocage à chaque diapositive, en veillant à couvrir toute la surface de la section. Une fois que les tissus sont recouverts d’un tampon de blocage, placez les glissières dans une chambre humidifiée. Laisser les toboggans incuber pendant une heure à température ambiante.

Après le temps d’incubation souhaité, retirez le tampon de blocage en le vidant de la glissière. Ensuite, diluer l’anticorps primaire en bloquant le tampon. Pour une dilution de 1:100, ajouter 990 microlitres de tampon de blocage à un tube centrifugeuse de 1,5 millilitre, suivi de 10 microlitres de l’anticorps primaire au même tube. Étiquetez une diapositive comme un contrôle, puis ajoutez 100 microlitres de tampon de blocage. Ce contrôle permettra d’identifier toute liaison non spécifique de l’anticorps secondaire. Maintenant, ajoutez 100 microlitres de tampon d’anticorps primaire aux diapositives restantes. Incuber les sections toute la nuit dans une chambre humidifiée à quatre degrés Celsius, dans l’obscurité.

Après l’incubation de nuit, retirez les sections de la chambre et videz l’anticorps primaire de chaque diapositive et du tampon de blocage du contrôle. Placez les glissières dans un toboggan, puis lavez-les trois fois en 1X PBS pendant dix minutes chacune. Pendant que les glissières se lavent en 1X PBS, diluez l’anticorps secondaire en bloquant le tampon. Pour une dilution de 1:200, ajouter 995 microlitres de tampon de blocage à un tube de 1,5 millilitre, suivi de cinq microlitres de l’anticorps secondaire au même tube. Ajoutez l’anticorps secondaire à toutes les sections, y compris le contrôle, et incuber pendant une heure dans une chambre humidifiée protégée de la lumière. Lorsque la minuterie retentit, retirez les diapositives de l’incubateur. Égoutter l’anticorps secondaire des sections. Une fois l’anticorps secondaire enlevé, placez les glissières dans un toboggan, puis submergez complètement les glissières en 1X PBS pendant 10 minutes, à l’abri de la lumière. Répétez ce lavage trois fois, en utilisant frais 1X PBS pour chaque lavage. Après les lavages, ajouter deux à trois gouttes de support de montage contenant d’Un DAPI à chaque diapositive et placer une feuille de verre sur les échantillons. Laissez les glissières sécher toute la nuit dans un endroit sombre avant d’imagerier les sections à l’aide d’une lunette fluorescente.

Pendant l’imagerie, les détails de la capture d’image dépendront du microscope spécifique et du logiciel disponible. Cependant, dans cet exemple particulier, le logiciel Leica Application Suite, Version 3. 8, est utilisé pour effectuer l’analyse. À l’aide de ce programme, cliquez sur l’onglet Acquérir et en mode Acquisition de la pariation d’images, activez à la fois DAPI et DFP. Ensuite, ajustez l’exposition, gain et Gamma pour le DAPI et la DFP, en prenant une première en utilisant les paramètres par défaut définis par le logiciel, puis en optimisant la luminosité en modifiant le temps d’exposition et le gain, en gardant à l’esprit que les paramètres optimaux minimaux sont souhaitable d’éviter la saturation de l’image et le photoblanchiment des échantillons. Gamma peut être modifié pour optimiser les zones plus sombres d’une image.

Une fois les paramètres ajustés, appuyez sur le bouton Acquire Overlay pour créer des images de overpose des expositions DAPI et DFP. Cet exemple d’image, capturée à l’aide de la technique démontrée, montre une section de tumeur mammaire de souris, tachée avec l’anticorps F4/80, qui détecte un antigène, représenté en rouge, sur des macrophages et d’autres cellules myéloïdes. Depuis que les supports de montage contenant du DAPI ont été utilisés, les noyaux sont représentés en bleu. Les données de l’imagerie fourniront des informations sur l’intensité et la localisation de la protéine dans la section tissulaire.

Par exemple, dans l’image de la tumeur souillée avec F4/80, la coloration de surface de cellules de cet antigène est observée. Ces données peuvent également fournir des informations sur la fréquence des populations cellulaires spécifiques dans la section tissulaire. Cela peut être quantifié en comptant le nombre de cellules tachées positivement, ici montré en rouge, et en comparant cela avec la population cellulaire totale, montrée en bleu, et en calculant la fréquence à l’aide de l’équation suivante.

Results

Figure 1: coloration F4/80 d’une section de tumeur mammaire. Après fixation, une tumeur mammaire de souris a été sectionnée et souillée avec anti-F4/80 et monté utilisant un support de montage DAPI-contenant. La coloration est montrée par la surface de la cellule F4/80 coloration en rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les données obtenues à partir de l’imagerie fourniront de l’information sur l’intensité et la localisation de l’expression de la protéine d’intérêt dans la section tissulaire. Selon la protéine examinée, ces données pourraient également fournir des informations sur la fréquence de populations cellulaires spécifiques dans la section tissulaire. Cela peut être quantifié en comptant le nombre de cellules tachées positivement et en comparant avec la population cellulaire totale.

Applications and Summary

L’immunofluorescence permet d’enquêter sur l’expression et la localisation des protéines dans le contexte d’une section tissulaire. Cette technique peut être utilisée pour comprendre comment les tissus changent dans le contexte de la maladie en examinant la localisation des protéines ou le nombre de cellules dans les tissus normaux et malades. Les changements dans la localisation ou dans les modèles d’expression peuvent être déterminés et liés à des attributs spécifiques des échantillons.

References

Im K, Mareninov S., Diaz MFP, Yong WH. An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Yong W. (eds) Biobanking. Methods in Molecular Biology. 1897, Humana Press, New York, NY (2019)
Ramos-Vara JA. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Gautier JC. (eds) Drug Safety Evaluation. Methods in Molecular Biology. 1641, Humana Press, New York, NY (2017)
Donaldson JG. Immunofluorescence Staining. Current protocols in Cell Biology. 69 (1):1 4.3.1-4.3.7. (2015)

Transcript

The function of a protein in a cell is largely dependent on its proper localization within the cell. Immunofluorescence microscopy is a method by which a protein can be visualized inside cells using fluorescent dyes. A fluorescent dye is a fluorophore, that is a molecule that absorbs light energy at a specific wavelength by a process called excitation, and then immediately releases the energy at a different wavelength, known as emission.

Fluorescent dyes are conjugated to a target-specific antibody and introduced into cultured cells or tissue by immunostaining. When this primary antibody binds to the protein of interest, the protein gets labeled with the fluorescent dye. Alternatively, the fluorescent dye can be conjugated to a secondary antibody, instead of the primary antibody, and the secondary antibody binds to the protein primary antibody complex to label the target. After that, the sample is sealed in an antifade mounting medium to preserve the fluorescence labeling and is then ready for imaging on a fluorescence microscope.

A fluorescence microscope is equipped with a powerful light source. The light beam first passes through an excitation filter, which allows only the light at the excitation wavelength to pass through. The excitation light then reaches a specialized mirror, called a dichroic mirror or a beam splitter, which is designed to selectively reflect the excitation wavelength towards an objective lens. The lens then focuses the light onto a small region in the sample. Upon reaching the sample, the light excites the fluorophores, which then emit the light energy at a different wavelength. This light is transmitted back through the objective lens to the dichroic mirror. Since the emission wavelength is different from the excitation wavelength, the dichroic mirror allows the emission light to pass through. Then, it goes through a second filter, called the emission filter, which eliminates light from any other wavelengths that may be present. After that, the light rays now reach the eyepiece or camera, where they present a magnified image created from the emitted light from the specific fluorophores. This image represents the location of the protein of interest within the cell.

DNA binding fluorescent dyes are often used along with immunostaining to label nuclei as a point of reference within the cells. Multiple different fluorophores, with different excitation emission wavelengths, can be used for different proteins within the same sample to compare localization of the proteins.

This video demonstrates the procedure for immunofluorescent staining of a protein of interest in a tissue sample followed by imaging the sample on a fluorescence microscope.

Before beginning the staining process, the sections, which were dehydrated during the embedding process, need to be rehydrated. To do this, first, place the slides into a slide holder and then completely submerge the slides in 100% Xlene isomers. Allow the slides to incubate for three minutes. Then, remove the slides from the container, wipe off any excess Xylene with a paper towel, and place them into a new Xylene bath in a fresh container, for a further three minutes. Repeat this incubation each time in a new container with fresh Xylene and wiping down the slides with paper towels before transferring to the new container, for a total of three incubations. Next, incubate the sections in a series of graded ethanol solutions, starting with 100% ethanol for two minutes. Wipe off the slide rack with a paper towel, and transfer the slides to a new container of 100% ethanol for another two minutes. Continue the cycle of washing, wiping excess ethanol with a paper towel, and transferring the slides to a new bath, following the indicated concentrations of ethanol for the specified time. After the final ethanol wash, shake off the excess solution and incubate the slides in 1X PBS for five minutes.

To begin the staining process, first, circle the sections with a PAP pen to identify the minimal area that the buffers need to cover. Once the sections are clearly marked on the slide, add 100 microliters of blocking buffer to each slide, making sure to cover the entire section surface. After the tissues are covered in blocking buffer, place the slides in a humidified chamber. Leave the slides to incubate for one hour at room temperature.

Following the desired incubation time, remove the blocking buffer by draining it off the slide. Next, dilute the primary antibody in blocking buffer. For a 1:100 dilution, add 990 microliters of blocking buffer to a 1.5 milliliter centrifuge tube, followed by 10 microliters of the primary antibody to the same tube. Label one slide as a control and then add 100 microliters of blocking buffer. This control will help identify any non-specific binding of the secondary antibody. Now, add 100 microliters of primary antibody buffer to the remaining slides. Incubate the sections overnight in a humidified chamber at four degrees celsius, in the dark.

Following the overnight incubation, remove the sections from the chamber and drain the primary antibody off each slide and the blocking buffer from the control. Place the slides into a slide rack and then wash them three times in 1X PBS for ten minutes each. While the slides are washing in 1X PBS, dilute the secondary antibody in blocking buffer. For a 1:200 dilution, add 995 microliters of blocking buffer to a 1.5 milliliter tube, followed by five microliters of the secondary antibody to the same tube. Add the secondary antibody to all of the sections, including the control, and incubate them for one hour in a humidified chamber protected from light. When the timer sounds, remove the slides from the incubator. Drain the secondary antibody off the sections. Once the secondary antibody is removed, place the slides in a slide rack and then completely submerge the slides in 1X PBS for 10 minutes, protected from light. Repeat this wash three times, using fresh 1X PBS for each wash. Following the washes, add two to three drops of mounting media containing DAPI to each slide and place a glass coverslip on the samples. Allow the slides to dry overnight in a dark place before imaging the sections using a fluorescent scope.

During imaging, the details of image capture will depend upon the specific microscope and software available. However, in this particular example, the software Leica Application Suite, Version 3. 8, is used to perform the analysis. Using this program, click on the Acquire tab and in Image Overlay Acquisition mode, enable both DAPI and RFP. Next, adjust the Exposure, Gain, and Gamma for both DAPI and RFP, by taking an initial using the default settings defined by the software, and then optimizing for brightness by modifying the exposure time and the gain, keeping in mind that minimal optimal settings are desirable to avoid image saturation and photobleaching of the samples. Gamma can be modified to optimize darker areas of an image.

Once the settings are adjusted, press the Acquire Overlay button to create overlay images of the DAPI and RFP exposures. This example image, captured using the demonstrated technique, shows a mouse mammary tumor section, stained with the antibody F4/80, which detects an antigen, depicted in red, on macrophages and other myeloid cells. Since DAPI-containing mounting media was used, nuclei are shown in blue. The data from the imaging will provide information regarding the intensity and localization of the protein within the tissue section.

For example, in the image of the tumor stained with F4/80, cell surface staining of this antigen is observed. These data can also provide information regarding the frequency of specific cell populations within the tissue section. This can be quantified by counting the number of positively stained cells, here shown in red, and comparing that with the total cell population, shown in blue, and calculating the frequency using the following equation.

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