What is a fluorophore and how does it work in immunofluorescence microscopy?

A fluorophore is a molecule that absorbs light energy at a specific wavelength through excitation, then immediately releases the energy at a different wavelength through emission. Fluorophores are conjugated to antibodies and introduced into tissue samples through immunostaining. When the antibody binds to the target protein, the fluorophore labels it, allowing visualization under a fluorescence microscope.

How does a fluorescence microscope separate excitation and emission light?

A fluorescence microscope uses specialized optical components to separate wavelengths. Excitation light passes through an excitation filter, then reflects off a dichroic mirror toward the objective lens, which focuses it on the sample. Emitted light from excited fluorophores returns through the objective and dichroic mirror, which allows only emission wavelengths to pass. An emission filter removes unwanted wavelengths before the image reaches the eyepiece or camera.

Why is rehydration necessary before immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue?

Tissue sections are dehydrated during the paraffin embedding process. Before staining, sections must be rehydrated through graded ethanol incubations and PBS washes to restore tissue hydration and prepare it for antibody binding. This step ensures proper antibody penetration and reduces non-specific binding during the immunostaining procedure.

What is the purpose of a blocking buffer in immunofluorescence staining?

Blocking buffer reduces non-specific binding of antibodies to the tissue section. The tissue is incubated with blocking buffer for one hour at room temperature before primary antibody application. This step prevents the antibody from binding to sites other than the target protein, improving staining specificity and reducing background fluorescence in the final image.

Why is a control slide included in immunofluorescence staining procedures?

A control slide is treated identically to experimental slides but receives only blocking buffer instead of primary antibody. This control helps identify any non-specific binding of the secondary antibody to the tissue. By comparing the control to experimental slides, researchers can distinguish true target protein localization from background fluorescence caused by non-specific antibody interactions.

How can multiple proteins be visualized simultaneously in a single tissue sample?

Multiple different fluorophores with distinct excitation and emission wavelengths can be used to label different proteins within the same sample. DNA binding fluorescent dyes like DAPI label nuclei as a reference point. By using multiple fluorophores, researchers can compare the localization of different proteins and analyze their spatial relationships within the tissue section.

What information can immunofluorescence imaging provide about tissue samples?

Immunofluorescence imaging provides data on protein intensity and localization within tissue sections, revealing cell type heterogeneity, activation of signaling pathways, and biomarker expression. Researchers can quantify the frequency of specific cell populations by counting positively stained cells and comparing them to the total cell population, calculated using a simple ratio equation.

Microscopie à fluorescence : coloration par immunofluorescence des sections de tissus inclus en paraffine

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1. Mise en place

Le protocole de coloration typique comporte les étapes suivantes :
1. Réhydrater les sections de tissu sur les diapositives à l'aide d'une série d'éthanols classés.
2. Incuber les sections tissulaires à l'aide d'un tampon de blocage, ce qui aidera à bloquer la liaison non spécifique de l'anticorps au tissu et à réduire la fluorescence de fond.
3. Suppression du tampon de blocage et incubation de la section dans l'anticorps primaire, au moment où l'anticorps liera sa cible peptide.
4. Enlever l'anticorps primaire et laver les sections abondamment dans un tampon de lavage.
5. Incuber les sections avec un anticorps secondaire pour permettre la liaison à l'anticorps primaire, si l'anticorps primaire n'est pas directement étiqueté avec un fluorophore et un anticorps secondaire est nécessaire.
6. Laver l'anticorps secondaire des diapositives.
7. Montage des diapositives dans des supports de montage et leur permettant de sécher avant la visualisation sur un microscope fluorescent.
Les articles suivants sont nécessaires : porte-diapositives (verre ou plastique), bocaux, pipettes, stylo pap, chambre humide, pochettes de couverture et supports de montage avec DAPI.
Xylène est utilisé pour la réhydratation des diapositives. Le xylène est dangereux et doit être utilisé dans une hotte de fumée avec PPE approprié, y compris des gants et une blouse de laboratoire.
Recettes pour tampons, solutions et réactifs
1. Éthanols classés
  Éthanol - 160 mL 200 preuve EtOH et 40mL ddH₂O
  Éthanol - 140 mL 200 preuve EtOH et 60mL ddH₂O
2. Solution de récupération d'antigène
  10 mm de citrate de sodium, pH 6.0
3. Blocage du tampon
  Sérum de 100 L provenant d'un animal hôte à partir duquel l'anticorps secondaire a été fabriqué
  900 L 1X PBS
  Note: Il s'agit du volume pour 10 sections; ajuster le volume d'environ 100 l'amorti par section, au besoin.
4. Tampon de lavage (1X PBS)

2. Protocole

Réhydratation avec xylènes et éthanols
1. Placez les glissières dans un porte-diapositives, puis submergez les glissières dans la solution 100% Xylène isomers, en veillant à ce que les diapositives soient entièrement recouvertes de solution.
2. Incuber des glissières dans les isovers 100% Xylène pendant 3 min. Répétez deux fois pour un total de 3 incubations distinctes. Assurez-vous d'essuyer le porte-glisseur avec une serviette en papier avant de transférer à une nouvelle solution pour minimiser la contamination.
  Note: Il est recommandé que ces incubations soient effectuées dans trois contenants distincts.
3. Incuber les toboggans en 100% EtOH pendant 2 min. Répétez deux fois pour un total de 3 incubations distinctes.
  Note: Il est recommandé que ces incubations soient effectuées dans trois contenants distincts.
4. Incuber les toboggans en 95% EtOH pendant 2 min.
5. Incuber les toboggans en 80% EtOH pendant 2 min.
6. Incuber les toboggans en 70% EtOH pendant 2 min.
7. Incuber les diapositives en 1X PBS pendant 5 min.
(Facultatif) Récupération d'antigène pour démasquer les épitopes reconnus par l'anticorps primaire
Note 1 : Cette procédure dépend fortement de l'anticorps utilisé et il est recommandé que les procédures initiales d'optimisation soient effectuées pour déterminer l'exigence de récupération d'antigène.
Note 2 : Cette procédure n'a pas été effectuée avec la coloration F4/80 montrée ci-dessous. L'exigence de récupération d'antigène doit être optimisée avec chaque nouvel anticorps.
1. Placez les glissières dans un porte-glissière en plastique ou en verre résistant à la chaleur, et assurez-vous que la grille est remplie de glissières pour assurer une distribution uniforme de la chaleur. Des diapositives vierges peuvent être utilisées s'il y a moins d'échantillons que de fentes dans le rack.
2. Placez le support dans 1000 mL de solution antigène démasquée dans le bécher 2L - 10 mL d'antigène démasquant le stock à 990mL d'eau.
3. Cuire au micro-ondes à puissance élevée pendant 20 minutes au total, assurez-vous que les lames restent couvertes d'eau.
4. Refroidir les lames pendant 20 minutes dans le bécher.
5. Laver le toboggan dans des supports de glissière contenant ddH₂O pendant 5 min chacun. Répétez deux fois pour un total de 3 incubations distinctes à l'aide de ddH₂O frais à chaque fois. Les glissières peuvent être lavées dans le même porte-diapositive s'est lavée à chaque lavage.
6. Incuber les diapositives en 1X PBS pendant 5 min.
Cercle sections avec un stylo pap. Cela permettra l'utilisation d'un volume minimal de tampons nécessaires pour couvrir les sections de tissu. Ne laissez pas les sections de tissu se dessécher.
Ajouter un tampon de blocage à chaque section. La quantité de tampon nécessaire pour couvrir la section varie en fonction de la taille de la section, mais peut varier de 25 à 500 l. Un tampon suffisant devrait être utilisé pour former une perle qui couvre toute la surface de la section, y compris les bords.
Note: Le choix de la mémoire tampon de blocage peut varier en fonction de l'anticorps utilisé. Par exemple, 10 % de sérum de l'animal hôte dans lequel l'anticorps secondaire a été élevé peut être utilisé pour réduire la liaison non spécifique de l'anticorps secondaire (par exemple, le sérum de chèvre normal peut être utilisé si l'anticorps secondaire a été élevé dans la chèvre). L'optimisation du tampon de blocage doit être effectuée pour chaque anticorps primaire. Pour tacher les sections mammaires de tumeur avec F4/80, 0.1 ml de sérum normal de chèvre de 10% dans PBS a été employé.
Incuber les sections en bloquant le tampon dans une chambre humidifiée pendant 1 heure à température ambiante ou 4 oC jusqu'à 24 heures. La chambre humidifiée assure que les sections ne se dessèchent pas.
Retirez le tampon de blocage en le vidant de la glissière. Alternativement, le tampon de blocage peut être enlevé à l'aide d'une pipette, bien que prendre soin de ne pas toucher la section avec la pointe de pipette.
Diluer l'anticorps primaire en bloquant le tampon.
Note: La dilution correcte devra être déterminée pour chaque type d'anticorps et d'échantillon. L'optimisation comprendrait l'exécution d'une série de dilutions pour identifier les taches optimales. Pour tacher les sections mammaires de tumeur avec F4/80, des sections de tissu ont été incubées pendant la nuit à 4 oC dans l'anticorps anti-F4/80 de rat de 0.1 mL dilué 1:100 dans le sérum normal de chèvre de 1% dans PBS.
Ajouter l'anticorps primaire à chaque section et incuber dans une chambre humidifiée jusqu'à 16 heures (nuit) à 4 oC. Laissez au moins une section dans le tampon de blocage sans anticorps primaire pour servir de contrôle, ce qui aidera à identifier la liaison non spécifique par l'anticorps secondaire.
Égoutter l'anticorps primaire ou bloquer le tampon de la section, et laver les sections avec PBS en plaçant des diapositives dans un support de diapositives et en plaçant dans un support de diapositive avec 1x PBS. Laver 3 fois pendant 10 min à chaque fois.
Diluer l'anticorps secondaire 1:200 en bloquant le tampon. La dilution peut être optimisée en fonction de l'anticorps secondaire.
Ajouter l'anticorps secondaire à toutes les sections, y compris le contrôle, et couver pendant 1 heure dans une chambre humidifiée protégée de la lumière.
Égoutter l'anticorps secondaire des sections et laver 3 fois en PBS pendant 10 min à chaque fois.
Ajouter 2-3 gouttes de support de montage contenant DAPI sur les diapositives et placer un bordereau sur les échantillons. Si le support de montage n'est pas un type de milieu à séchage rapide, il peut être nécessaire de sceller les bords de la glissière avec de la cire de paraffine fondue ou du vernis à ongles pour prévenir les fuites et maintenir les échantillons à long terme.
Laissez les diapositives sécher toute la nuit dans l'obscurité et imagez les sections à l'aide d'un microscope fluorescent.

3. Analyse des données et résultats

Les sections tachées sont analysées à l'aide d'un microscope fluorescent. Les détails spécifiques de la capture et de l'analyse d'image dépendront des spécifications du microscope et du logiciel utilisé pour effectuer l'analyse. En règle générale, les images peuvent être prises comme des images en une seule couleur et superposées pour générer des images multicolores. Pourcentage de cellules positives peuvent être quantifiées en comptant le nombre de cellules tachées positivement et en divisant par le nombre total de cellules tachées de DAPI dans une section. Pour la coloration F4/80 des sections de tumeur mammaire, à l'aide du logiciel Leica Application Suite, version 3.8, sous l'onglet Acquire et en mode d'acquisition de la pariation d'images, DAPI et RFP ont tous deux été activés. L'exposition, le gain et le gamma ont été ajustés (20,0 ms, 1,0x et 1,53 respectivement pour le DAPI et 944,2 ms, 1,0x et 1,08 respectivement pour la DP), bien que cela varie d'une expérience à l'autre. Le bouton Acquire Overlay a été utilisé pour créer des images de la perceur des expositions DAPI et DFP.
L'image ci-dessous (Figure 1) montre un exemple d'image d'immunofluorescence d'une section tumorale tachée de F4/80, qui détecte un antigène sur les macrophages et autres cellules myéloïdes. La section a été montée à l'aide de supports de montage contenant du DAPI et les noyaux sont représentés en bleu.

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Source : Thomas Chaffee¹, Thomas S. Griffith^2,3,4, et Kathryn L. Schwertfeger^1,3,4
¹ Département de médecine de laboratoire et de pathologie, Universit…