Techniques basées sur l'immunoprécipitation : purification des protéines endogènes à l'aide de billes d'agarose

1. Immunoprécipitation utilisant des perles d'agarose de protéine A/G PLUS

Préparation de lysate cellulaire

1. Centrifuger 10⁸ thymocytes dans un microcentrifugeà 13 000 tr/min pendant 3 min et retirer le supernatant.
   Note: Le nombre de cellules varie en fonction des niveaux d'expression de la protéine désirée et du type de cellule choisi.
2. Re-suspendre les cellules dans 500 'L tampon de lyse RIPA avec PMSF.
3. Perturber les cellules à l'aide de quelques impulsions rapides avec un vortex, puis aspirer le lysate à quelques reprises avec une aiguille de 25 G attachée à une seringue.
   Note: Évitez de créer des bulles. Utilisez une aiguille plus grande comme une aiguille 21G pour les plus grands types de cellules.
4. Incuber le lysate cellulaire sur la glace pendant 10 min.
5. Centrifuger le lysate à 13 000 tr/min pendant 15 min à 4 oC.
6. Transférer le supernatant dans un tube microcentrifuge frais et étiqueté.

Pré-dédouanement

7. Ajouter 20 perles d'agarose de protéines A/G PLUS et 1 g d'anticorps anti-isotype (ici, l'anticorps anti-isotype IgG1 de souris est utilisé), au lysate.
   Note: Le choix de l'anticorps isotype utilisé dépendra de l'anticorps protéique spécifique utilisé plus tard dans l'étape de traction.
8. Incuber le mélange de lysate sur un rotateur de centrifugeuse dans la chambre froide (4 oC) pendant 30 min.
9. Centrifugelifuger l'échantillon à 3200 tr/min pour 30 s à 4oC.
10. Transférer le supernatant prédéblant dans un tube microcentrifuge frais, étiqueté de 1,5 ml. Jeter la boulette.

Détermination de la concentration des protéines

11. Déterminez la concentration protéique du lysate cellulaire en effectuant un résultat d'exécution de Bradford.
12. Aliquot 1000 L Bradford Reagent en 7 tubes de microcentrifuge.
13. Ajouter les quantités suivantes de protéine Standard BSA (2 mg/mL) dans 6 des tubes (tableau 1).

Numéro de tube	Volume de BSA (L) (2 mg/mL)	Concentration de protéines (g/L)
1	0	0
2	1	2
3	2	4
4	3	6
5	4	8
6	5	10

Tableau 1 : Quantités standard de protéines BSA

14. Dans le tube de 7^e, ajouter 1 l de lysate pré-éclairci.
    Note: Pour s'assurer que la concentration de l'échantillon se situe dans la plage de détection d'analyse, préparez et analysez également une dilution de lysate de 1:2 ou 1:5.
15. Placer 200 l de chacun des 7 tubes dans des puits individuels d'une plaque à fond plat de 96 puits répétant chaque échantillon en triple.
16. Lire la plaque sur un lecteur de plaque à 595 nm.
17. Générez la courbe standard dans excel et calculez la concentration protéique du lysate pré-éclairci.

démolir

18. Étiquetez deux tubes microcentrifugefrais de 1,5 ml, l'un comme « contrôle » et l'autre comme « test », qui dans cet exemple est c-myc.
19. Placer 500 g de lysate pré-dédouané dans chacun de ces tubes.
    Note: La quantité de protéines utilisée ici dépendra de la quantité de protéines désirées pour être purifiée.
20. Apportez le volume total pour chaque tube jusqu'à 500 L à l'aide de tampon de lyse.
21. Ajouter 2 g d'anticorps anti-c-myc au tube du groupe d'essai et 2 anticorps anti-virus igG1 de souris à l'anticorps anti-myc.
    Remarque : La quantité d'anticorps dépendra de l'efficacité des anticorps et de la quantité de la protéine cible.
22. Incuber les tubes sur un rotateur dans la chambre froide (4 oC) pendant 2 h.
23. Ajouter 20 perles d'agarose de protéines A/G PLUS à chaque tube.
    Note: Il est conseillé d'utiliser des pointes de pipette avec la coupe d'extrémité pour empêcher des dommages aux perles.
24. Incuber sur un rotateur dans la chambre froide (4 oC) pendant la nuit.
    Note: Selon la protéine cible et l'efficacité des anticorps, cette étape peut varier de 1 h à la nuit.
25. Centrifuger les tubes à 3200 tr/min pour 30 s 4 oC pour tirer vers le bas les perles.
26. Aspirez le supernatant de chaque tube.
    Note: La protéine cible est maintenant liée aux perles.
27. Laver les perles deux fois à l'aide du PBS de 500 L 1X Dulbecco.
28. Centrifuger les tubes à 3200 tr/min pour 30 s 4oC.
    Note: Pour un lavage plus rigoureux, utilisez des tampons plus stricts, tels que RIPA.
29. Aspirez le tampon de chaque tube. À l'aide de pointes de gel, retirer les restes de tampon des perles et garder les perles sur la glace pour éliper la protéine.
    Note: Dans cet exemple, la protéine est éludée dans SDS-PAGE en cours d'exécution tampon en faisant bouillir les perles, pour l'analyse de tache occidentale. Cette approche convient à la vérification des résultats de la propriété intellectuelle ou à l'examen des interactions protéines-protéines. Pour d'autres applications en aval, telles que la purification des protéines pour l'analyse structurelle ou enzymatique, des systèmes plus sophistiqués, tels que les étiquettes d'épitope (drapeau-tag ou myc-tag) sont utilisés pour éviter l'élution de l'anticorps avec la protéine d'intérêt.

2. Vérification de la propriété intellectuelle par l'analyse western Blot

SDS-PAGE Electrophorésis:

1. Suspendre à nouveau les perles dans le colorant de chargement SDS-PAGE de 20 L contenant le mercapto-ethonol.
2. Faire bouillir les échantillons à 95 oC pendant 5 min.
3. Centrifuger les perles à 13 000 tr/min pour 10 s à température ambiante.
4. À l'aide de pointes de chargement de gel, épileverts soigneusement les échantillons obtenus à partir des perles et les charger dans des puits de 4-15% gradient SDS-PAGE gel.
5. En plus des échantillons, chargez une voie avec une échelle protéique ainsi qu'une voie avec le lysate pré-dédouané pour servir de contrôle de chargement.
6. Exécuter à 100 V jusqu'à ce que l'avant de teinture atteigne le fond du gel (1h).

Analyse Western Blot:

7. Faire sandwich western blot, en veillant à ce que la membrane PVDF est entre le gel et la cathode rouge.
8. Transfert pour 1 h à 100 V.
9. Placez la membrane dans un tampon de blocage de 5 ml à température ambiante pendant 1 h sur un rocher à un réglage bas, pour bloquer les sites de liaison protéique non spécifiques.
   Remarque : Les volumes de tampon de blocage, d'anticorps primaires, d'anticorps secondaires et de lavages peuvent devoir être augmentés pourles taches de plus grande taille.
10. Incuber la tache avec 5 mL d'anticorps anti-c-myc dans le tampon de blocage pendant la nuit à 4 oC sur le rocker à un réglage bas.
    Remarque : L'anticorps utilisé ici doit être différent de celui utilisé dans l'étapede traction .
11. Laver la tache 3-6 fois à l'aide de 5 mL de TTL avec chaque lavage étant de 5 min à température ambiante sur un rocker à un réglage bas.
12. Incuber la tache avec HRP-marqué anti-lapin anti-lapin chaîne secondaire chaîne de lumière dans le tampon de blocage, pour 1 h à température ambiante sur le rocker à un réglage bas.
    Note: Le choix de l'anticorps secondaire dépendra de l'anticorps primaire utilisé pour la tache occidentale. En outre, une chaîne légère secondaire spécifique est utilisé dans le protocole parce que la protéine cible est proche en poids moléculaire de la chaîne lourde de l'anticorps. Si la protéine cible est proche de 50kDa, utilisez une chaîne de lumière secondaire spécifique. Si la protéine cible est proche de 25kDa, l'utilisation etla chaîne lourde spécifique secondaire .
13. Laver la tache 3-6 fois à l'aide de 5 mL de TTL avec chaque lavage étant de 5 min à température ambiante sur un rocker à un réglage bas.
14. Retirer le liquide de la tache et tamponner le bord de la tache sur les lingettes de laboratoire pour enlever l'excès de liquide.
15. Couvrir la tache avec 1x réagent de détection chemiluminescente et couver pendant 1 min.
    Note: Les étapes suivantes doivent être effectuées en succession rapide car le réactif de détection est léger et sensible au temps.
16. Dab bord de tache sur les lingettes de laboratoire pour enlever le réactif de détection excédentaire.
17. Placez la tache sur la surface d'imagerie du plateau Imager.
    Note: Les taches chemiluminescentes peuvent également être visualisées à l'aidede film .
18. Image utilisant le «Programme Chemiluminescent» pour capturer plusieurs points de temps de 10 s à 5 min.
    Remarque : Le temps optimal peut changer en fonction de la quantité de protéines et de la qualité des anticorps.
19. Choisissez une image avec une visibilité optimale de la bande, puis exportez cette image.
20. Avant de déplacer la tache, prenez une photo de la tache à l'aide de l'imageur, pour capturer l'emplacement de l'échelle. Ensuite, exportez cette image aussi.
21. À l'aide d'un logiciel de préparation de diapositives (comme PowerPoint), alignez les bandes et les images de l'échelle pour former une seule image.