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Source: Susannah C. Shissler1, Tonya J. Webb1
1 Département de microbiologie et d'immunologie, Université du Maryland, Baltimore, MD 21201
L'immunoprécipitation (IP, également connue sous le nom d'un «pull-down» d'essais) est une technique largement utilisée qui a des applications dans une variété de domaines. Conçu pour la première fois en 1984, il a été affiné en 1988 (1, 2). L'objectif fondamental de la propriété intellectuelle est la purification et l'isolement d'une protéine spécifique à l'aide d'un anticorps contre cette protéine. Le mot «immuno» fait référence à l'utilisation d'un anticorps tandis que le mot «précipitation» fait référence à l'arrêt d'une substance spécifique d'une solution. La protéine cible peut être endogène ou recombinante. La plupart des protéines recombinantes ont une étiquette d'épitope (c.-à-d. myc ou drapeau) attachée à elles pour simplifier la purification suivante. Typiquement, il est plus facile d'optimiser la protéine recombinante IP parce que les anticorps contre les étiquettes d'épitope recombinant sont très forts et efficaces. Les anticorps contre les protéines endogènes ont une efficacité extrêmement variable - ce qui rend beaucoup plus difficile d'optimiser ces adresses IP. Une étape nécessaire après l'immunoprécipitation est la vérification de la purification. La protéine isolée est résolue à l'aide de SDS-PAGE et par la suite sondée pour la pureté par les taches occidentales (figure 1). Un contrôle important est l'utilisation d'un anticorps différent pendant la tache occidentale pour vérifier tirer vers le bas de la protéine correcte. La combinaison de la propriété intellectuelle avec les techniques suivantes est un outil d'analyse puissant. L'objectif après la purification peut être la caractérisation de la protéine elle-même par la RMN, la spectrométrie de masse et les essais in vitro, ou l'analyse des partenaires interagissant de la protéine (c.-à-d. protéine, ADN, ARN) (3, 4, 5).
Figure 1 : Aperçu de la procédure d'immunoprécipitation. L'immunoprécipitation est l'isolement d'une protéine spécifique à l'aide d'un anticorps. Après la production de lysate à partir de cellules, il y a deux étapes principales- pré-dédouanement et tirer vers le bas. Pendant l'étape de pré-dédouanement, les lysates cellulaires sont pré-dédouanés des protéines qui se lient aux anticorps non spécifiquement à l'aide d'un anticorps anti-isotype. Dans l'étape de traction vers le bas, la protéine cible est tirée vers le bas à l'aide d'un anticorps protéique spécifique. La protéine isolée est ensuite analysée par Western blot. Les anticorps isotypes et les anticorps protéiques spécifiques ont le même domaine constant, mais différents domaines de liaison d'antigène. Un composant clé de ce protocole est protein A/G perles d'agarose qui lient le domaine constant des anticorps- permettant l'immunoprécipitation de la protéine cible. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Les anticorps sont la composante clé d'une immunoprécipitation qui la différencie des autres formes de purification des protéines (c.-à-d. la purification de la colonne d'affinité au nickel). Les anticorps sont des molécules fabriquées par des cellules B qui peuvent reconnaître des épitopes protéiques spécifiques. Les anticorps ont deux domaines : constante (Fc) et liaison antigène (Fab) (figure 1). Le domaine constant identifie le type d'anticorps et dicte la fonction in vivo. Habituellement, les domaines constants des anticorps utilisés pour la propriété intellectuelle sont la souris, le rat ou le lapin IgG. La partie de liaison d'antigène de l'anticorps reconnaît un épitope spécifique d'une protéine spécifique. Les anticorps peuvent reconnaître les épitopes sur les protéines pliées qui peuvent ne pas exister lorsque la protéine est dénaturée et vice versa. Par conséquent, la disponibilité de l'épitope dépend du pliage des protéines - identifier un facteur important à considérer lors du choix des anticorps et des conditions pour la propriété intellectuelle.
Les systèmes procaryotes et eucaryotes ont des protéines liant les anticorps. Dans les systèmes eucaryotes, le but est la protection immunitaire contre les bactéries tandis que dans les systèmes procaryotes, le but est la protection contre le système immunitaire. Les protéines liant les anticorps affectent la méthodologie de la propriété intellectuelle de deux façons. Tout d'abord, il y a une étape nécessaire de pré-dédouanement (figure 1) pour débarrasser le lysate des protéines qui lient les anticorps - réduisant ainsi la liaison non spécifique dans le produit final. Cette étape utilise un anticorps isotype qui a le même domaine constant que, mais un domaine de liaison d'anticorps différent de votre anticorps spécifique aux protéines. Les protéines bactériennes liant les anticorps sont le deuxième composant clé de cette méthode. Après que l'anticorps protéique-spécifique lie la protéine cible, l'anticorps : complexe de protéine doit être tiré vers le bas (figure 1). Les protéines A, G et L sont des protéines bactériennes qui lient le domaine constant des anticorps. Alors que les bactéries l'utilisent pour subvertir le système immunitaire, les chercheurs ont coopté ce système pour la purification facile des anticorps, et il est utilisé à la fois pendant les étapes de pré-dédouanement et de traction. Ces protéines ont des affinités de liaison différentes pour différentes espèces et différents sous-types de domaine constants - un autre facteur à considérer lors du choix des conditions pour la propriété intellectuelle. De nombreuses entreprises vendent des perles d'agarose étiquetées Protéines A/G (figure 1), des colonnes de spin préfabriquées ou des résines pour fabriquer des colonnes. En général, les perles et les colonnes de spin sont utilisées pour de plus petites tailles d'échantillon tandis que les résines sont utilisées pour la purification en vrac.
Dans cet exercice de laboratoire, nous démontrons comment purifier la protéine endogène c-myc, des thymocytes murines primaires, utilisant la protéine A/G Plus agarose perles basées sur la technique d'immunoprécipitation de base. Le protocole commence à partir de la préparation du lysate cellulaire et se termine par la vérification de la protéine réussie tirer vers le bas en utilisant l'analyse de tache occidentale.
1. Immunoprécipitation utilisant des perles d'agarose de protéine A/G PLUS
Préparation de lysate cellulaire
Pré-dédouanement
Détermination de la concentration des protéines
| Numéro de tube | Volume de BSA (L) (2 mg/mL) | Concentration de protéines (g/L) |
| 1 | 0 | 0 |
| 2 | 1 | 2 |
| 3 | 2 | 4 |
| 4 | 3 | 6 |
| 5 | 4 | 8 |
| 6 | 5 | 10 |
Tableau 1 : Quantités standard de protéines BSA
démolir
2. Vérification de la propriété intellectuelle par l'analyse western Blot
SDS-PAGE Electrophorésis:
Analyse Western Blot:
L'immunoprécipitation, ou IP, est une technique largement utilisée pour isoler une protéine d'intérêt d'un lysate cellulaire ou tissulaire ou d'un liquide corporel pour la caractérisation des protéines ou pour étudier les interactions protéines-protéines.
Le processus commence par un anticorps, qui a une forte affinité et spécificité pour la protéine cible. Cet anticorps est mélangé à l'échantillon, ce qui permet aux complexes anticorps-cibles de se former. Toute protéine liée à la protéine cible est également indirectement attaché à l'anticorps dans le processus. Ensuite, la solution est incubée avec des perles d'agarose, conjuguées à une protéine bactérienne, qui a une forte affinité pour la région constante des anticorps. La protéine bactérienne se lie à l'anticorps et relie les complexes anticorps cibles aux perles. Ensuite, la solution est centrifugepour précipiter les perles, extrayant ainsi l'ensemble du complexe contenant l'anticorps liant, la protéine cible et toutes les protéines en interaction. Enfin, les protéines liées sont extraites des perles et libérées les unes des autres et sont utilisées pour une analyse plus approfondie par des techniques telles que le ballonnement occidental.
Plusieurs variantes de différentes parties de cette technique sont couramment utilisées, comme le pré-dédouanement, l'utilisation d'étiquettes peptidiques ou de perles magnétiques, ou l'analyse d'autres partenaires de liaison non protéiques. La propriété intellectuelle peut être précédée par une étape de pré-compensation, afin d'éliminer les protéines non spécifiques liant les anticorps dans l'échantillon et de minimiser l'arrière-plan. Il s'agit d'abord d'incuber l'échantillon avec des anticorps anti-isotypes, ce qui leur permet de se lier à ces protéines, puis d'utiliser des perles d'agarose pour précipiter les complexes. L'échantillon est alors prêt à passer à la propriété intellectuelle réelle.
Les balises Peptide sont utiles si un anticorps spécifique n'est pas disponible pour la propriété intellectuelle. Ici, la protéine cible peut être génétiquement modifiée pour contenir une étiquette d'épitope peptidique et un anticorps contre l'étiquette est capable de retirer la protéine d'intérêt. Les perles magnétiques sont souvent utilisées au lieu d'agarose pour précipiter la cible. Après s'être reliuté au complexe anticorps-cible, le tube d'échantillon est placé dans un champ magnétique fort, qui extrait les perles de la solution. Cela élimine le besoin de centrifugation et améliore la vitesse et la commodité.
L'immunoprécipitation est également utilisée pour l'étude de l'ADN ou des protéines liant esquimables par l'ARN et sont connues sous le nom d'immunoprécipitation de chromatine et d'immunoprécipitation d'ARN, respectivement. Ces variations sont utiles pour le dépannage et l'adaptation de la méthode pour différentes applications expérimentales. Dans cette vidéo, vous observerez comment pré-effacer un lysate cellulaire et effectuer l'immunoprécipitation pour extraire une protéine d'intérêt, suivie de l'analyse de tache occidentale pour valider l'expérience.
Pour commencer, placez les cellules pré-collectées dans un microcentrifugeet et tournez à 13 mille tr/min pendant trois minutes. Après le spin, retirez le supernatant, puis resuspendles les cellules en 500 microlitres de tampon de lyse RIPA avec PMSF. Maintenant, perturber les cellules en utilisant quelques impulsions rapides avec un vortex, puis aspirer le lysate à quelques reprises avec une aiguille de 25 jauges attachée à une seringue, en prenant soin d'éviter de créer des bulles. Placer les cellules sur la glace pendant 15 minutes. Après avoir incubé les échantillons sur la glace, centrifuger la lysation pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.
Étiquetez un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Après la rotation, transférer le supernatant dans le tube fraîchement étiqueté et jeter la pastille. Ensuite, pré-effacer le lysate des contaminants qui se lient non spécifiquement aux perles d'agarose ou à l'anticorps primaire en ajoutant 20 microlitres des perles de protéine A/G PLUS-agarose et un microgramme d'un anticorps de contrôle d'isotype au lysate, qui dans ce par exemple est une souris IgG1 isotype de contrôle. Incuber le tube sur un rotateur dans une chambre froide pendant 30 minutes. Après avoir fait tourner le lysate dans la chambre froide pendant 30 minutes, centrifuger l'échantillon à 3200 tr/min pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius. Retirez le tube de la centrifugeuse et transférez le supernatant pré-autorisé dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre étiqueté frais. Jeter la boulette.
Maintenant, déterminez la concentration en protéines du lysate cellulaire en effectuant un résultat d'exécution bradford. Étiquette sept 1. Tubes microcentrifugede de 5 millilitres un à six et échantillon et aliquot 1000 microlitres du réactif Bradford dans chaque tube. Six des tubes seront utilisés pour faire une courbe standard en ajoutant diverses quantités de quantités connues de BSA à chaque tube. Les montants à ajouter sont énumérés dans ce tableau. Dans le septième tube d'échantillon, ajouter un microlitre du lysate pré-éclairci. Placer 200 microlitres de chacun des sept tubes dans des puits individuels d'une plaque plate de 96 puits, en répétant chaque échantillon en triplette afin qu'il y ait trois colonnes de sept échantillons. Lisez la plaque sur un lecteur de plaque, à l'aide d'une longueur d'onde de 595 nanomètres. Après avoir créé une courbe standard dans Excel, calculer la concentration en protéines du lysate pré-éclairci.
Ensuite, étiquetez deux tubes microcentrifugede de 1,5 millilitre, l'un comme contrôle et l'autre comme test, qui dans cet exemple, sera l'anticorps c-myc. Placez 500 microgrammes du lysate pré-dédouané dans chacun de ces tubes, puis apportez le volume total pour chaque tube jusqu'à 500 microlitres à l'aide de tampon de lyse. Ensuite, ajoutez deux microgrammes de l'anticorps anti-c-myc au tube du groupe d'essai. Pour le contrôle, ajouter deux microgrammes de la souris IgG1 anticorps anti-isotype. Une fois que les anticorps sont ajoutés aux tubes, placez les échantillons sur un rotateur dans une chambre froide et incuber pendant deux heures. Maintenant, ajoutez les perles d'agarose. Pour ce faire, il est recommandé de couper l'extrémité d'une pointe de pipette, puis, à l'aide de cette pointe modifiée, ajouter 200 microlitres de la protéine A/ G PLUS-agarose perles à chaque tube. Incuber les tubes sur un rotateur dans la chambre froide pendant la nuit.
Après l'incubation, retirer les tubes du rotateur et faire tourner les lysates dans le microcentrifuge pour tirer vers le bas les perles. Une fois la rotation terminée, retirer les tubes de la centrifugeuse et aspirer le supernatant de chaque tube. Ensuite, lavez les perles à l'aide de 500 microlitres de 1X Dulbecco PBS. Placer les tubes dans un microcentrifugeet et faire tourner pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius. Après cela, retirez le supernatant. Répétez le lavage et la centrifugeuse marche une fois de plus pour un total de deux fois. Retirez les tubes de la microcentrifuge et aspirez le tampon de chaque tube. À l'aide de pointes de chargement de gel, retirer les restes de tampon des perles, en gardant les perles sur la glace pour éliper la protéine liée.
Dans cet exemple, la protéine est éludée dans le tampon de fonctionnement SDS-PAGE en faisant bouillir pour l'analyse de tache occidentale. Pour ce faire, resuspendre les perles dans 20 microlitres de colorant de chargement SDS-PAGE contenant du bêta-mercaptoéthanol, ou BME. Faire bouillir les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour dissocier les immunocomplexes des perles. Ensuite, centrifuger les perles à vitesse maximale pendant 10 secondes à température ambiante. Retirer les tubes de la microcentrifugeuse et les tenir dans une grille à température ambiante. À l'aide de pointes de chargement de gel, pipette soigneusement les échantillons des perles et les charger dans des puits d'un gel SDS-PAGE de gradient de 4 à 15 %. En plus des échantillons, chargez une voie avec une échelle protéique ainsi qu'une voie avec le lysate pré-dédouané pour servir de contrôle de chargement. Une fois le gel chargé, faire fonctionner le gel à 100 volts.
Après que l'avant de teinture a atteint le fond du gel, qui devrait prendre approximativement une heure, arrêter le gel et faire un sandwich de tache occidentale, s'assurant que la membrane de PVDF est entre le gel et la cathode. Placer le sandwich western dans l'appareil de transfert et transférer les protéines sur le gel à la membrane pendant une heure à 100 volts. Une fois le transfert terminé, placez la membrane en cinq millilitres de bloc pour empêcher les anticorps de se lier non spécifiquement à la membrane. Rock à un réglage bas pendant une heure à température ambiante. Lorsque la minuterie retentit, retirez le tampon de blocage. Ajouter cinq millilitres du tampon de blocage avec l'anticorps de détection à la membrane. Ici, un anticorps anti-c-myc, qui est différent de celui utilisé pour la traction vers le bas, est utilisé.
Incuber la tache pendant la nuit, à quatre degrés Celsius sur un rocker à un réglage bas. Après l'incubation, retirer l'anticorps et bloquer le tampon. Laver la tache, en utilisant cinq millilitres de TBST pendant cinq minutes à température ambiante, sur un rocker à un réglage bas. Cette étape de lavage doit être répétée deux à cinq fois pour un total de trois à six lavages, en utilisant du TBST frais pour chaque lavage. Ajouter cinq millilitres d'un à 1000 anticorps secondaires et bloquer tampon à la tache. Dans ce cas, l'anticorps secondaire est HRP-étiqueté anti-lapin chaîne de lumière. Incuber la tache sur un rocker à un réglage bas pour un notre à température ambiante. Ensuite, retirez le tampon et lavez la tache avec cinq millilitres de TBST. Incuber ce lavage sur un rocker à un réglage bas pendant cinq minutes à température ambiante. Répétez ce lavage pour un total de six à 12 lavages, chacun avec un frais de cinq millilitres de TBST. Retirer le lavage final en versant d'abord le liquide hors de la tache. Ensuite, à l'aide d'une pince à épiler, tamponner le bord de la tache sur une lingette de laboratoire pour enlever tout excès de liquide, puis placer la tache dans un récipient frais. Ensuite, couvrir la tache avec 1X Chemiluminescent Detection Reagent et couver pendant une minute.
En travaillant rapidement, tamponnez le bord de la tache sur une lingette de laboratoire pour enlever tout réactif de détection excédentaire, puis placez la tache sur la surface d'imagerie du plateau imageur. Image utilisant le programme Chemiluminescent pour capturer plusieurs points de temps de 10 à 30 secondes. Une fois la tache représentée, choisissez une image avec une visibilité optimale de la bande, puis exportez cette image. Avant de déplacer la tache, utilisez l'Imager pour prendre une photo de la tache pour capturer l'emplacement de l'échelle. Ensuite, exportez cette image aussi. Enfin, à l'aide d'un logiciel de préparation de diapositives, comme PowerPoint, alignez les bandes et les images de l'échelle pour former une image.
Cette image montre le résultat de tache occidentale pour l'immunoprécipitation du c-myc de protéine des cellules de thymocyte. De gauche à droite, les voies représentent le contrôle de l'isotype, l'IP c-myc et l'entrée de lysate pré-dédouanée. La voie à l'extrême droite est une image fusionnée de l'échelle de poids moléculaire. La bande forte, à environ 25 kilodaltons est de la chaîne de lumière et celui à 50 kilodaltons est de la chaîne lourde de l'anticorps de liaison et ne sont pas spécifiques à la propriété intellectuelle ou les échantillons. C-myc court environ 67 kilodaltons sur les taches occidentales et est généralement visible juste en dessous de la bande d'échelle de 75 kilodalton. Dans cette tache, la bande de c-myc est visible dans la deuxième voie mais absente dans la première voie, indiquant que l'anticorps IP a réussi à tirer vers le bas c-myc. Il n'y a pas de bande visible dans la voie de lysate pré-dédouanée, ce qui suggère que cette protéine a de faibles niveaux d'expression endogènes.
L’immunoprécipitation, ou IP, est une technique largement utilisée pour isoler une protéine d’intérêt à partir d’un lysat cellulaire ou tissulaire ou d’un liquide corporel pour la caractérisation des protéines ou pour étudier les interactions protéine-protéine.
Le processus commence avec un anticorps, qui a une affinité et une spécificité élevées pour la protéine cible. Cet anticorps est mélangé à l’échantillon, ce qui permet la formation de complexes anticorps-cible. Toute protéine liée à la protéine cible est également indirectement attachée à l’anticorps dans le processus. Ensuite, la solution est incubée avec des billes d’agarose, conjuguées à une protéine bactérienne, qui a une forte affinité pour la région constante des anticorps. La protéine bactérienne se lie à l’anticorps et relie les complexes anticorps-cible aux billes. Ensuite, la solution est centrifugée pour précipiter les billes, extrayant ainsi l’ensemble du complexe contenant l’anticorps de liaison, la protéine cible et toutes les protéines en interaction. Enfin, les protéines liées sont extraites des billes et libérées les unes des autres et sont utilisées pour une analyse plus approfondie par des techniques telles que le Western blot.
Plusieurs variantes de différentes parties de cette technique sont couramment utilisées, comme le pré-nettoyage, l’utilisation de marqueurs peptidiques ou de billes magnétiques, ou l’analyse d’autres partenaires de liaison non protéiques. L’IP peut être précédée d’une étape de pré-nettoyage, afin d’éliminer les protéines de liaison aux anticorps non spécifiques dans l’échantillon et de minimiser le bruit de fond. Il s’agit d’abord d’incuber l’échantillon avec des anticorps de contrôle des isotypes, ce qui leur permet de se lier à ces protéines, puis d’utiliser des billes d’agarose pour précipiter les complexes. L’échantillon est alors prêt à passer à l’adresse IP réelle.
Les marqueurs peptidiques sont utiles si un anticorps spécifique n’est pas disponible pour la propriété intellectuelle. Ici, la protéine cible peut être génétiquement modifiée pour contenir une étiquette d’épitope peptidique et un anticorps contre l’étiquette est capable d’extraire la protéine d’intérêt. Des billes magnétiques sont souvent utilisées à la place de l’agarose pour précipiter la cible. Après s’être lié au complexe anticorps-cible, le tube d’échantillon est placé dans un champ magnétique puissant, qui extrait les billes de la solution. Cela élimine le besoin de centrifugation et améliore la vitesse et la commodité.
L’immunoprécipitation est également utilisée pour l’étude des protéines de liaison à l’ADN ou à l’ARN et est connue sous le nom d’immunoprécipitation de la chromatine et d’immunoprécipitation de l’ARN, respectivement. Ces variations sont utiles pour le dépannage et l’adaptation de la méthode à différentes applications expérimentales. Dans cette vidéo, vous allez observer comment pré-éliminer un lysat cellulaire et effectuer une immunoprécipitation pour extraire une protéine d’intérêt, suivie d’une analyse par transfert Western pour valider l’expérience.
Pour commencer, placez les cellules pré-collectées dans une microcentrifugeuse et faites tourner à 13 mille tr/min pendant trois minutes. Après la rotation, retirer le surnageant puis remettre les cellules en suspension dans 500 microlitres de tampon de lyse RIPA avec PMSF. Maintenant, perturbez les cellules à l’aide de quelques impulsions rapides avec un vortex, puis aspirez le lysat plusieurs fois avec une aiguille de calibre 25 attachée à une seringue, en prenant soin d’éviter de créer des bulles. Placez les cellules sur de la glace pendant 15 minutes. Après avoir incubé les échantillons sur de la glace, centrifugez le lysat pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.
Étiquetez un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Après l’essorage, transférez le surnageant dans le tube fraîchement étiqueté et jetez la pastille. Ensuite, pré-débarrassez le lysat des contaminants qui se lient de manière non spécifique aux billes d’agarose ou à l’anticorps primaire en ajoutant 20 microlitres de billes d’agarose de la protéine A/G PLUS et un microgramme d’un anticorps de contrôle d’isotype au lysat, qui dans cet exemple est un contrôle d’isotype IgG1 de souris. Incuber le tube sur rotateur dans une chambre froide pendant 30 minutes. Après avoir fait tourner le lysat dans la chambre froide pendant 30 minutes, centrifugez l’échantillon à 3200 tr/min pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius. Retirez le tube de la centrifugeuse et transférez le surnageant pré-autorisé dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre fraîchement étiqueté. Jetez la pastille.
Maintenant, déterminez la concentration en protéines du lysat cellulaire en effectuant un test de Bradford. Étiquette sept 1. Tubes de microcentrifugation de 5 millilitres de un à six et échantillonner et aliquoter 1000 microlitres de réactif Bradford dans chaque tube. Six des tubes seront utilisés pour faire une courbe standard en ajoutant diverses quantités de quantités connues de BSA à chaque tube. Les montants à ajouter sont indiqués dans ce tableau. Dans le septième tube d’échantillon, ajoutez un microlitre de lysat pré-autorisé. Placez 200 microlitres de chacun des sept tubes dans des puits individuels d’une plaque à fond plat de 96 puits, en répétant chaque échantillon en trois exemplaires de sorte qu’il y ait trois colonnes de sept échantillons. Lire la plaque sur un lecteur de plaques, en utilisant une longueur d’onde de 595 nanomètres. Après avoir créé une courbe standard dans Excel, calculez la concentration en protéines du lysat pré-autorisé.
Ensuite, étiquetez deux tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre, l’un comme contrôle et l’autre comme test, qui dans cet exemple, sera l’anticorps c-myc. Placez 500 microgrammes de lysat pré-autorisé dans chacun de ces tubes, puis portez le volume total de chaque tube à 500 microlitres à l’aide d’un tampon de lyse. Ensuite, ajoutez deux microgrammes de l’anticorps anti-c-myc dans le tube du groupe de test. Pour le contrôle, ajoutez deux microgrammes de l’anticorps de contrôle de l’isotype IgG1 de la souris. Une fois les anticorps ajoutés dans les tubes, placez les échantillons sur un rotateur dans une chambre froide et incubez pendant deux heures. Maintenant, ajoutez les perles d’agarose. Pour ce faire, il est recommandé de couper l’extrémité d’une pointe de pipette puis, à l’aide de cette pointe modifiée, d’ajouter 200 microlitres de billes d’agarose Protein A/G PLUS-dans chaque tube. Incuber les tubes sur un rotateur dans la chambre froide pendant la nuit.
Après l’incubation, retirez les tubes du rotateur et faites tourner les lysats dans la microcentrifugeuse pour tirer les billes vers le bas. Une fois l’essorage terminé, retirez les tubes de la centrifugeuse et aspirez le surnageant de chaque tube. Ensuite, lavez les perles à l’aide de 500 microlitres de 1X Dulbecco’s PBS. Placez les tubes dans une microcentrifugeuse et faites-les tourner pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius. Ensuite, retirez le surnageant. Répétez les étapes de lavage et de centrifugation une fois de plus pour un total de deux fois. Retirez les tubes de la microcentrifugeuse et aspirez le tampon de chaque tube. À l’aide d’embouts de chargement de gel, retirez tout tampon restant des billes, en gardant les billes sur de la glace pour éluer la protéine liée.
Dans cet exemple, la protéine est éluée dans le tampon de fonctionnement SDS-PAGE par ébullition pour l’analyse par transfert Western. Pour ce faire, mettez les billes en suspension dans 20 microlitres de colorant de chargement SDS-PAGE contenant du bêta-mercaptoéthanol, ou BME. Faites bouillir les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour dissocier les immunocomplexes des billes. Ensuite, centrifugez les billes à vitesse maximale pendant 10 secondes à température ambiante. Retirez les tubes de la microcentrifugeuse et conservez-les dans une grille à température ambiante. À l’aide d’embouts de chargement de gel, pipeter soigneusement les échantillons des billes et les charger dans des puits d’un gradient de 4 à 15 % de gel SDS-PAGE. En plus des échantillons, chargez une voie avec une échelle de protéines ainsi qu’une voie avec le lysat pré-autorisé pour servir de contrôle de chargement. Une fois le gel chargé, faites-le fonctionner à 100 volts.
Une fois que le front de colorant a atteint le bas du gel, ce qui devrait prendre environ une heure, arrêtez le gel et faites un sandwich Western blot, en vous assurant que la membrane PVDF se trouve entre le gel et la cathode. Placez le sandwich Western blot dans l’appareil de transfert et transférez les protéines sur le gel à la membrane pendant une heure à 100 volts. Une fois le transfert terminé, placez la membrane dans cinq millilitres de bloc pour empêcher les anticorps de se lier de manière non spécifique à la membrane. Basculez-vous à basse température pendant une heure à température ambiante. Lorsque la minuterie sonne, retirez le tampon de blocage. Ajoutez cinq millilitres de tampon de blocage avec l’anticorps de détection à la membrane. Ici, un anticorps anti-c-myc, différent de celui utilisé pour le pull-down, est utilisé.
Incuber le blot pendant la nuit, à quatre degrés Celsius sur un rocker à basse température. Après l’incubation, retirez l’anticorps et le tampon de blocage. Lavez le tampon à l’aide de cinq millilitres de TBST pendant cinq minutes à température ambiante, sur une bascule à basse température. Cette étape de lavage doit être répétée deux à cinq fois pour un total de trois à six lavages, en utilisant du TBST frais pour chaque lavage. Ajoutez cinq millilitres d’un à 1000 anticorps secondaires et un tampon de blocage au transfert. Dans ce cas, l’anticorps secondaire est une chaîne légère anti-lapin marquée HRP. Incuber le blot sur une bascule à basse température pour l’un ou l’autre à température ambiante. Ensuite, retirez le tampon et lavez le tampon avec cinq millilitres de TBST. Incuber ce lavage sur une bascule à basse température pendant cinq minutes à température ambiante. Répétez ce lavage pour un total de six à 12 lavages, chacun avec cinq millilitres de TBST. Retirez le lavage final en versant d’abord le liquide du tampon. Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler, tamponnez le bord de la tache sur une lingette de laboratoire pour éliminer tout excès de liquide, puis placez la tache dans un récipient frais. Ensuite, couvrez le transfert avec 1X Réactif de détection chimiluminescent et incubez pendant une minute.
En travaillant rapidement, tamponnez le bord du transfert sur une lingette de laboratoire pour éliminer tout excès de réactif de détection, puis placez le transfert sur la surface d’imagerie du plateau de l’imageur. Image à l’aide du programme chimiluminescent pour capturer plusieurs points temporels de 10 à 30 secondes. Une fois l’imagerie du transfert obtenue, choisissez une image avec une visibilité de bande optimale, puis exportez-la. Avant de déplacer le transfert, utilisez l’imageur pour prendre une photo du transfert afin de capturer l’emplacement de l’échelle. Ensuite, exportez également cette image. Enfin, à l’aide d’un logiciel de préparation de diapositives, tel que PowerPoint, alignez les bandes et les images de l’échelle pour former une seule image.
Cette image montre le résultat du transfert Western pour l’immunoprécipitation de la protéine c-myc à partir des cellules thymocytaires. De gauche à droite, les voies représentent le contrôle de l’isotype, l’IP c-myc et l’entrée de lysat pré-autorisée. La voie à l’extrême droite est une image fusionnée de l’échelle de poids moléculaire. La bande forte, d’environ 25 kilodaltons, provient de la chaîne légère et celle de 50 kilodaltons, de la chaîne lourde de l’anticorps de liaison et n’est pas spécifique à l’IP ou aux échantillons. C-myc pèse environ 67 kilodaltons sur les transferts Western et est généralement visible juste en dessous de la bande de l’échelle de 75 kilodaltons. Dans cette tache, la bande c-myc est visible dans la deuxième voie, mais absente dans la première, ce qui indique que l’anticorps IP a réussi à abattre c-myc. Il n’y a pas de bande visible dans la voie de lysat pré-autorisée, ce qui suggère que cette protéine a de faibles niveaux d’expression endogènes.
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