Courbes de croissance : Générer des courbes de croissance en comptant les unités formant colonies (UFC) et en mesurant l'absorbance

1. Mise en place

1. Matériaux de laboratoire requis : supports liquides, supports en agar solidifiés, flacons Erlenmeyer, tubes à essai de 15 ml, salin tamponné par phosphate (PBS), épandeur de cellules bactériennes, éthanol à 70 % et spectrophotomètre. Toutes les solutions et verrerie doivent être stérilisées avant utilisation.
2. Préparer le poste de travail en stérilisant avec 70% d'éthanol. Travaillez près d'un brûleur Bunsen pour prévenir la contamination des médias.
3. Lorsque vous travaillez avec des bactéries, un équipement de protection individuelle approprié et une technique aseptique doivent être utilisés. Une blouse de laboratoire et des gants sont nécessaires lorsque vous travaillez avec des cultures bactériennes.
4. Recettes pour tampons, solutions et réactifs
   1. Saline tamponnée de phosphate (PBS) (8).
   2. Luria-Bertani Broth (LB) (9).

2. Protocole

1. Préparation des médias
   1. Identifiez le support de croissance avec lequel développer les bactéries et préparez à la fois le bouillon liquide et l'agar solide (1,5% w/v agar) dans des bouteilles autoclavables séparées. Ici, bouillon LB et agar LB ont été préparés pour la croissance d'Escherichia coli.
   2. Stériliser les supports avec un bouchon semi-serré dans un autoclave réglé à 121 oC pendant 35 min.
   3. Pour les supports d'agar, après l'autoclage, placer dans un bain d'eau réglé à 50 oC pendant 30 minutes pour refroidir. Une fois refroidi, verser 20-25 ml de support d'agar dans des plats Petri circulaires de 100x15 mm. Laisser les assiettes être fixées 24 heures à température ambiante avant de les utiliser.
2. Préparation initiale des bactéries
   1. À partir de bouillons congelés, les bactéries stries pour l'isolement sur l'agar média sélectionné pour obtenir des isolats de colonie unique. Incuber dans des conditions de croissance permises pour les bactéries choisies. Ici, E. coli est strié sur l'agar LB et est incubé à 37 oC pendant la nuit (16-18h).
   2. À l'aide d'une boucle d'inoculation stérile, sélectionnez une seule colonie à partir de la plaque de stries et inoculez 4 ml de support liquide dans un tube à essai de 15 ml et développez dans des conditions permises pour les bactéries choisies. Ici, E. coli est cultivé à 37 oC avec des secousses à 210 tr/min pendant la nuit (16-18h).
3. Configuration de la courbe de croissance
   1. Préparation de flacon de croissance
      1. Autoclave flacons Erlenmeyer de taille appropriée. Typiquement, un rapport de 1:5 de médias au volume total de flacon est utilisé. Ici, un support LB de 100 ml est utilisé dans un flacon de 500 ml.
      2. À l'aide d'une pipette sérologique, transférer les supports stériles sur le flacon Erlenmeyer.
   2. Préparation de la série de dilution
      1. Étiqueter les tubes à essai de 15 mL : -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 et -9, en distribuant 9mL PBS dans chacun. Ces chiffres correspondent au facteur de dilution utilisé pour calculer l'UFC/mL. Un nouvel ensemble de tubes est nécessaire pour chaque point de collecte. (Figure 2)
   3. Préparation de plaque d'agar
      1. Étiquette des plaques avec le temps de collecte et le facteur de dilution. Pour chaque point de temps, il y aura une plaque pour chaque dilution.
4. Protocole de courbe de croissance
   1. Inoculation des médias
      1. En utilisant la culture liquide de nuit préparée dans le cadre de l'étape 2.2.2, inoculer les médias flasques avec 1:1000 volume de culture. Ici, la culture liquide de nuit de 100 l est ajoutée aux supports LB de 100 ml.
      2. Faites tourbillonner les médias pour répartir uniformément les bactéries.
   2. Collection Timepoint
      1. Configuration de l'état de croissance
         1. Placez le flacon dans des conditions de croissance expérimentales choisies pour les bactéries données. Les points temporels doivent être pris fréquemment pour les bactéries à croissance rapide et peuvent être pris à intervalles plus longs pour les bactéries à croissance lente. Ici, E. coli est cultivé à 37oC avec des secousses à 210 tours par minute (rpm) et des chronopoints pris toutes les 1 heure.
      2. Mesure de la densité optique (OD600)
         1. À chaque point de temps, y compris le point de départ (t ' 0), retirez 1 ml de culture bactérienne et distribuez dans une cuvette spectrophotomètre.
         2. Essuyez la cuvette propre et enregistrez la densité optique à 600 nm longueur d'onde. Si la lecture de densité optique est supérieure à 1,0, diluer 100 L de culture 1:10 avec 900 'L de nouveaux médias, enregistrer la densité optique, et multiplier cette valeur par 10 pour la mesure OD600.
      3. Mesure de l'unité de formation de colonies (CFU/mL)
         1. À chaque moment, retirer 1 ml de culture bactérienne et de distribuer dans le tube à essai en verre -1 contenant 9 ml de PBS.
         2. Pour la série de dilution, transférer en série 1 mL du tube -1 vers le bas tous les tubes de dilution à la -9, vortexing après chaque transfert. (Figure 2)
         3. Pour chaque dilution, distribuez 100 l de suspension cellulaire à la plaque d'agar solide de médias étiquetée en conséquence. (Figure 2)
         4. À l'aide d'un épandeur cellulaire qui a été stérilisé dans l'éthanol, passé à travers une flamme de brûleur Bunsen, et refroidi en touchant la surface de l'agar, répandre les 100 L de suspension cellulaire jusqu'à ce que la surface de la plaque d'agar devient sèche.
         5. Incuber les plaques de propagation à l'envers à une température qui favorise la croissance des bactéries. Ici, E. coli est incubé à 37oC.
         6. Après l'incubation, une fois les colonies visibles surgissent, comptez le nombre de colonies bactériennes sur chaque plaque et enregistrez ces valeurs ainsi que leur facteur de dilution associé pour toutes les plaques à chaque point de temps.

3. Analyse des données et résultats

1. Densité optique (OD600) Courbe de croissance Terrain
   1. Tracer la densité optique (OD600) par rapport au temps sur une échelle semi-log. (Figure 3)
2. Parcelle de courbe de croissance de l'unité de formation des colonies (CFU/mL)
   1. Pour chaque point de temps, choisissez la plaque de dilution où le nombre de colonies se situe dans la fourchette de 30 à 300 bactéries. Multipliez le nombre de nombres de colonies par le facteur de dilution, puis par 10, car l'écart de 100 L est considéré comme une dilution supplémentaire de 1:10 lors du calcul de l'UFC/mL.
      
   2. Tracer la colonie formant des unités par rapport au temps sur une échelle semi-log. (Figure 4)
3. Liaison de la densité optique et des unités de formation de colonies
   1. Tracer la colonie formant des unités par rapport à la densité optique sur une échelle linéaire pour les lectures OD600 inférieures ou égales à 1,0 OD600 car la relation entre OD600 et CFU/mL est moins précise au-delà de 1,0 OD600. Ici, les six premiers chronopoints sont tracés. (Figure 5)
   2. Générer une ligne de tendance de régression linéaire affichant l'équation et la valeur R^2.
4. Déterminer le temps de doublement des bactéries
   1. À l'aide de la parcelle de courbe de croissance de l'unité de formation de la colonie, pendant la phase exponentielle, identifiez deux points sur le graphique avec la pente la plus raide entre eux pour calculer le temps de doublement.
   2. Calcul du temps de doublement
      1. 
      2. Temps t₂ - t₁, où t₁ - Timepoint 1 et t₂ - Timepoint 2
      3. , où b - nombre de bactéries à t₂, B - nombre de bactéries à t₁, et n - nombre de générations. Dérivé de: .
      4. Calculez le temps de doublement en utilisant :