Courbes de croissance : Générer des courbes de croissance en comptant les unités formant colonies (UFC) et en mesurant l'absorbance

Les bactéries se reproduisent par un processus appelé division cellulaire, qui donne deux cellules filles identiques. Si les conditions de croissance sont favorables, les populations bactériennes augmenteront de manière exponentielle.

Les courbes de croissance bactérienne tracent la quantité de bactéries dans une culture en fonction du temps. Une courbe de croissance typique progresse en quatre étapes : la phase de latence, la phase exponentielle, la phase stationnaire et la phase de mort. La phase de latence est le temps qu’il faut aux bactéries pour atteindre un état où elles peuvent se développer et se diviser rapidement. Après cela, les bactéries passent à la phase exponentielle, caractérisée par une croissance et une division cellulaires rapides. Le taux de croissance exponentielle de la culture bactérienne au cours de cette phase peut être exprimé comme le temps de doublement, le taux le plus rapide auquel les bactéries peuvent se reproduire dans des conditions spécifiques. Vient ensuite la phase stationnaire, où la croissance des cellules bactériennes plafonne et où les taux de croissance et de mort s’équilibrent en raison de l’épuisement des nutriments environnementaux. Enfin, les bactéries entrent dans la phase de mort. C’est là que la croissance bactérienne diminue fortement et que l’épuisement sévère des nutriments conduit à la lyse des cellules.

Deux techniques peuvent être utilisées pour quantifier la quantité de bactéries présentes dans une culture et tracer une courbe de croissance. La première d’entre elles est via les unités formant des colonies, ou UFC. Pour obtenir des UFC, une série de un à dix de neuf dilutions est effectuée à des points temporels réguliers. La première de ces dilutions, négative dans cet exemple, contient 9 ml de PBS et 1 ml de culture bactérienne. Ce qui donne un facteur de dilution de 1:10. Ensuite, 1 ml de cette solution est transféré dans le tube suivant, moins deux, ce qui donne un facteur de dilution de 1:100. Ce processus se poursuit à travers le dernier tube, moins neuf, ce qui donne un facteur de dilution final de 1:1 milliard. Après cela, 100 microlitres de chaque dilution sont plaqués. Les plaques sont ensuite incubées et les colonies clonales sont comptées. La plaque de dilution pour un point temporel donné qui croît entre 30 et 300 colonies est utilisée pour calculer les UFC par millilitre pour ce point temporel.

La deuxième méthode courante de mesure de la concentration bactérienne est la densité optique. La densité optique d’une culture peut être mesurée instantanément, par rapport à un blanc de milieu, à l’aide d’un spectrophotomètre. Généralement, une longueur d’onde de 600 nanomètres, également appelée OD600, est utilisée pour ces mesures, qui augmentent à mesure que la densité cellulaire augmente. Bien que la densité optique soit moins précise que celle des UFC, elle est pratique car elle peut être obtenue instantanément et nécessite relativement peu de réactifs. Les deux techniques peuvent être utilisées ensemble pour créer une courbe standard qui se rapproche plus précisément du nombre de cellules bactériennes d’une culture. Dans cette vidéo, vous apprendrez comment obtenir des mesures d’UFC et de DO 600 à partir de dilutions en série chronométrées d’E. coli. Ensuite, deux courbes de croissance utilisant respectivement les mesures CFU et OD600 seront tracées avant d’être reliées par une courbe standard.

Lorsque vous travaillez avec des bactéries, il est important d’utiliser l’équipement de protection individuelle approprié tel qu’une blouse de laboratoire et des gants et d’observer la technique d’asepsie appropriée.

Après cela, stérilisez le poste de travail avec de l’éthanol à 70 %. Tout d’abord, préparez le bouillon LB et le milieu gélosé solide LB dans des bouteilles autoclavables séparées. Après avoir partiellement fermé les bouchons des bouteilles, stérilisez le milieu dans un autoclave réglé à 121 degrés Celsius pendant 35 minutes. Ensuite, laissez refroidir le milieu gélosé dans un bain-marie réglé à 50 degrés Celsius pendant 30 minutes. Une fois refroidi, verser 20 à 25 mL dans chaque boîte de Pétri. Après cela, laissez les assiettes prendre pendant 24 heures à température ambiante.

Pour préparer les isolats d’une seule colonie qui seront plus tard utilisés pour produire une culture bactérienne liquide, utilisez du stock préalablement congelé et une technique de placage de stries appropriée pour strier E. coli en vue de son isolement sur une gélose LB. Incuber le plat à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après cela, refroidissez une boucle d’inoculation stérilisée à la flamme sur la gélose avant de sélectionner une seule colonie dans la plaque striée. Inocuculer 4 mL de milieu liquide dans un tube à essai de 15 mL. Ensuite, faites pousser E. coli à 37 degrés Celsius pendant la nuit en secouant à 210 tr/min.

Pour mettre en place le volume de culture bactérienne de 1:1000 qui sera utilisé dans la courbe de croissance, procurez-vous d’abord un erlenmeyer autoclavé de 500 ml. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique de 50 ml, transférer 100 ml de milieu stérile dans le ballon. Ensuite, étiquetez neuf tubes à essai de 15 ml consécutivement de un à neuf. Ces nombres correspondent au facteur de dilution qui sera utilisé pour calculer l’unité formant colonie, ou UFC. Ensuite, ajoutez 9 ml de 1X PBS dans chaque tube. Après cela, étiquetez les plaques de gélose préparées avec les points temporels et les facteurs de dilution correspondants qui seront cultivés. Dans cet exemple avec E. coli, après le point de départ de l’heure, les points de temps sont pris une fois toutes les heures. À l’aide de la culture liquide d’E. coli préalablement préparée pendant la nuit, inoculer le milieu dans l’erlenmeyer de l’autoclave de 500 ml avec un volume de culture de 1:1000. Faites tourner le milieu pour répartir uniformément les bactéries.

Après avoir obturé un spectrophotomètre, nettoyez la cuvette avec une lingette non pelucheuse. Ensuite, versez 1 mL de la culture dans la cuvette et placez-la dans le spectrophotomètre pour obtenir la densité optique de la culture au point zéro. Ensuite, cultivez E. coli à 37 degrés Celsius en secouant à 210 tr/min. À chaque point temporel après point zéro, prélever 1 mL supplémentaire de culture bactérienne du flacon et répéter la mesure de la densité optique. Si la densité optique est supérieure à 1,0, diluez 100 microlitres de culture bactérienne avec 900 microlitres de milieu frais, puis mesurez à nouveau la densité optique. Cette valeur peut être multipliée par 10 pour la mesure OD 600.

Pour obtenir la mesure de l’unité formant colonie pour chaque point temporel, prélever 1 mL supplémentaire de culture bactérienne du flacon à chaque point temporel. Distribuez la culture bactérienne dans le négatif un tube à essai et un vortex pour mélanger. Ensuite, effectuez la série de dilution en transférant d’abord 1 mL du tube négatif un dans le tube négatif deux et le vortex pour mélanger. Transférer 1 mL du tube négatif deux dans le tube négatif trois et agiter au vortex. Continuez ce transfert en série le long de tous les tubes de dilution jusqu’au tube moins neuf. Versez 100 microlitres de suspension cellulaire sur la plaque étiquetée en conséquence pour chaque dilution. Pour chaque dilution, stérilisez un épandeur de cellules dans de l’éthanol, passez-le à travers une flamme de bec Bunsen et refroidissez-le en touchant la surface de la gélose loin de l’inoculé. Ensuite, utilisez l’épandeur de cellules pour étaler la suspension cellulaire jusqu’à ce que la surface de la plaque de gélose devienne sèche. Incuber les assiettes à l’envers à 37 degrés Celsius. Une fois que les colonies visibles apparaissent, comptez le nombre de colonies bactériennes sur chaque plaque. Consignez ces valeurs et les facteurs de dilution qui leur sont associés pour chaque plaque à chaque point temporel.

Pour créer une courbe de croissance OD 600, après vous être assuré que tous les points de données sont correctement entrés dans une table, sélectionnez tous les points temporels et leurs données correspondantes. Pour générer un graphique de courbe de croissance unitaire formant une colonie, choisissez la plaque de dilution où le nombre de colonies se situe dans la plage de 30 à 300 bactéries pour chaque point temporel. Multipliez le nombre de colonies par le facteur de dilution, puis par dix. En effet, l’épandage de 100 microlitres est considéré comme une dilution supplémentaire de 1:10 lors du calcul des unités formant des colonies par millilitre. Ensuite, tracez les unités formant la colonie en fonction du temps à l’échelle semi-logarithmique.

Ces graphiques produits avec des mesures de DO 600 et d’UFC, respectivement, peuvent fournir des informations précieuses sur la cinétique de croissance d’E. coli. La densité optique et les unités de formation de colonies peuvent être liées, de sorte que les UFC par millilitre peuvent être estimées à partir de mesures OD 600, ce qui permet d’économiser du temps et des matériaux dans les expériences futures.

Pour ce faire, tracez les unités formant colonie en fonction de la densité optique sur une échelle linéaire pour les lectures OD 600 inférieures ou égales à 1. 0. Après cela, générez une ligne de tendance de régression linéaire au format Y = MX + B, où M est la pente et B est l’ordonnée à l’origine. Faites un clic droit sur les points de données et sélectionnez Ajouter une ligne de tendance et un linéaire. Ensuite, cochez la case pour afficher l’équation sur le graphique et afficher la valeur R au carré sur le graphique. La valeur R au carré est la mesure statistique de la correspondance des données avec la droite de régression ajustée. Dans cet exemple, les 6 premiers points temporels sont tracés avec OD 600 sur l’axe des x et CFUs par millilitre sur l’axe des y. Dans les expériences futures avec les mêmes conditions de croissance, ces valeurs de pente et d’ordonnée à l’origine peuvent être intégrées à cette équation pour estimer les UFC à partir de lectures de DO 600. Ensuite, regardez le graphique de la courbe de croissance des unités formant des colonies. Au cours de la phase exponentielle, identifiez deux points temporels séparés par la pente la plus raide. Pour calculer le temps de doublage, calculez d’abord le changement de temps entre les points temporels sélectionnés. Ensuite, calculez le changement de génération à l’aide de l’équation illustrée ici. Ici, b minuscule est le nombre de bactéries au point temporel trois et B majuscule est le nombre de bactéries au point temporel deux. Enfin, divisez le changement dans le temps par le changement dans les générations. Dans cet exemple, le temps de doublage est de 0. 26 heures ou 15 minutes et 19 secondes. La comparaison des temps de doublement entre différents traitements expérimentaux nous permet d’identifier les meilleures conditions de croissance pour une certaine espèce bactérienne. Par conséquent, le traitement avec le temps de doublage le plus court sera le plus optimal des conditions testées.