Microscopie et coloration : Gram, Capsule et endospores.

Les bactéries sont des organismes vivants microscopiques qui ont de nombreuses caractéristiques distinctives telles que la forme, la disposition des cellules, la production ou non de capsules et la formation de spores. Ces caractéristiques peuvent toutes être visualisées par coloration et aident à l’identification et à la classification de différentes espèces bactériennes.

Pour examiner les deux premières caractéristiques de la forme et de l’arrangement des cellules, nous pouvons utiliser une technique simple appelée coloration de Gram. Ici, le violet cristallin est appliqué sur des bactéries, qui ont été fixées thermiquement sur une lame. Ensuite, la solution d’iode de Gram est ajoutée à la lame, ce qui entraîne la formation d’un complexe insoluble entre le violet cristallin et la solution d’iode de Gram. Un décolorant est ensuite appliqué et toute bactérie avec une épaisse couche de peptidoglycane se tachera en violet, car cette couche n’est pas facilement pénétrée par le décolorant. Ces bactéries sont appelées Gram positif.

Les bactéries à Gram négatif ont une couche de peptidoglycane plus mince et décolorent le décolorant, perdant la couleur violette. Cependant, ils se colorent en rose rougeâtre lorsqu’une contre-coloration à la safranine est ajoutée, qui se lie à une couche de lipopolysaccharides à l’extérieur. Une fois colorées, la morphologie, la taille et l’arrangement des cellules peuvent être observées, par exemple en chaînes ou en grappes, ce qui facilite davantage la classification et l’identification.

Une autre technique utile dans la boîte à outils du microbiologiste est la coloration des capsules, utilisée pour visualiser les capsules externes qui entourent certains types de cellules bactériennes. En raison de la composition non ionique de la capsule et de sa tendance à repousser les taches, des méthodes de coloration simples ne fonctionneront pas. Au lieu de cela, une technique de coloration négative est utilisée, qui colore d’abord le fond avec un colorant acide, tel que le rouge Congo, avant que les cellules bactériennes ne soient colorées avec du violet cristallin. Cela laisse toute capsule présente sous la forme d’un halo clair autour des cellules.

La dernière technique de coloration majeure abordée ici peut aider à déterminer si les bactéries étudiées forment des spores. Dans des conditions défavorables, certaines bactéries produisent des endospores, des structures dormantes, dures et non reproductrices dont la fonction principale est d’assurer la survie des bactéries pendant les périodes de stress environnemental, comme les températures extrêmes ou la déshydratation. Cependant, toutes les espèces bactériennes ne fabriquent pas d’endospores, et elles sont difficiles à colorer avec des techniques standard car elles sont imperméables à de nombreux colorants. La méthode Schaeffer-Fulton utilise une coloration verte à la malachite, qui est appliquée sur les bactéries fixées sur une lame. La lame est ensuite lavée à l’eau avant d’être contre-teintée avec de la safranine. Les cellules végétatives apparaîtront rouge rosâtre, tandis que les endospores présentes apparaîtront vertes. Dans cette vidéo, vous apprendrez à effectuer ces techniques courantes de coloration bactérienne, puis à examiner les échantillons de coloration à l’aide de la microscopie optique.

Pour commencer la procédure, attachez les cheveux longs et mettez l’équipement de protection individuelle approprié, y compris une blouse de laboratoire et des gants.

Ensuite, nettoyez une lame de microscope fraîche avec une lingette de laboratoire. Ensuite, pipetez 10 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate 1X sur la première lame. Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette stérile, sélectionnez une seule colonie bactérienne dans la plaque de gélose LB. Étalez la colonie bactérienne dans le liquide pour produire une couche mince et uniforme. Placez la glissière sur la paillasse et laissez-la sécher complètement à l’air.

Une fois séché, allumez un bec Bunsen pour fixer thermiquement les bactéries. À l’aide de pinces, passez la lame plusieurs fois dans la flamme du brûleur, côté bactérie vers le haut, en prenant soin de ne pas maintenir la lame trop longtemps dans la flamme, ce qui pourrait déformer les cellules.

Maintenant, en travaillant au-dessus de l’évier, tenez le niveau de la diapositive et appliquez plusieurs gouttes de violet de cristal de Gram pour couvrir complètement la tache bactérienne, puis placez la diapositive sur le banc pour qu’elle repose pendant 45 secondes. Ensuite, tenez la lame en biais et versez doucement un jet d’eau sur le dessus de la lame, en prenant soin de ne pas projeter directement la tache bactérienne. Maintenant, en maintenant à nouveau le niveau de la lame, appliquez la solution d’iode de Gram pour couvrir complètement les bactéries tachées, puis laissez-la reposer pendant 45 secondes supplémentaires. Ensuite, rincez soigneusement l’iode de la lame, comme indiqué précédemment. Tout en tenant la lame en biais, ajoutez quelques gouttes de décolorant de Gram à la lame, en lui permettant de couler sur les bactéries tachées, jusqu’à ce que le ruissellement soit clair, pendant environ 5 secondes. Rincez immédiatement à l’eau comme indiqué précédemment. Cela limitera la décoloration excessive du frottis. Ensuite, en maintenant à nouveau le niveau de la diapositive, appliquez la contre-coloration à la safranine de Gram pour couvrir complètement les bactéries tachées. Après 45 secondes, rincez doucement le Safranin de la lame avec de l’eau, comme indiqué précédemment, puis séchez avec des serviettes en papier.

Enfin, ajoutez une goutte d’huile d’immersion directement sur la lame, puis examinez la lame à l’aide d’un microscope optique avec un objectif à huile 100X.

Pour commencer ce protocole de coloration, mettez d’abord l’équipement de protection individuelle approprié, puis assurez-vous que les lames de verre qui seront utilisées sont propres.

Ensuite, préparez les solutions. Pour préparer une solution de violet cristallin à 1 %, mélangez 0,25 gramme de poudre de violet cristallin avec 25 millilitres d’eau distillée et vortex jusqu’à dissolution. Ensuite, préparez une solution de rouge du Congo à 1 % en mélangeant 0,25 gramme de poudre de rouge du Congo avec 25 millilitres d’eau distillée et agitez jusqu’à dissolution. Maintenant, pipetez 10 microlitres de la solution rouge du Congo sur la lame. À l’aide d’une pointe de pipette propre et stérile, sélectionnez une seule colonie bactérienne dans la plaque de gélose LB. Ensuite, étalez la colonie bactérienne dans le colorant pour produire une couche mince et uniforme. Faites sécher complètement la lame bactérienne à l’air libre pendant 5 à 7 minutes. Une fois que la lame est sèche, inondez le frottis avec suffisamment de violet cristallin à 1 % pour couvrir le frottis et laissez-le reposer pendant 1 minute. Maintenant, tenez la lame en biais et versez doucement un jet d’eau sur le dessus de la lame, en prenant soin de ne pas gicler directement les bactéries. Continuez à tenir la lame à un angle de 45 degrés jusqu’à ce qu’elle soit complètement sèche à l’air. Enfin, ajoutez une goutte d’huile d’immersion directement sur la lame, puis examinez la lame à l’aide d’un microscope optique avec un objectif à huile 100X.

Pour effectuer la coloration de l’endospore, préparez d’abord une solution de vert de malachite à 0,5 % en mélangeant 0. 125 grammes de poudre verte de malachite avec 25 millilitres d’eau distillée, puis tourbillonnez la solution jusqu’à ce qu’elle soit dissoute. Ensuite, pipetez 10 microlitres de 1X PBS au centre de la lame. Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette stérile, sélectionnez une seule colonie bactérienne dans la plaque de gélose LB. Étalez les bactéries dans le liquide pour produire une couche mince et uniforme. Maintenant, placez la glissière sur la paillasse et laissez-la sécher complètement à l’air. Une fois séché, allumez un bec Bunsen pour fixer thermiquement les bactéries. Passez la diapositive plusieurs fois dans la flamme du brûleur bleu, avec le côté des bactéries vers le haut. Ensuite, une fois la diapositive refroidie, placez un morceau de papier prédécoupé sur le frottis fixé à chaud. Ensuite, allumez une plaque chauffante au réglage le plus élevé et portez un bécher d’eau à ébullition.

Saturez le papier de lentille avec la solution de vert de malachite et, à l’aide de pinces, placez la lame sur le bécher d’eau bouillante pour cuire à la vapeur pendant 5 minutes. Gardez le papier de l’objectif humide en ajoutant plus de colorant, une goutte à la fois, au besoin. Ensuite, toujours à l’aide de pinces, ramassez la lame du bécher et retirez et jetez le papier de l’objectif. Laissez la diapositive refroidir pendant 2 minutes. En travaillant au-dessus de l’évier, tenez le toboggan en biais et versez doucement un jet d’eau sur le dessus du toboggan. Maintenant, maintenez le niveau de la diapositive et appliquez du Safranin pour couvrir complètement la diapositive. Ensuite, laissez-le reposer pendant 1 minute. Ensuite, tenez la diapositive en biais et rincez comme indiqué précédemment. Laissez la diapositive sécher à l’air libre sur la paillasse. Enfin, ajoutez une goutte d’huile d’immersion directement sur la lame, puis examinez la lame avec un microscope optique, avec un objectif à huile 100X.

Dans le protocole de coloration de Gram, deux taches de couleurs différentes peuvent en résulter. La coloration violet foncé indique que les bactéries sont à Gram positif et qu’elles ont conservé la tache violette cristalline. En revanche, la coloration rose rougeâtre est une caractéristique des bactéries à Gram négatif, qui seront plutôt colorées par la contre-coloration à la safranine. De plus, différentes formes et arrangements de bactéries peuvent être visualisés après la coloration de Gram. Par exemple, il est possible de différencier les Cocci, ou bactéries rondes, des Bacillus en forme de bâtonnet, ou d’identifier les bactéries, qui forment des brins, par rapport à celles qui s’agrègent généralement en touffes ou se produisent individuellement.

Dans une image au microscope colorée par capsule, les cellules bactériennes seront généralement colorées en violet et le fond de la lame doit être coloré en noir. Sur ce fond sombre, les capsules de la bactérie, si elles sont présentes, apparaîtront comme un halo clair autour des cellules.

Enfin, dans la coloration des endospores, les cellules végétatives seront colorées en rouge par la contre-coloration de la safranine. Si des endospores sont présentes dans l’échantillon, celles-ci conserveront la coloration vert malachite et apparaîtront de couleur vert bleuâtre.