Microscopie et coloration : Gram, Capsule et endospores.

1. Gram Staining

1. arrangement
   1. Portez des gants et une blouse de laboratoire non inflammable, car les colorants tacheront les mains et les vêtements.
   2. Un brûleur Bunsen est utilisé pour chauffer fixer les bactéries. Faites preuve de prudence lorsque vous travaillez avec des flammes; attacher les cheveux longs.
   3. Des réactifs à taches Gram disponibles dans le commerce seront utilisés.
   4. Nettoyez les lames de microscope avec des lingettes de laboratoire.
2. protocole
   1. Pipet 10 'L phosphate tamponné salin ou bouillon de culture sur la diapositive.
   2. Enduisez une colonie bactérienne dans le liquide pour produire une mince couche uniforme.
      Note: N'utilisez pas de cultures de plus de 24 heures, car les bactéries trop âgées pourraient avoir des changements dans leur paroi cellulaire qui affecteront les résultats de la tache Gram (1, 4).
   3. Glissade complètement sèche à l'air.
   4. Une fois séchées, la chaleur fixe les bactéries en passant glisser à travers la flamme (côté bactéries vers le haut) 4-5 fois.
      Note: Ne tenez pas la glissière dans la flamme trop longtemps ou vous pouvez déformer les cellules bactériennes (1).
   5. Travailler au-dessus de l'évier, maintenir le niveau de ladiapositive et appliquer gram's Crystal Violet pour couvrir complètement les bactéries fixées à la chaleur, laisser reposer 45 secondes.
   6. Rincer l'excès de violette de cristal en tenant la glissière à un angle et en giclant un flux d'eau doux et indirect sur la glissière et en la laissant couler sur les bactéries tachées. Ne pas gicler de l'eau directement sur les bactéries.
   7. En maintenant à nouveau le niveau de la diapositive, appliquez la solution d'iode de Gram pour couvrir complètement les bactéries tachées, laisser reposer 45 secondes.
   8. Rincer l'excès d'iode comme dans l'étape 1.2.6 ci-dessus.
   9. Tout en maintenant la glissière à un angle, ajouter quelques gouttes de Décoloreur sur la diapositive, en la laissant ruisseler sur les bactéries tachées jusqu'à ce que le ruissellement est clair; généralement, environ 5 secondes. Rincer immédiatement à l'eau comme à l'étape 1.2.6 ci-dessus.
      Note: Il s'agit d'une étape cruciale dans le protocole. Permettre au Décoloreur de ruisseler trop longtemps ou pas assez longtemps se traduira par de fausses taches de Gram (4).
   10. En maintenant à nouveau le niveau de glissement, appliquer la Safranine de Gram pour couvrir complètement les bactéries, laisser reposer 45 secondes.
   11. Rincer l'excès de Safranin comme dans l'étape 1.2.6 ci-dessus.
   12. Blot, ne frottez pas, l'excès d'eau de la diapositive à l'aide de serviettes en papier.
   13. Examiner la diapositive sur le microscope à l'aide d'une immersion à l'huile avec un objectif 100X.
3. Résultats et analyse de données
   1. Les bactéries Gram-positives tacheront le violet.
   2. Les bactéries Gram-négatives tacheront le rouge.
   3. La forme (cocci, bacilles, tiges courbes, spirales) des bactéries sera visible.
   4. L'arrangement des cellules bactériennes (cellules simples, cellules appariées, chaînes de cellules, clusters, regroupements) sera visible.

2. Staining capsule

1. arrangement
   1. Portez des gants et une blouse de laboratoire car les colorants tachent les mains et les vêtements.
   2. Pour préparer une solution de violette de cristal de 1 %, mélanger 0,25 gramme de violette de cristal avec de l'eau distillée de 25 ml jusqu'à dissolution.
   3. Pour préparer la solution Congo Red 1%, mélanger 0,25 gramme Congo Red avec 25 ml d'eau distillée jusqu'à dissolution.
   4. Nettoyez les glissières avec des lingettes de laboratoire.
2. protocole
   1. Placer 10 L Congo Red sur toboggan.
   2. À l'aide d'une pointe de pipet, enduire une colonie bactérienne dans le colorant pour produire une fine couche uniforme.
   3. Glissez complètement sèche à l'air avec mélange de colorant/cellule, 5-7 minutes.
      Note: Ne chauffez pas la correction car le chauffage peut déshydrater ou déformer la capsule.
   4. Inonder le frottis de 1% de violette de cristal pendant 1 minute.
   5. Rincer la tache excédentaire en maintenant la glissière à un angle et en giclant un flux d'eau doux et indirect sur la glissière et en la laissant couler sur les bactéries tachées. Ne pas gicler de l'eau directement sur les bactéries.
   6. Maintenez la glissière à un angle de 45 degrés jusqu'à ce qu'elle soit complètement séchée à l'air.
   7. Examiner le frottis sur le microscope sous immersion à l'huile avec un objectif 100X.
3. Résultats et analyse de données
   1. Les cellules bactériennes tacheront le violet.
   2. L'arrière-plan de la glissière tachera l'obscurité.
   3. Les capsules seront un halo clair autour des cellules sur un fond sombre.

3. Staining Endospore (méthode Schaeffer-Fulton)

1. arrangement
   1. Portez des gants et des blouses de laboratoire non inflammables pour protéger les mains et les vêtements contre les colorants et les flammes.
   2. Un brûleur Bunsen est utilisé pour chauffer fixer les bactéries. Faites preuve de prudence lorsque vous travaillez avec des flammes; attacher les cheveux longs.
   3. Pour préparer 0,5% Malachite Solution verte, mélanger 0,125 grammes Malachite Green avec 25 ml d'eau distillée jusqu'à dissolution.
   4. Utilisez la solution de réactif Safranin de Gram disponible dans le commerce.
   5. Nettoyez les glissières avec des lingettes de laboratoire.
2. protocole
   1. Pipet 10 'l phosphate tamponné salline (PBS) ou bouillon de culture sur la diapositive.
   2. En utilisant la technique aseptique, enduire une colonie bactérienne dans le liquide pour produire une mince couche uniforme.
      Note: Les endospores ne se forment généralement pas dans les jeunes cellules, donc la culture est recommandée pour être entre 18 et 36 heures (9).
   3. Glissade complètement sèche à l'air.
   4. Fixer la chaleur en passant la glissière (côté bactéries vers le haut) à travers la flamme 4-5 fois.
   5. Pour aider à contenir le colorant, placez un morceau de papier de lentille (coupé pour s'adapter au frottis bactérien) au-dessus du frottis fixe de chaleur.
   6. Saturate papier d'objectif avec la solution vert de Malachite.
   7. Placez la glissière sur le dessus du bécher d'eau bouillante sur une plaque chaude, et la glissière à vapeur pendant 5 minutes, en gardant le papier de lentille humide en ajoutant plus de colorant une goutte à la fois au besoin.
      Note: Évitez la surchauffe et le dessèchement de la solution de colorant.
   8. Retirer la glissière du bécher, retirer et jeter le papier de lentille, laisser refroidir la glissière 2 minutes.
   9. Tenir la glissière à un angle, rincer soigneusement en giclant un flux d'eau doux et indirect sur la glissière, ce qui lui permet de s'écouler sur le frottis.
   10. Maintenir le niveau de la glissade, le frottis d'inondation avec Safranin, laisser reposer 1 minute.
   11. Rincer à l'excès de Safranin comme dans l'étape 3.2.9 ci-dessus.
   12. Laisser sécher à l'air.
   13. Examiner la diapositive au microscope sous immersion à l'huile avec un objectif 100X.
3. Résultats et analyse de données
   1. Les spores tacheront le vert.
   2. Les cellules végétatives tacheront en rouge.
   3. Certaines cellules végétatives contiennent des spores; les cellules tacheront en rouge, tandis que les endospores tacheront vert.