Name: Une méthode CLHP lectine pour enrichir sélectivement peptides glycosylés déchantillons biologiques complexes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-01T21:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 23 s
Description: Découvrez une méthode de chromatographie d'affinité aux lectines pour enrichir les glycopeptides à partir de plasma humain. Cette technique facilite la découverte de biomarqueurs en protéomique.

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Ce travail a été soutenu par le Clinical Technologies protéomiques pour le cancer initiative, 5U24CA126477-04.

1) Préparer lectine conjuguée colonnes POROS <ol><li> Mettez un masque pour se protéger contre l&#39;inhalation de Poros-AL perles au cours des étapes 1.1 à 1.2. Peser la quantité désirée de perles POROS (100 mg beads/300 volumes ul finale) et transférer dans un tube propre Eppendorf. </li><li> Lavez perles avec addition de 1 ml de tampon phosphate salin (PBS). Perles par centrifugation dans une microcentrifugeuse à vitesse maximale pendant 3 minutes. Enlever le surnageant et répéter le lavage. </li><li> Peser la quantité désirée de lectine non conjuguée (1 - 4 mg / 200 perles ul) et transférer dans un tube propre Eppendorf. Ajouter PBS pour former un 5 - 20 mg / ml solution. Réserve 25 ul de cette solution. </li><li> Transférer la solution de lectine restantes aux billes Poros. Ajouter cyanoborohydrure de sodium à une concentration finale de 50 mM. Placer le tube sur une bascule et réagir une nuit à température ambiante. (Remarque:. Cyanoborohydrure de sodium est toxique et doit être manipulé sous une hotte de déchets contaminés doivent être éliminés de façon appropriée.) </li><li> Pellet les perles POROS comme à l&#39;étape 1.2. Retirer le surnageant et enregistrer en tant que solution de post-conjugaison. </li><li> Lavez perles avec une mémoire tampon Trempe ml (1 M de Tris-Cl, pH 7,4). Perles Pellet comme à l&#39;étape 1.2 et jetez le surnageant. </li><li> Bloquer les sites restants réactive sur les perles POROS avec 1 ml de tampon trempe. Ajouter cyanoborohydrure de sodium à une concentration finale de 50 mM. Placer le tube sur une bascule et incuber à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Perles Pellet comme à l&#39;étape 1.2 et éliminer le surnageant. </li><li> Lavez perles avec 1 ml de NaCl 1 M. Perles Pellet et éliminer le surnageant. Répétez quatre fois pour un total de cinq lavages. Les perles sont maintenant prêtes à emballer. </li><li> Pour déterminer la quantité de protéine qui a été conjugué à des perles Poros, effectuer un dosage de la concentration de protéines sur les solutions pré-conjugués lectine et post-conjugué. La différence dans les concentrations est la quantité de protéine qui a été conjugué à des billes. La quantité de protéines conjuguées par volume est égal à billes de la concentration de lectine sur les billes. Les concentrations cibles sont lectine entre 2 à 20 mg / mL. </li></ol> 2) Emballage des perles lectine conjuguée POROS dans une colonne en PEEK <ol><li> Assemblez le système d&#39;emballage (description ci-dessous) et l&#39;appuyer sur un stand anneau de métal. Le système d&#39;emballage se compose, de bas en haut, limiteur de pression, colonne de fin coupleur 1, fritte, la colonne (2 x 50 mm), coupleur colonne de fin 2, connecteur colonne, colonne de fin coupleur 3, colonne (4,5 x 50 mm), 4 coupleur extrémité de colonne et de raccord d&#39;extrémité. La colonne supérieure sert de réservoir pour les matériaux d&#39;emballage. </li><li> Resuspendre les perles POROS au volume désiré de tampon A. (10 mM tampon Tris, pH 7,4, chlorure de sodium 150 mM, 10 mM de chlorure de calcium, chlorure de magnésium 10 mM) Si l&#39;emballage d&#39;une colonne (~ 200 ul volume de lit), remettre en suspension dans 400 pi de tampon A. </li><li> Transfert conjugué perles POROS dans la colonne supérieure (réservoir). Ajouter le tampon A au réservoir jusqu&#39;à ce que la mémoire tampon atteint le sommet de la colonne. Placez délicatement l&#39;embout sur le haut de la colonne, en essayant d&#39;éviter les bulles d&#39;air dans la colonne. Branchez le raccord d&#39;extrémité de la colonne supérieure pour le système HPLC. </li><li> Pack de la colonne par l&#39;écoulement tampon A travers le système. Commencez avec un débit de 0,5 mL / min. Augmenter le débit de 0,5 ml / min jusqu&#39;à ce chaque minute soit 4 mL / min ou la pression maximale (3000 psi) a été atteint. Continuer au débit maximum possible au moins jusqu&#39;à 35 ml de tampon A sont passés par la colonne. </li><li> Éteignez les pompes et laisser la pression sur la colonne pour tomber à &lt;20 psi. </li><li> Doucement, démonter le système d&#39;emballage, en commençant par le haut. Lorsque le coupleur 2 extrémité de colonne est atteinte, retirez-le soigneusement. Certains documents doivent être emballés extrusion à partir du haut de la colonne. Avec une lame de rasoir ou semblable tranchant, doucement essuyer les perles extrusion, laissant une surface perles qui est encore avec le haut de la colonne. Ne pas appliquer de pression sur les billes pendant cette opération. </li><li> Dégagez la colonne remplie du stand anneau. Placez une fritte nouveau dans un coupleur nouvelle fin et tournez la colonne à garnissage plus se connecter cela avec le coupleur fritte / Fin de la fin de colonne (anciennement haut) ouvert. </li><li> Étiquette de la colonne appropriée. Il est maintenant prêt à l&#39;emploi. Lorsqu&#39;il n&#39;est pas utilisé, la colonne peut être stockée dans du PBS avec 0,02% d&#39;azide de sodium à 4 ° C pour un maximum de 6 mois. </li></ol> 3) Programme de la méthode HPLC <ol><li> Les détails de la programmation de votre HPLC varient selon les spécificités du logiciel du fabricant. Nous utilisons un paradigme Michrom MG4 HPLC. Sur cette machine, les méthodes sont construites et sont accessibles sous la rubrique &quot;Configuration&quot; onglet en haut de l&#39;écran. Programme de la méthode suivante: <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Temps </td><td> Débit (l / min) </td><td> % A </td><td> % B </td></tr><tr><td> 00:00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09:00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09:01 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13:50 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13:51 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 19:50 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> Tampon A: 10 mM tampon Tris, pH 7,4, chlorure de sodium 150 mM, 10 mM de chlorure de calcium, chlorure de magnésium 10 mM Tampon B: 0,5 M d&#39;acide acétique Le détecteur UV doit être programmé pour lire à 280 nm 0h00-19h50. L&#39;axe des y doit être ajustée afin de détecter des niveaux faibles d&#39;absorbance, par exemple, 0 -. 50 UA. </li><li> Si un échantillonneur automatique est disponible, le programme le calendrier suivant pour la collecte de fractions. Sinon, collecter les fractions par la main comme indiqué lors de l&#39;exécution de chromatographie. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Fraction </td><td> Retard à la collecte d&#39;injection de l&#39;échantillon </td><td> Durée de la collecte (min) </td></tr><tr><td> Accréditives </td><td> 2.8 </td><td> 4.1 </td></tr><tr><td> Liés </td><td> 9 </td><td> 2.6 </td></tr></tbody></table></li></ol> 4) Préparer les échantillons pour HPLC <ol><li> Avant d&#39;utiliser ce protocole, le plasma humain doit être appauvri sur les 14 protéines les plus abondantes en utilisant une colonne MARS (Agilent, Santa Clara, CA). Plasma appauvri, la lactoferrine humaine et l&#39;invertase de la levure doit être individuellement digérés par la trypsine et dessalé comme décrit précédemment 1. </li><li> Pour préparer la lectine spécifique lactoferrine standard, effectuer une chromatographie sur 50 ug digérés par la trypsine lactoferrine ni sur la AAD ou la colonne SNA en utilisant la méthode dans la partie 3. La fraction liée contiendra lectine spécifique glycopeptides lactoferrine. Neutraliser les échantillons que dans la partie 4.4, et dessaler comme dans la Partie 6. Resuspendre l&#39;échantillon dans une mémoire tampon A. mL L&#39;échantillon résultant est prêt à l&#39;emploi. </li><li> Trois expérimentale reproduit sera effectuée. Pour préparer l&#39;échantillon pour trois répétitions, ajouter 3 pmol de trypsine digère invertase et 1 pl de la lectine spécifique lactoferrine (AAD soit-ALC ou SNA-ALC) à 30 ul MARS appauvri, digérés par la trypsine équivalents à plasma, (PE). Un PE est définie comme le volume de plasma non-processed/intact/original partir de laquelle une quantité donnée de traitement du plasma (MARS-appauvri et la trypsine digéré) a été dérivé. Ajouter le tampon A à l&#39;échantillon pour atteindre un volume final de 330 pl. </li><li> Ajouter tampon de neutralisation (Tris 1 M pH 8,0), les flacons d&#39;échantillon qui permettra de recueillir l&#39;éluat. Le nombre et le volume des flacons que vous travaillez avec dépendra des contraintes de votre échantillonneur automatique. Pour le paradigme MG4, un flacon recueille les accréditives et deux recueillir l&#39;éluat. Il aura besoin d&#39;environ 1,5 ml de tampon Tris pour neutraliser 1 ml d&#39;éluat. PH cible neutralisée est de 7,0 à 8,0; pH test de test final avec un papier indicateur de pH. </li></ol> 5) Effectuer la chromatographie <ol><li> Toutes les pistes vierges et de l&#39;échantillon qui suivent utiliseront la méthode décrite dans la Partie 1. La colonne et les tampons sont à température ambiante pendant son utilisation. Les colonnes sont stockées à 4 ° C, tandis que les tampons sont stockés à température ambiante. </li><li> Fixez soit l&#39;AAL ou la colonne de lectine SNA au système HPLC et exécuter deux méthodes vierge (injection de tampon que A). Assurez-vous que la colonne de lectine correspond à la lactoferrine lectine spécifique (Partie 2). </li><li> Chromatographe les trois échantillons de plasma, l&#39;injection d&#39;un vide entre chaque échantillon injecté, pour un total de pistes HPLC 7. Les fractions de passe vierge ne pas être collectées. </li></ol> 6) Dessaler fractions collectées Pour chaque fraction utiliser un 1 ml Eaux Oasis HLB cartouche SPE comme suit: <ol><li> Fixer le nombre de cartouches nécessaires pour collecteur à vide. </li><li> Mouiller chaque cartouche avec une ACN ml à 80% dans l&#39;acide formique 1% (indicateur de vide sur le collecteur doit lire 5 à 20 lnHg). </li><li> Equilibrer les cartouches avec 1,5 ml d&#39;acide formique à 0,1% (jauge à vide sur le collecteur doit lire 5 à 20 lnHg) </li><li> Chargez le volume entier d&#39;un échantillon sur une cartouche (Vacuomètre sur le collecteur doit lire 2 - 2.5. LnHg, et le débit ne doit pas dépasser 1 mL / min) </li><li> Lavez les cartouches avec 3 x 1 ml d&#39;acide formique à 0,1% (Vacuomètre sur le collecteur doit lire 5 à 20 lnHg) </li><li> Peptides Eluer / glycopeptides dans des tubes Eppendorf étiqueté avec 1 x 1 ml d&#39;acétonitrile de 80% dans l&#39;acide formique à 0,1%. (Vacuomètre sur le collecteur doit lire de 2 à 2,5 lnHg, et le débit ne doit pas dépasser 1 mL / min.) Un tube de prélèvement unique devrait être utilisé pour chaque cartouche. </li><li> Neutraliser éluat en ajoutant 60 pl 0,5 M de bicarbonate d&#39;ammonium dans chaque tube de collecte. Target neutrpH de 7.0 à 8.0 est croissante est; pH test final avec un papier indicateur de pH. </li><li> Concentré de peptides élués / glycopeptides à ~ 50 pl en les exécutant sur ​​une centrifugeuse sous vide (par exemple, un Thermo Savant SpeedVac) pour ~ 2 hrs @ 35 ° C. </li></ol> 7) PNGase F-digestion <ol><li> PH de l&#39;échantillon de test pour s&#39;assurer qu&#39;elle se situe entre 7,0 à 8,0. Si nécessaire, ajoutez du bicarbonate d&#39;ammonium 50 mM pour augmenter le pH. Si le volume de l&#39;échantillon final est&gt; 100 pi, l&#39;échantillon speedvac jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit entre 50-100 ul. </li><li> Ajouter 0,5 ul (250 U) de glycérol sans PNGase F à chaque tube d&#39;échantillon et incuber à 37 ° C pendant la nuit. </li></ol> 8) échantillons Astuce Zip <ol><li> En commençant par la PNGase F-digérée échantillons, ZipTip chacun comme suit. </li><li> ZipTip humide avec 10 ul d&#39;acétonitrile 100%, suivie par 10 à 80% d&#39;acétonitrile ul, 0,1% d&#39;acide formique. </li><li> Equilibrer ZipTip avec 20 ul d&#39;acide formique 0,1%. </li><li> Chargez l&#39;échantillon sur l&#39;ZipTip en le pipetage haut et en bas à travers la matrice ZipTip 10 fois. </li><li> Laver les ZipTip par pipetage 10 ul d&#39;acide formique 0,1%, 5 fois. </li><li> Eluer l&#39;échantillon dans un tube propre eppendorf avec 10 ul d&#39;acétonitrile 80%, 0,1% d&#39;acide formique. </li><li> Répéter l&#39;élution et ajouter le second 10 ul dans le même tube. </li><li> Speedvac les échantillons d&#39;un volume de &lt;2 pl. </li><li> Remettre en suspension dans les échantillons d&#39;acide formique 20 ul de 0,1%. Les échantillons sont maintenant prêtes pour l&#39;analyse par LC-MS/MS. </li></ol> 9) Les résultats représentatifs: La conjugaison POROS rendements généralement sur-perle concentrations lectine dans la gamme de 2 - 20 mg / mL. Ceci est optimal pour la chromatographie d&#39;affinité. Chromatographie lectine de digérés par la trypsine plasmatique MARS appauvri humaine enrichit généralement glycopeptides dans la fraction liée. Comme les glycopeptides sont PNGase F-traités avant LC-MS/MS, ils sont identifiés comme des peptides avec la séquence consensus N-liés, NXS / T (où X est un résidu, mais la proline), dans laquelle l&#39;asparagine a été converti en un acide aspartique par l&#39;action des peptides de F. PNGase avec ces caractéristiques sont considérées comme des peptides déglycosylé (ou &quot;deglycopeptides&quot;). En moyenne, le flux continu (FT) fraction d&#39;AAL ou SNA chromatographie contient deglycopeptides 2-4%, alors que 30-50% des peptides récupérés dans la fraction liée sont deglycopeptides. Généralement, l&#39;aide d&#39;une élite QStar, 1000-1300 peptides seront identifiés dans la fraction FT, et 200-400 peptides seront identifiés dans la fraction liée. Deux ou plusieurs deglycopeptides invertase distinctes doit être observée dans la fraction FT et deux ou plus distinctes deglycopeptides lactoferrine dans la fraction liée (tableau 1). <img src="/files/ftp_upload/1398/1398table.jpg" alt="Tableau 1" /> Tableau 1.

<ol><li>Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((multiplexed+assays+for+low+abundance+proteins+in+plasma+by+targeted+mass+spectrometry+and+stable+isotope+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).</li>
</ol>

Ce protocole fournit une méthode rapide pour isoler et identifier les glycopeptides de manière glycane-spécifiques. Comme glycosylation varie largement au sein d&#39;un organisme, en particulier pendant le développement et la pathogenèse, cette technique peut être applicable à aborder un large éventail de questions. En particulier, nous utilisons la méthode de façon sélective d&#39;enrichir glycopeptides qui ont été modifiés avec le cancer associés à des épitopes comme une première étape vers la découverte de biomarqueurs.

<table><tbody><tr><td>Plasma humain</td><td></td><td></td><td>Nous le préparons en interne</td></tr><tr><td>Lactoferrine humaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0520</td><td>Traiter à la trypsine avant utilisation</td></tr><tr><td>Invertase de levure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0408</td><td>Traiter à la trypsine avant utilisation</td></tr><tr><td>Cartouches SPE Oass HLB</td><td>Waters</td><td>WAT094225</td><td>Volume de 1 cc</td></tr><tr><td>Pointes de pipette ZipTip</td><td>Fisher Scientific</td><td>ZTC1 8M0 96</td><td>Millipore, C18 pour pipette de 10 ml</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td>99 %</td></tr><tr><td>Bicarbonate d'ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141</td><td>99 %</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>96 %</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>98 %</td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242853</td><td>99,7 %</td></tr><tr><td>Papier indicateur de pH</td><td>Fisher Scientific</td><td>M95903</td><td>Plage 0-14</td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998</td><td>99,9 %</td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>28905</td><td>99 %</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Invitrogen</td><td>14190-136</td><td>Sans calcium ni magnésium</td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289</td><td>99,5 %</td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0705L</td><td>Sans glycérol</td></tr><tr><td>Flacons filtrants sous vide</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGVU05RE</td><td>Pores de 0,2 mm</td></tr><tr><td>Billes POROS-AL</td><td>Applied Biosystems</td><td>1-6028-02</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aleuria aurantia&lt;/em&gt; lectine</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1390</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sambucus nigra&lt;/em&gt; agglutinine</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1300</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoborohydrure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296945</td><td>Solution 5,0 M</td></tr></tbody></table>

une méthode clhp lectine pour enrichir sélectivement peptides glycosylés d&#39;échantillons biologiques complexes

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycanes sont une classe importante de modifications post-traductionnelles. On trouve généralement sur sécrétées et les molécules extracellulaires, structures glycanniques de signal du statut interne de la cellule. Glycanes sur les cellules tumorales ont tendance à avoir en abondance des fragments d&#39;acide sialique et le fucose. Nous proposons que ces variantes associées au cancer glycane être exploité pour le développement de biomarqueurs visant à diagnostiquer à un stade précoce de la maladie. En conséquence, nous avons développé un spectromètre de masse à base de workflow qui intègre une chromatographie sur des matrices d&#39;affinité formé à partir des lectines, des protéines qui se lient structures glycanniques spécifiques. Les lectines Sambucus nigra (SNA) et Aleuria aurantia (AAL), qui lient l&#39;acide sialique et le fucose, respectivement, ont été couplés de manière covalente à des billes Poros (Applied Biosystems) et emballés dans des colonnes PEEK pour la chromatographie liquide à haute pression (CLHP). Brièvement, le plasma était appauvri des quatorze protéines les plus abondantes en utilisant un système d&#39;affinité plusieurs retrait (MARS-14; Agilent). Plasma appauvri a été digérés par la trypsine et séparés en flux continu et des fractions lié par SNA ou AAD HPLC. Les fractions ont été traitées avec PNGaseF pour enlever N-glycanes, et analysés par LC-MS/MS sur une Elite QStar. Les données ont été analysées en utilisant le logiciel Mascot. Le dispositif expérimental comprenait contrôles positifs-fucosylé et sialylées humaine glycopeptides et la lactoferrine négatifs des contrôles de haut glycopeptides mannose à partir de Saccharomyces cerevisiae, qui ont été utilisés pour contrôler la spécificité de la capture lectine. Les principales caractéristiques de ce flux de travail comprennent la reproductibilité dérivé du format HPLC, l&#39;identification positive des glycopeptides capturé et PNGaseF traités de leurs motifs Asn-Xxx-Ser/Thr désamidés, et évaluation de la qualité selon les normes glycoprotéine. Protocole d&#39;optimisation comprenait également déterminer le ratio approprié de matériau de départ à la capacité de la colonne, l&#39;identification de la capture la plus efficace et tampons d&#39;élution, et le suivi des traitements PNGaseF pour assurer déglycosylation plein. Les orientations futures comprennent l&#39;utilisation de ce flux de travail pour effectuer des expériences de masse de découverte basée sur la spectrométrie de plasma de patients du cancer du sein et les individus de contrôle.

Lectine conjuguée perles POROS étaient employés pour la HPLC. Normes glycopeptides ont servi de contrôles positifs et négatifs. MARS-14 appauvri, digérés par la trypsine plasma humain a été chromatographié et accréditives (FT) et les fractions collectées liés à des analyses ESI-LC-MS/MS. Glycopeptides ont été enrichis dans la fraction liée par rapport à FT.

Une méthode CLHP lectine pour enrichir sélectivement peptides glycosylés d&#39;échantillons biologiques complexes

Les glycanes constituent une classe importante de modifications post-traductionnelles. Généralement présents sur les molécules sécrétées et extracellulaires, les structures des glycanes signalent le ...

Cette procédure permet d'isoler spécifiquement des glycopeptides glycosylés à partir de plasma humain. Le plasma est digéré par la trypsine afin d'obtenir un mélange de peptides et de glycopeptides, ainsi que des étalons de glycopeptides. Des contrôles positifs et négatifs pour la chromatographie d'affinité aux lectines sont ajoutés au plasma.L'échantillon est soumis à une chromatographie d'affinité aux lectines basée sur la chromatographie liquide à haute pression. Les lectines utilisées se lient respectivement au diffuco et à l'acide sialique ; les peptides et les glycopeptides sans rapport s'éluent de la colonne dans la fraction de passage. L'acide acétique est utilisé pour éluer la fraction liée de la colonne.Ceci est enrichi en glycopeptides spécifiquement modifiés. Bonjour, je suis Penny Drake du laboratoire de Susan Fisher, au sein du Département d'obstétrique, de gynécologie et des sciences de la reproduction, ainsi que du centre de spectrométrie de masse San Lamore à l'Université de Californie à San Francisco. Et moi, c'est Eric Johansen, également du centre de spectrométrie de masse Sandler Moore et du laboratoire Fisher.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure de chromatographie par lectine afin d'enrichir les glycopeptides provenant du plasma humain et d'autres mélanges complexes. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire comme outil général possédant de nombreuses applications. Par exemple, elle joue un rôle important dans notre flux de travail de découverte de biomarqueurs du cancer du sein.Commençons. Pour commencer cette procédure, portez un masque afin de vous protéger contre l'inhalation des billes. Ensuite, pesez 100 milligrammes de billes porro et transférez-les dans un tube einor propre.Environ 300 microlitres de billes sont nécessaires pour charger une colonne. En outre, peser la lectine non conjuguée et la transférer dans un tube einor propre. Les lectines SNA et AAL sont utilisées.Procédez à l'ajout de PBS à la lectine afin d'obtenir une solution de cinq à vingt milligrammes par millilitre. Réservez 25 microlitres de cette solution préconjuguée. Ensuite, lavez les porro speeds en ajoutant un millilitre de PBS et en centrifugeant dans une microcentrifugeuse à vitesse maximale.Pendant trois minutes, retirez le surnageant et répétez le lavage. Travaillez désormais sous la hotte et transférez la solution de lectine restante vers les porro speeds lavés. Ajoutez ensuite du borohydrure de sodium à une concentration finale de 50 millimolaire.Remarquez que le borohydrure de sodium est toxique et que les déchets doivent être éliminés de manière appropriée. Fermez hermétiquement le tube avec un bouchon et placez-le sur un agitateur pour réagir toute la nuit à température ambiante. Après l'incubation nocturne de la lectine avec les billes de porro, centrifugez pour récupérer les billes de porro. Encore une fois, retirez le surnageant et conservez-le comme solution post-conjugaison afin de bloquer les sites réactifs restants sur les billes.Tout d'abord, lavez les billes par centrifugation avec un millilitre de tampon d'arrêt composé de un molaire de CL à un pH de 7,4. Ajoutez ensuite un millilitre de tampon d'arrêt et du hydride de sodium sano à une concentration finale de 50 millimolaire. Placez le tube sur un agitateur rotatif et incubez à température ambiante pendant 30 minutes.L'extinction est maintenant terminée. Centrifuger les billes, comme précédemment.Éliminer le surnageant, puis laver les billes cinq fois avec un millilitre de chlorure de sodium à une molaire à chaque fois, et jeter le surnageant. Réaliser un dosage de la concentration en protéines sur les solutions de lectine avant et après conjugaison, et utiliser la différence pour déterminer la quantité de protéine qui a été conjuguée aux billes. Les concentrations cibles de lectine se situent entre deux et 20 milligrammes par millilitre, calculées comme la quantité de protéine conjuguée par volume de bille.Les billes de porro conjuguées sont désormais prêtes à être chargées dans une colonne. Pour charger les billes dans une colonne, assemblez le système de chargement composé de deux colonnes fixées sur un support en anneau métallique. La colonne supérieure sert de réservoir pour le matériau de chargement.Le système d’emballage se compose, de bas en haut, d’un réducteur de pression, d’un raccord de colonne d’extrémité un pour la colonne cible, d’un raccord de colonne d’extrémité, d’un connecteur de colonne deux, d’un raccord de colonne d’extrémité trois, de la colonne réservoir, d’un raccord de colonne d’extrémité quatre et d’un embout final. Ensuite, resuspendre les 300 microliters de porro speeds dans 600.Microlitres de tampon A Pour charger une colonne, transférez les billes dans la colonne du réservoir supérieur. Ajoutez le tampon A jusqu'à ce qu'il atteigne le haut de la colonne. Placez délicatement le raccord d'extrémité sur le dessus de la colonne.Tentez d'éviter les bulles d'air dans la colonne. Connectez le raccord supérieur de la colonne au système HPLC. Emballez la colonne en faisant circuler le tampon A ou le PBS à travers le système.Commencez avec un débit de 0,5 millilitre par minute. Augmentez le débit de 0,5 millilitre par minute chaque minute jusqu'à atteindre soit 4 millilitres par minute, soit la pression maximale. Poursuivez au débit maximal possible jusqu'à ce qu'au moins 35 millilitres de tampon aient traversé la colonne.Lorsque l'opération est terminée, arrêtez les pompes et laissez la pression dans la colonne chuter en dessous de 20 psi. Maintenant que la colonne est compactée, démontez délicatement le système de bourrage en partant du haut. Lorsque vous atteignez le raccord final de la colonne deux, retirez-le avec précaution.À l’aide d’un rasoir, essuyez délicatement le matériau tassé qui dépasse du haut de la colonne. N’appliquez pas de pression sur les billes pendant cette opération. Détachez la colonne tassée du support sur trépied.Placer une nouvelle fritte dans un nouveau raccord d'extrémité et retourner la colonne emballée pour la connecter au raccord d'extrémité FR plus sur l'extrémité ouverte de la colonne. La colonne est désormais prête pour l'analyse HPLC. Lorsqu'elle n'est pas utilisée, la colonne peut être conservée dans du PBS contenant 0,5 % d'azoture de sodium à quatre degrés Celsius pendant jusqu'à six mois.Les détails de programmation de votre HPLC varient selon votre configuration et les spécificités du logiciel du fabricant. Ici, nous utilisons un HPLC microme paradigm MG four sur cet appareil. Les méthodes sont créées et accessibles sous l'onglet configuration situé en haut du programme à l'écran.La méthode présentée, qui est également décrite en détail dans le protocole écrit accompagnant. Si l'on utilise un programme d'échantillonneur automatique, suivre également le protocole écrit. Utiliser le tampon A comme précédemment et le tampon B pour effectuer la chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC) et maintenir les tampons ainsi que les colonnes à température ambiante.Programmez le détecteur UV pour lire à deux et 80 nanomètres de zéro à 19 minutes et 50 secondes. Réglez l'axe Y pour détecter de faibles niveaux d'absorbance dans une plage allant de zéro à 50 unités d'absorbance. Ensuite, préparez les échantillons.Les échantillons test proviennent de plasma humain appauvri des 14 protéines les plus abondantes à l'aide d'une colonne MARS. Les échantillons de plasma appauvri et deux étalons, la lactoferrine humaine et l'invertase de levure, sont chacun digérés individuellement par la trypsine et désalinisés comme décrit précédemment.Pour neutraliser les échantillons, préparez un tampon de neutralisation dans les vials d'échantillons qui recueilleront l'EIT pour le paradigme MG : un vial recueille le flux passant et trois autres, l'éluate. Environ 1,5 millilitre de tampon seront nécessaires pour neutraliser 1 millilitre d'EIT. Le pH cible après neutralisation est compris entre 7,0 et 8,0.Veillez à tester le pH final à l'aide de papier indicateur de pH. Désalez les échantillons comme décrit plus loin dans ce protocole. Et resuspendez l'échantillon dans un millilitre de tampon A pour de meilleurs résultats.Réalisez trois réplicats expérimentaux afin que les données puissent être comparées et combinées. Pour préparer les échantillons pour trois réplicats, ajoutez trois picomoles de trypsine, d'invertase digérée et un microlitre de lectine purifiée par HPLC spécifique à la lactoferrine à 30 microlitres d'équivalents de plasma digérés par la trypsine déplétés de Mars ou pe. Cela correspond à environ 50 microgrammes de protéines plasmatiques utilisées pour chaque réplicat ; ajoutez le tampon A à l'échantillon pour atteindre un volume final de 330 microlitres, soit 110 microlitres par réplicat expérimental, en utilisant d'abord soit la colonne de lectine AAL, soit SNA. Exécutez deux méthodes témoins en injectant uniquement le tampon A. Assurez-vous que la colonne de lectine correspond à la lectine spécifique à la lactoferrine utilisée comme étalon et précédemment purifiée par chromatographie.Les trois échantillons plasmatiques sont injectés en introduisant un blanc entre chaque échantillon injecté, pour un total de sept analyses HPLC. Les fractions provenant des analyses du blanc n'ont pas besoin d'être collectées. Là encore, veillez à neutraliser les échantillons en ajoutant du tampon de neutralisation dans les vials d'échantillons qui recueillent l'éluate après la désalage et la digestion P-N-G-A-F ; les échantillons seront alors prêts pour l'analyse en spectrométrie de masse.Utilisez une cartouche de 1 ml d’oasis H-L-B-S-P-E pour chaque fraction HBLC des échantillons standards de lactoferrine et des échantillons expérimentaux afin de désaler. Commencez par fixer le nombre requis de cartouches à un système sous vide. Mouillez chaque cartouche avec un millilitre d’acétonitrile à 80 % dans de l’acide formique à 1 %.Le manomètre à vide sur le collecteur doit indiquer entre cinq et vingt pouces. Équilibrer les cartouches avec 1,5 millilitre d'acide formique à 0,1 % sous vide. Là encore, le manomètre à vide sur le collecteur doit indiquer entre cinq et vingt pouces.Le mercure charge tout le volume d'un échantillon sur une cartouche. À présent, le manomètre sous vide du bloc devrait indiquer entre deux et 2,5 pouces. Le mercure et le débit ne doivent pas dépasser un millilitre par minute.Lavez les cartouches trois fois avec un millilitre d'acide formique à 0,1 % en utilisant un tube de collecte étiqueté unique pour chaque cartouche. Éluisez les glycopeptides avec un millilitre d'acétonitrile à 80 % dans de l'acide formique à 0,1 %, puis neutralisez l'EIT en ajoutant 60 microlitres de bicarbonate d'ammonium 0,5 molaire à chaque tube de collecte. Le pH cible neutralisé doit être compris entre 7,0 et 8,0.Vérifiez le pH final à l'aide de papier indicateur de pH. Concentrez les peptides élus à environ 50 microlitres à l'aide d'un centrifugeur à vide, comme le Thermo Savant Speed Vac, pendant environ deux heures à 35 degrés Celsius. Vérifiez à nouveau le pH de l'échantillon après concentration afin de vous assurer qu'il se situe entre 7,0 et 8,0. Si nécessaire, ajoutez du bicarbonate d'ammonium 50 millimolaire pour augmenter le pH.Si le volume final de l'échantillon est supérieur à 100 microlitres, concentrer l'échantillon par centrifugation sous vide jusqu'à ce qu'il se situe entre 50 et 100 microlitres. Enfin, éliminer les glucides N-liés des peptides en ajoutant 250 unités de peptide N-glycosidase F sans glycérol ou P-N-G-A-F à chaque tube d'échantillon et incuber à 37 degrés Celsius toute la nuit. Après l'incubation nocturne avec P-N-G-S-F, utiliser des embouts de pipette zip tip contenant une matrice en phase inverse C 18 pour désaler les échantillons avant de commencer.Préparez deux gouttes, l'une d'acide formique à 0,1 % et l'autre d'acétonitrile à 80 % additionné d'acide formique à 0,1 %, sur un morceau de paraforme, pour le lavage et l'élution. Les gouttes sont utilisées afin d'éviter la contamination croisée des peptides entre les échantillons, et de nouvelles gouttes sont préparées pour chaque échantillon prélevé avec une pipette à embout. Commencez par humidifier la pipette à embout avec la solution d'acétonitrile. Équilibrez la pipette à embout en pipetant de haut en bas trois fois avec 10 microlitres d'acide formique à 0,1 %.Chargez l'échantillon en pipetant vers le haut et vers le bas 10 fois. Ensuite, lavez la pointe avec 10 microlitres d'acide formique à 0,1 % cinq fois. Enfin, éluez l'échantillon deux fois avec 80 % d'acétonitrile en acide formique à 1 %, et récupérez les peptides élusés dans un tube Eppendorf.Réduisez le volume de l'échantillon à moins de deux microlitres par concentration dans un centrifugeuse à vide, puis finissez par reprendre les échantillons dans 20 microlitres d'acide formique à 0,1 %. Les échantillons sont désormais prêts à être analysés par L-C-M-S-M-S. La conjugaison porro donne généralement des concentrations de lectine sur billes comprises entre deux et 20 milligrammes par millilitre, ce qui est optimal pour la chromatographie d'affinité.La chromatographie d'affinité par lectine de plasma humain appauvri en albume et digéré par la trypsine enrichit généralement les glycopeptides dans la fraction liée. Notre protocole permet d'identifier les glycopeptides N-liés, qui contiennent la séquence de consensus NXS ou NXT, où X est n'importe quel acide aminé sauf la proline. Le traitement par la PNGF élimine les glycanes liés et déaminate le résidu d'asparagine auquel les glycanes étaient attachés.La datation entraîne un décalage de masse d'un Dalton du peptide déglycosylé ou du déglycopeptide par rapport au peptide non modifié. Ainsi, les glycopeptides DEG sont identifiés comme des peptides contenant la séquence consensus liée à l'azote, où le résidu d'asparagine dans la séquence consensus est désaminé, observé comme une différence de masse de plus un par rapport à un résidu d'asparagine non modifié. Deux spectres exemples illustrent ce concept.Le spectre supérieur montre la fragmentation d'un peptide non modifié contenant la séquence consensus EnLink. Le spectre inférieur montre la fragmentation du même peptide comportant un résidu d'asparagine déaminée au sein de la séquence consensus EnLink. Les ions moléculaires entourés des fragments Y sept, Y huit et B trois du peptide déamidé présentent une masse accrue d'un dalton par rapport à leurs homologues dans le peptide non modifié.Ce décalage de masse indique que le peptide du spectre inférieur contient un résidu d'asparagine déamidé. En général, en utilisant un QStar Elite, entre 1000 et 1300 peptides au total seront identifiés dans la fraction de passage, et entre 200 et 400 peptides seront identifiés dans la fraction liée. En moyenne, la fraction de passage provenant d'une chromatographie à l'a-l ou à la SNA contient de 2 à 4 % de peptides déglycosylés, tandis que 30 à 50 % des peptides récupérés dans la fraction liée sont des peptides déglycosylés.Nous utilisons le terme deg glycopeptides plutôt que glycopeptides, car les molécules dés-glycosylées et déaminées sont observées lors de l'analyse en spectrométrie de masse. Toutefois, nous proposons que la majorité des glycopeptides DEG présents dans nos échantillons étaient auparavant des glycopeptides non liés, qui ont été dés-glycosylés et déaminés par le traitement à la PN GF. L'enrichissement en glycopeptides dés-glycosylés dans notre échantillon lié soutient cette hypothèse et nous permet d'utiliser la détection des glycopeptides D comme indicateur indirect des glycopeptides capturés par notre protocole de chromatographie d'affinité aux lectines.Deux ou plusieurs glycopeptides distincts d'invertase doivent être observés dans la fraction de passage, et deux ou plusieurs glycopeptides déglycosylés distincts de lactoferrine dans la fraction liée. Nous venons de vous montrer comment préparer des colonnes de lectine et réaliser une chromatographie d'affinité par lectine dans un format HPLC. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de partir d'échantillons de glycopeptides de haute qualité, de surveiller le pH de vos échantillons tout au long de l'expérience, et de confirmer la qualité de votre chromatographie à l'aide d'étalons de glycopeptides.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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