Name: La libération de dopamine au niveau individuel terminaisons présynaptiques visualisées avec FFNs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-31T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie optique pour visualiser la libération de dopamine au niveau des terminaisons présynaptiques individuelles en utilisant le FFN 511. Cette technique permet d'étudier la neurotransmission dopaminergique en temps réel.

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D. Les Sames merci Harold G. &amp; Y. Leila Mathers Charitable Foundation et l&#39;Université de Columbia initiatives en sciences et génie. D. Sames et D. Sulzer remercier la Fondation McKnight pour les innovations technologiques dans McKnight Prix neurosciences D. Sulzer grâce NIDA, NIMH, et la Picower et Fondations maladie de Parkinson. H. Zhang grâce NARSAD. RH Edwards remercie la Fondation Michael J. Fox, la National Parkinson Foundation, le NIDA et NiMH. Nous remercions Robert Burke pour la 6-OHDA injections et des conseils, Sonders Mark pour des discussions utiles, Merek Siu pour la programmation de l&#39;analyse d&#39;imagerie, et Jan Schmoranzer pour le soutien technique avec l&#39;installation de microscopie TIRF.

Cette méthode a été utilisée dans la recherche présentée dans <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/324/5933/1441">gubernator et al., Science 324 (5933). 1441-1444 (2009)</a> . 1. Préparation des tranches striatales aiguë <ol><li> Avant de préparer aiguë tranches striatales, il faut oxygéner le liquide céphalo-rachidien artificiel (FCSA) et le refroidir avec de la glace pendant au moins 15 minutes avant l&#39;extraction du cerveau. Gardez le froid de la glace ACSF et oxygéné pendant la dissection. ACSF (en mM): NaCl 125, KCl 2,5, NaHCO 3 26, CaCl 2 2,4, MgSO4 1,3, KH 2 PO 4 0,3, glucose 10, HEPES 5; pH 7.3 à 7.4, 290-295 mOsm. </li><li> Décapitez souris mâle sans anesthésie. </li><li> Extrait de l&#39;ensemble du cerveau de la souris, et le monter sur le plateau vibratome mis sur le vibratome utilisant Krazy Glue ®. L&#39;extraction du cerveau et de montage doit être fait dans les 2 minutes. Pendant ce temps, veillez à conserver le froid de la glace ACSF et oxygénée pour garder le tissu sain. </li><li> Couper des tranches de cerveau coronale striatum à une épaisseur de 250μm entre bregma 1.54 à 0.62 1. Trois tranches entières seront obtenus qui peuvent ensuite être coupée en 6 tranches moitié avec une aiguille. </li><li> Incuber les coupes de cerveau de l&#39;ACSF oxygénée à température ambiante pendant au moins 1 heure avant le chargement de la sonde. Tranches d&#39;affichage bonne FFN511 chargement et rester actifs pour l&#39;imagerie jusqu&#39;à 4 heures après la préparation tranche. </li></ol> 2. Chargement FFN511 <ol><li> Préparer FFN511 solution de chargement (10 uM FFN511 dans ACSF); également préparer 100 microns ADVASEP-7 dans l&#39;ACSF. Toutes les solutions doivent être fraîchement préparés et oxygéné au moins 15 minutes avant le chargement dans les tranches. </li><li> Individuellement incuber tranche avec FFN511 solution de chargement pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> Retirez ensuite le colorant liée au tissu extracellulaire en incubant la tranche chargé dans oxygénée 100 microns ADVASEP-7 ACSF pendant 30 minutes à température ambiante 2. Les tranches sont maintenant prêts pour l&#39;imagerie. </li></ol> 3. Imagerie FFN511 dans les tranches de cerveau L&#39;imagerie de FFN511 dans les tranches est réalisée en utilisant un microscope laser multiphotonique à balayage. Nous utilisons un Prairies Ultima multiphotonique microscope à balayage laser (Nous étions en utilisant un Zeiss LSM 510 NLO multiphotonique microscope à balayage laser, préalablement et certains résultats ont été obtenus avec le microscope Zeiss). <ol><li> Placez la tranche FFN511-chargés dans la chambre d&#39;enregistrement (RC-27L, Warner) et superfuse avec ACSF oxygénée à un débit de 1-2 ml par minute. Ensuite, placez une harpe de platine avec des cordes en nylon sur le dessus de la tranche afin de minimiser le mouvement pendant l&#39;expérience. Pour réduire davantage le mouvement, permettre à la tranche de se stabiliser pendant au moins 10 minutes dans la chambre avant de l&#39;imagerie. </li><li> Visualisez et repérez le striatum dorsal avec la luminescence champ lumineux sous un objectif à immersion d&#39;eau 10x. </li><li> Place et la position des électrodes bipolaires de tungstène tordus dans cette région, si l&#39;exécution d&#39;une expérience de stimulation. La zone d&#39;imagerie idéale se situe à moins de 300 um entre les deux extrémités de l&#39;électrode bipolaire de stimulation. Placez cette région au centre du champ visuel. </li><li> Image FFN511 marqué terminaux striatum sous un 63x (0,9 NA) L&#39;objectif ultraviolets immersion dans l&#39;eau. FFN511 est excité à 760 nm avec un laser Mai Tai de la physique et la fluorescence spectrale optimale des terminaux striatum est vu à travers un filtre passe-bande (480-520 nm). Les images sont capturées en 12 bits avec le format 75 x 75 um régions d&#39;intérêt à la résolution 512 x 512 pixels. Pour stimuler les expériences de décoloration, pour compenser l&#39;axe z décalage, un z-série d&#39;images 5-7, séparés par une um dans le plan z, est obtenue pour chaque période de temps. </li></ol> 4. FFN511 décoloration L&#39;étiquette peut être FFN511 décolorés, soit par une forte concentration de KCl (nous utilisons 70 mM de KCl), (+)-amphétamine sulfate (AMPH, 20 uM), ou la stimulation électrique. Dans l&#39;expérience de décoloration de KCl, quand une solution de potassium haute ACSF est appliqué à la tranche de cerveau, le FFN511 destains l&#39;étiquette dans les 2 minutes. Enregistrement xyz-t images pour suivre FFN511 décoloration au fil du temps. La section suivante décrit la stimulation électrique dépendant de la dopamine décoloration terminale: <ol><li> Pour suivre FFN511 décoloration au fil du temps, xyz-t images sont enregistrées. Afin de garantir un minimum de mouvement de la tranche (moins de 4 um de l&#39;axe z) et aucun photoblanchiment par les images laser de contrôle, des séries chronologiques de la Z-stack doit être obtenu au moins 5 minutes avant la stimulation. Sinon, ajuster la puissance du laser. </li><li> Suite à ces images de contrôle, de continuer l&#39;imagerie xyz-t tandis commencer la stimulation à des fréquences de 1, 4 ou 20 Hz. Les stimuli à 1, 4 ou 20 Hz (300 ms x 1 mA) sont appliquées dans le striatum localement par un isolateur de relance Iso-Flex déclenchée par un maître-8 générateur d&#39;impulsions (AMPI, Jérusalem, Israël) en utilisant des électrodes bipolaires. Afin de minimiserla variation de la dépolarisation des sites de libération, nous avons utilisé un protocole de stimulation appliquant 150% de l&#39;intensité de stimulation maximale déterminée par voltampérométrie cyclique. </li><li> Utilisez un logiciel approprié pour l&#39;analyse d&#39;imagerie. Dans notre laboratoire, nous utilisons l&#39;image J (Wayne Rosband, National Institutes of Health, Rockville, MD) et personnalisée écrite logiciels en IDL (Research Systems, Boulder, CO) afin de quantifier la fluorescence lacrymaux et les changements avec temps3. </li></ol> Résultats Represenative La figure 1 montre le chargement dans FFN511 tranche striatum est maintenant terminée. Images représentant l&#39;aide de l&#39;objectif 10x et 60x sont présentés dans la Fig.1. Le marquage sélectif des terminaux de dopamine peut être décolorés par 20 uM amphétamines. La figure 2 montre décoloration des FFN511 étiquetage par le KCl élevé. La figure 3 montre décoloration des FFN511 étiquetage par stimulation électrique locale. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1 FFN511 étiquettes terminaux de dopamine dans vivons cortico-striatale tranches aiguë (A) dans l&#39;étiquetage par FFN511 aiguë direct cortico-striatale tranche:.. Étiquetage abondant dans le striatum (STR), l&#39;étiquetage clairsemés dans le cortex (CTX), et aucune étiquette corps calleux (CC). Barre d&#39;échelle: 100. Um (B) Décoloration des FFN511 du striatum par l&#39;amphétamine. Panneaux gauche: avant d&#39;amphétamines; panneaux à droite: après 20 minutes de 20 uM amphétamines. Barre d&#39;échelle: 10 um. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Décoloration des FFN511 étiquetage par le KCl élevé. Étiquetage FFN511 est décolorée dans les 2 min d&#39;application de 70 mM de KCl dans l&#39;ACSF. Barre d&#39;échelle: 10 microns. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Fonction de la fréquence de décoloration des FFN511 étiquetage dans le striatum. (A) la stimulation locale à 4 Hz entraîné décoloration des bornes. La stimulation a commencé à t = 0. Barre d&#39;échelle: 5 um (B) Décoloration des FFN511 à 4 Hz est Ca 2 + - et dépendant de la fréquence.. Contrôles reçu aucune stimulation (153 points lacrymaux de 3 tranches). Décoloration avec du chlorure de cadmium (200 uM) était identique à des contrôles non stimulées (475 points lacrymaux de 5 tranches). Les courbes de décoloration pour chaque fréquence de stimulation ont été ajustées par une fonction de décroissance exponentielle simple et demi-vie (t 1 / 2) Les valeurs calculées comme τ x 0,693 (1 Hz: 765 points lacrymaux, de 9 tranches, 4 Hz: 410 points lacrymaux de 7 tranches, 20 Hz: 416 points lacrymaux de 6 tranches). S&#39;il vous plaît se référer à la micrographie vidéo à partir de 2-microscopie biphotonique des FFN511 décoloration lors de l&#39;exocytose dans une préparation de tranches de cerveau du striatum.

<ol><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).</li>
<li>Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1-43+in+C.+elegans%2C+lamprey%2C+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat.</a> Neuron. 24, 8098-8117 (1999).</li>
<li>Bamford, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosynaptic+dopamine+neurotransmission+selects+sets+of+corticostriatal+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals.</a> Neuron. 42, 653-653 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour visualiser la neurotransmission dopaminergique optiquement en utilisant des analogues fluorescents. FFN511 est la première génération de FFNs nous avons développé. Bien qu&#39;il ait été conçue en ciblant les neurones du transporteur vésiculaire monoamine (VMAT2) qui transporte les neurotransmetteurs inhibiteurs de la monoamine du cytoplasme dans des vésicules synaptiques, et les labels spécifiquement terminaux de dopamine dans le striatum et les catécholamines présumée et / ou les terminaux de la sérotonine dans le cortex (comme indiqué dans la science papier), une période de chargement appropriée est essentielle pour la spécificité puisque FFN511 est relativement hydrophobe. Nous avons constaté que d&#39;incubation de plus de 40 minutes se traduira par un marquage non spécifique approfondie en tranches striatales. La spécificité peut être directement déterminée par de décoloration en utilisant une forte concentration de KCl, ce qui devrait entraîner la libération du FFN dans les vésicules synaptiques fonctionnelles. L&#39;exposition de la tranche d&#39;FFN511 pour les moins de 15 minutes entraînera signal fluorescent faible en raison de l&#39;insuffisance de chargement du colorant dans les terminaux. Dans ce protocole, nous utilisons 100 microns ADVASEP-7 pour éliminer le colorant liée au tissu extracellulaire. Cette étape n&#39;est pas nécessaire, mais si elle est omise, le temps de purge de l&#39;ACSF a besoin d&#39;être prolongée. En résumé, selon la préparation que vous avez choisi, vous aurez besoin de modifier la période de concentration et de chargement pour déterminer l&#39;étiquetage optimal.

<table><tbody><tr><td>FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one)</td><td>Université Columbia - Laboratoire Dalibor Sames</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADVASEP-7 </td><td>CyDex</td><td>AR-OA7-005</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d'enregistrement RC-27L</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0375</td><td></td></tr><tr><td>Support PELCO PrepEze à 6 puits</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>36157-1</td><td>Pour l'incubation des tranches</td></tr><tr><td>Stimulateur d'impulsions Master-8 et isolateur de stimulus Iso-Flex</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la libération de dopamine au niveau individuel terminaisons présynaptiques visualisées avec ffns

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

Le système nerveux transmet des signaux entre les neurones via la libération de neurotransmetteurs lors de la fusion des vésicules synaptiques. Pour observer l&#39;absorption et la libération de neurotransmetteurs différents terminaux présynaptiques directement, nous avons conçu fluorescentes faux neurotransmetteurs comme substrats pour le transporteur de vésicules synaptiques inhibiteurs de la monoamine. L&#39;utilisation de ces sondes pour la libération de dopamine dans le striatum l&#39;image, nous avons fait plusieurs observations pertinentes à la plasticité synaptique. Nous avons constaté que la fraction de vésicules synaptiques libérant des neurotransmetteurs par stimulus était dépendante de la fréquence de stimulation. Une cinétique distincte «réserve» de la population de vésicules synaptiques n&#39;a pas été observé dans ces conditions expérimentales. Une hétérogénéité dépendant de la fréquence des terminaisons présynaptiques a été révélé que dépendait en partie sur les récepteurs dopaminergiques D2, indiquant un mécanisme de dépendant de la fréquence de codage de la sélection présynaptique. Hui Zhang et Niko G. gubernator contribué également à ce travail.

Un nouveau moyen de mesurer la neurotransmission dopaminergique optiquement en utilisant des analogues fluorescents.

La libération de dopamine au niveau individuel terminaisons présynaptiques visualisées avec FFNs

Le système nerveux transmet des signaux entre les neurones via la libération de neurotransmetteurs lors de la fusion des vésicules synaptiques. Pour observer la recapture des neurotransmetteurs et...

Le faux neurotransmetteur fluorescent. FFN 511 est le monoamine fluorescent qui peut agir comme substrat pour le transporteur synaptique physique de monoamine lorsqu'il est appliqué sur des tranches de cerveau. FFN 511 est capté par les vésicules synaptiques dopaminergiques via le transporteur de monoamine et peut être utilisé pour visualiser directement la libération du neurotransmetteur à partir des terminaisons présynaptiques des neurones monoaminergiques, tels que ceux du stratum S. La libération du neurotransmetteur à partir des terminaisons est visible dans la tranche sous forme de réduction des signaux fluorescents ponctués.Dans cette vidéo, des tranches coronales de sal d'une épaisseur de 250 micromètres sont préparées à l'aide d'un vibratome, colorées avec le FFN 511 et observées au microscope laser multiphoton. Des expériences de cinétique sont présentées, révélant une hétérogénéité dépendante de la fréquence de la libération de iCal. Bonjour, je suis HU du laboratoire de David du Département de neurologie de l'Université Columbia.Bonjour, je suis Minerva, également du laboratoire Soldier. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de marquer les terminaisons dopaminergiques dans des tranches de cerveau à l'aide de faux neurotransmetteurs fluorescents. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la libération de dopamine.Commençons. Avant de préparer des tranches aiguës de sal, il faut oxygéner le liquide céphalo-rachidien artificiel A CSF et le refroidir avec de la glace pendant au moins 15 minutes avant l'extraction du cerveau. Gardez le A CSF glacé et oxygéné pendant la dissection. Extrayez ensuite l'ensemble du cerveau de la souris et fixez-le sur le plateau du vibrotome à l'aide de colle cyanoacrylate. L'extraction et le montage du cerveau doivent être effectués en moins de deux minutes.Remplissez le plateau avec du LCR A oxygéné refroidi et découpez des tranches coronales droites de cerveau d'une épaisseur de 250 micromètres entre +1,54 et +0,623. Des tranches de trou seront obtenues, que l'on pourra diviser en six demi-tranches à l'aide d'une aiguille. Incubez les tranches de cerveau dans du LCR A oxygéné à température ambiante pendant au moins une heure, pendant que les tranches de cerveau sont incubées.Dans un LCR A oxygéné, préparez la solution de chargement de FFN 511 à 10 micromolaire en ajoutant la solution mère de FFN 511 à 10 millimolaire au LCR A. Ensuite, préparez une solution de A-D-V-A-S-E-P sept à cent micromolaire dans du LCR A et oxygénez les deux solutions pendant au moins 15 minutes avant de les charger individuellement dans les tranches. Incubez chaque tranche cérébrale avec la solution de chargement de FFN 511 pendant 30 minutes à température ambiante.Ensuite, retirez le di lié aux tissus extracellulaires en incubant la coupe chargée dans du CSF A oxygéné contenant 100 micromoles d'advers pendant 30 minutes à température ambiante. Les coupes sont désormais prêtes pour l'imagerie. La coloration par FFN 511 sera visualisée sur les coupes à l'aide d'un microscope à balayage laser multiphoton Prairie Ultima. Placez la coupe chargée en FFN 511 dans la chambre d'enregistrement et perfusez-la avec du CSF A oxygéné à un débit de un à deux millilitres par minute. Ensuite, placez par-dessus la coupe un harp en platine muni de fils en nylon afin de minimiser les mouvements.Pendant l'expérience, afin de minimiser davantage les mouvements, laisser les tranches se stabiliser pendant au moins 10 minutes dans la chambre avant l'acquisition d'images. Visualiser et localiser le striatum dorsal AUM en luminescence en champ clair à l’aide d’un objectif à immersion dans l’eau de 10 x, puis placer et positionner les électrodes bipolaires en tungstène torsadées dans cette région pour réaliser une expérience de stimulation. La zone d’imagerie au repos se situe à moins de 300 micromètres.Entre les deux pointes de l'électrode bipolaire de stimulation, placer cette région au centre de l'image du champ visuel FFN 511 marquant les terminaisons Sal, en utilisant un objectif à immersion dans l'eau de 63 x en ultraviolet. L'excitation de FFN 511 est réalisée à 760 nanomètres à l'aide d'un laser Mi Tai de Spectral Physics. La fluorescence optimale des terminaisons SAL est observée à travers un filtre passe-bande. Acquérir les images en format 12 bits, avec des régions d'intérêt de 75 par 75 micromètres et une résolution de 512 par 512 pixels. Un exemple d'image montrant des terminaisons dopaminergiques Sal marquées avec FFN 511 est présenté ici.L'étiquette FFN 511 peut être désintégrée soit par de fortes concentrations de chlorure de potassium ou de sulfate d'amphétamine, soit par une stimulation électrique dans l'expérience de rétention au chlorure de potassium, lorsque l'on applique une solution de liquide céphalorachidien contenant du potassium élevé sur la tranche de cerveau, l'étiquette FFN 511 se désintègre en quatre minutes. Enregistrer des images XYZT pour suivre la rétention de FFN 511 au fil du temps lors de la coloration par stimulation électrique. Obtenir une série temporelle d'images de contrôle de Zack avant la stimulation pendant au moins cinq minutes afin de s'assurer d'un déplacement minimal de la tranche et de l'absence de photoblanchiment par le laser après l'acquisition des images de contrôle.Poursuivez l'imagerie XYZT tout en démarrant la stimulation à des fréquences de un, quatre ou 20 hertz ; des stimuli sont appliqués localement au striatum à l’aide d’un isolateur de stimulus isoflex déclenché par un générateur d’impulsions maître de type huit, en utilisant des électrodes bipolaires. Cette vidéo montre la libération de FFN 511 lors de l’exocytose dans une coupe de cerveau SAL. Une fois le chargement de FFN 511 dans le SAL terminé, un marquage abondant est observé dans le striatum, un marquage clairsemé dans le cortex et aucun marquage dans le corps calleux.Le marquage sélectif des terminaisons dopaminergiques peut être observé par un chlorure de potassium élevé, comme le montrent ces images représentatives avant l'ajout de chlorure de potassium et deux minutes après l'application d'un chlorure de potassium à 70 millimolaire. Un retrait du liquide céphalorachidien contenant un marquage par le FFN 511 peut également être obtenu à l'aide d'amphétamine. Cette image montre le marquage par le FFN 511 dans le striatum avant l'administration d'amphétamine.Bien que cette image montre le striatum 20 minutes après une rétention par de l'amphétamine à 20 micromolaire, la rétention du FFN 511 marqué par une stimulation électrique locale est illustrée dans ces images, qui présentent le marquage du FFN 511 dans le striatum avant la stimulation, puis à 217 secondes et 514 secondes après le début de la stimulation à quatre hertz. Ce graphique de l'intensité de fluorescence normalisée en fonction du temps montre que la rétention du FFN 511 dépend du calcium et de la fréquence. Les témoins, représentés par des triangles non remplis, n'ont reçu aucune stimulation. La rétention en présence de chlorure de cadmium, représentée par des cercles non remplis, était identique à celle des témoins non stimulés.Les courbes de décroissance pour chaque fréquence de stimulation, représentées par les cercles colorés, ont été ajustées à l’aide d’une fonction de décroissance exponentielle simple, et les valeurs de demi-vie ont été calculées comme étant tau selon la formule 0,693/Naut. Nous venons de vous montrer comment charger un neurotransmetteur fluorescent FFN511 dans les terminaisons dopaminergiques sur une tranche aiguë d’al, ainsi que la manière de le libérer par un stimulus au potassium élevé et d’évoquer la stimulation. Il s’agit de la première méthode mise au point pour examiner optiquement la libération de neurotransmetteurs au niveau des terminaisons synaptiques individuelles.Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de garder les tranches très saines et de faire attention au temps de chargement, au blanchiment du fond, aux artefacts de mouvement et aux tranches, qui doivent présenter un bon chargement en FFN cinq 11 et permettre l'imagerie jusqu'à quatre heures après leur préparation. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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Découvrez une méthode d'imagerie optique pour visualiser la libération de dopamine au niveau des terminaisons présynaptiques individuelles en utilisant le FFN 511. Cette technique permet d'étudier la neurotransmission dopaminergique en temps réel.

La libération de dopamine au niveau individuel terminaisons présynaptiques visualisées avec FFNs

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