La libération de dopamine au niveau individuel terminaisons présynaptiques visualisées avec FFNs

Le faux neurotransmetteur fluorescent. FFN 511 est le monoamine fluorescent qui peut agir comme substrat pour le transporteur synaptique physique de monoamine lorsqu'il est appliqué sur des tranches de cerveau. FFN 511 est capté par les vésicules synaptiques dopaminergiques via le transporteur de monoamine et peut être utilisé pour visualiser directement la libération du neurotransmetteur à partir des terminaisons présynaptiques des neurones monoaminergiques, tels que ceux du stratum S. La libération du neurotransmetteur à partir des terminaisons est visible dans la tranche sous forme de réduction des signaux fluorescents ponctués.

Dans cette vidéo, des tranches coronales de sal d'une épaisseur de 250 micromètres sont préparées à l'aide d'un vibratome, colorées avec le FFN 511 et observées au microscope laser multiphoton. Des expériences de cinétique sont présentées, révélant une hétérogénéité dépendante de la fréquence de la libération de iCal. Bonjour, je suis HU du laboratoire de David du Département de neurologie de l'Université Columbia.

Bonjour, je suis Minerva, également du laboratoire Soldier. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de marquer les terminaisons dopaminergiques dans des tranches de cerveau à l'aide de faux neurotransmetteurs fluorescents. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la libération de dopamine.

Commençons. Avant de préparer des tranches aiguës de sal, il faut oxygéner le liquide céphalo-rachidien artificiel A CSF et le refroidir avec de la glace pendant au moins 15 minutes avant l'extraction du cerveau. Gardez le A CSF glacé et oxygéné pendant la dissection. Extrayez ensuite l'ensemble du cerveau de la souris et fixez-le sur le plateau du vibrotome à l'aide de colle cyanoacrylate. L'extraction et le montage du cerveau doivent être effectués en moins de deux minutes.

Remplissez le plateau avec du LCR A oxygéné refroidi et découpez des tranches coronales droites de cerveau d'une épaisseur de 250 micromètres entre +1,54 et +0,623. Des tranches de trou seront obtenues, que l'on pourra diviser en six demi-tranches à l'aide d'une aiguille. Incubez les tranches de cerveau dans du LCR A oxygéné à température ambiante pendant au moins une heure, pendant que les tranches de cerveau sont incubées.

Dans un LCR A oxygéné, préparez la solution de chargement de FFN 511 à 10 micromolaire en ajoutant la solution mère de FFN 511 à 10 millimolaire au LCR A. Ensuite, préparez une solution de A-D-V-A-S-E-P sept à cent micromolaire dans du LCR A et oxygénez les deux solutions pendant au moins 15 minutes avant de les charger individuellement dans les tranches. Incubez chaque tranche cérébrale avec la solution de chargement de FFN 511 pendant 30 minutes à température ambiante.

Ensuite, retirez le di lié aux tissus extracellulaires en incubant la coupe chargée dans du CSF A oxygéné contenant 100 micromoles d'advers pendant 30 minutes à température ambiante. Les coupes sont désormais prêtes pour l'imagerie. La coloration par FFN 511 sera visualisée sur les coupes à l'aide d'un microscope à balayage laser multiphoton Prairie Ultima. Placez la coupe chargée en FFN 511 dans la chambre d'enregistrement et perfusez-la avec du CSF A oxygéné à un débit de un à deux millilitres par minute. Ensuite, placez par-dessus la coupe un harp en platine muni de fils en nylon afin de minimiser les mouvements.

Pendant l'expérience, afin de minimiser davantage les mouvements, laisser les tranches se stabiliser pendant au moins 10 minutes dans la chambre avant l'acquisition d'images. Visualiser et localiser le striatum dorsal AUM en luminescence en champ clair à l’aide d’un objectif à immersion dans l’eau de 10 x, puis placer et positionner les électrodes bipolaires en tungstène torsadées dans cette région pour réaliser une expérience de stimulation. La zone d’imagerie au repos se situe à moins de 300 micromètres.

Entre les deux pointes de l'électrode bipolaire de stimulation, placer cette région au centre de l'image du champ visuel FFN 511 marquant les terminaisons Sal, en utilisant un objectif à immersion dans l'eau de 63 x en ultraviolet. L'excitation de FFN 511 est réalisée à 760 nanomètres à l'aide d'un laser Mi Tai de Spectral Physics. La fluorescence optimale des terminaisons SAL est observée à travers un filtre passe-bande. Acquérir les images en format 12 bits, avec des régions d'intérêt de 75 par 75 micromètres et une résolution de 512 par 512 pixels. Un exemple d'image montrant des terminaisons dopaminergiques Sal marquées avec FFN 511 est présenté ici.

L'étiquette FFN 511 peut être désintégrée soit par de fortes concentrations de chlorure de potassium ou de sulfate d'amphétamine, soit par une stimulation électrique dans l'expérience de rétention au chlorure de potassium, lorsque l'on applique une solution de liquide céphalorachidien contenant du potassium élevé sur la tranche de cerveau, l'étiquette FFN 511 se désintègre en quatre minutes. Enregistrer des images XYZT pour suivre la rétention de FFN 511 au fil du temps lors de la coloration par stimulation électrique. Obtenir une série temporelle d'images de contrôle de Zack avant la stimulation pendant au moins cinq minutes afin de s'assurer d'un déplacement minimal de la tranche et de l'absence de photoblanchiment par le laser après l'acquisition des images de contrôle.

Poursuivez l'imagerie XYZT tout en démarrant la stimulation à des fréquences de un, quatre ou 20 hertz ; des stimuli sont appliqués localement au striatum à l’aide d’un isolateur de stimulus isoflex déclenché par un générateur d’impulsions maître de type huit, en utilisant des électrodes bipolaires. Cette vidéo montre la libération de FFN 511 lors de l’exocytose dans une coupe de cerveau SAL. Une fois le chargement de FFN 511 dans le SAL terminé, un marquage abondant est observé dans le striatum, un marquage clairsemé dans le cortex et aucun marquage dans le corps calleux.

Le marquage sélectif des terminaisons dopaminergiques peut être observé par un chlorure de potassium élevé, comme le montrent ces images représentatives avant l'ajout de chlorure de potassium et deux minutes après l'application d'un chlorure de potassium à 70 millimolaire. Un retrait du liquide céphalorachidien contenant un marquage par le FFN 511 peut également être obtenu à l'aide d'amphétamine. Cette image montre le marquage par le FFN 511 dans le striatum avant l'administration d'amphétamine.

Bien que cette image montre le striatum 20 minutes après une rétention par de l'amphétamine à 20 micromolaire, la rétention du FFN 511 marqué par une stimulation électrique locale est illustrée dans ces images, qui présentent le marquage du FFN 511 dans le striatum avant la stimulation, puis à 217 secondes et 514 secondes après le début de la stimulation à quatre hertz. Ce graphique de l'intensité de fluorescence normalisée en fonction du temps montre que la rétention du FFN 511 dépend du calcium et de la fréquence. Les témoins, représentés par des triangles non remplis, n'ont reçu aucune stimulation. La rétention en présence de chlorure de cadmium, représentée par des cercles non remplis, était identique à celle des témoins non stimulés.

Les courbes de décroissance pour chaque fréquence de stimulation, représentées par les cercles colorés, ont été ajustées à l’aide d’une fonction de décroissance exponentielle simple, et les valeurs de demi-vie ont été calculées comme étant tau selon la formule 0,693/Naut. Nous venons de vous montrer comment charger un neurotransmetteur fluorescent FFN511 dans les terminaisons dopaminergiques sur une tranche aiguë d’al, ainsi que la manière de le libérer par un stimulus au potassium élevé et d’évoquer la stimulation. Il s’agit de la première méthode mise au point pour examiner optiquement la libération de neurotransmetteurs au niveau des terminaisons synaptiques individuelles.

Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de garder les tranches très saines et de faire attention au temps de chargement, au blanchiment du fond, aux artefacts de mouvement et aux tranches, qui doivent présenter un bon chargement en FFN cinq 11 et permettre l'imagerie jusqu'à quatre heures après leur préparation. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.