Assay anneau aortique

L’objectif global de l’essai de l’anneau aortique est de fournir un système expérimental flexible dans lequel des vaisseaux sanguins sont germés à partir de morceaux entiers d’aorte de souris à l’intérieur d’une matrice 3D. Ceci est réalisé en disséquant d’abord l’aorte thoracique d’une souris, puis en la nettoyant soigneusement de tout tissu environnant restant. Des tranches de l’aorte propre ou des anneaux aortiques sont placées dans des puits individuels d’une plaque de 48 puits, chacune contenant un extrait de matrice basale ou BME moulé en dômes.

Une goutte supplémentaire de BME entoure l’anneau dans une structure 3D. La matrice peut contenir n’importe quel réactif expérimental de votre choix. Après une incubation de plusieurs jours, on peut observer la germination de vaisseaux à partir des anneaux aortiques et le potentiel angiogénique des composés d’essai peut être évalué.

Bonjour, je suis Karen Bein du laboratoire du Dr E Lewis au Département de Biochimie Clinique de l’Université Beon du Négatif à Be Sheva Israël. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour le dosage de l’anneau aortique chez la souris. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les effets de divers matériaux sur la formation des vaisseaux sanguins.

Alors commençons. Pour commencer cette procédure, laissez l’extrait de matrice de socle ou BME décongeler sur de la glace ou à quatre degrés Celsius. Une fois décongelé, continuez à garder le BME au froid pour éviter qu’il ne se solidifie à nouveau.

Le jour de l’expérience, euthanasier une souris âgée de six à sept semaines par une injection standard de kétamine et de xylazine saigne rapidement dans les artères du cou, suivie d’une luxation cervicale. Commencez la procédure en essuyant l’animal avec de l’éthanol à 70 % dans une hotte stérile à flux laminaire. Ensuite, tout en travaillant sous une lunette de dissection, utilisez une pince stérile et des ciseaux de dissection pour effectuer une incision verticale de la peau et ouvrir la paroi péritonéale.

L’incision doit être faite pour exposer la partie supérieure du sternum où la cage thoracique est également coupée et le diaphragme retiré. Poussez soigneusement tous les organes de côté en exposant complètement l’aorte thoracique située le long de la colonne vertébrale avec l’aorte exposée, insérez de fines pinces à épiler stériles entre l’aorte et la colonne vertébrale. Ouvrez la pince à épiler et soulevez progressivement l’aorte de son lit, en séparant le segment thoracique du reste de l’aorte.

Maintenant que l’aorte est séparée, utilisez des ciseaux tranchants pour la couper de la souris en commençant par l’extrémité, qui se trouve à proximité des vaisseaux rénaux et se terminant près du cœur. Placez l’aorte thoracique excisée dans une boîte de Pétri remplie de PBS stérile et froid. Maintenant que l’aorte est retirée, les anneaux aortiques peuvent être préparés à l’aide de deux pinces stériles et sous des jumelles.

Nettoyez l’aorte thoracique des tissus adipeux environnants. Assurez-vous de ne pas endommager l’aorte et de ne la tenir que sur les bords. L’aorte doit être immergée à plusieurs reprises dans la boîte de Pétri contenant du PBS pour prévenir la déshydratation jusqu’à ce qu’elle soit finalement nettoyée.

Maintenant que l’aorte thoracique est propre, utilisez une lame chirurgicale et passez sous les jumelles pour couper l’aorte uniformément en anneaux d’un millimètre. À l’aide d’une règle placée sous la surface de coupe comme guide, assurez-vous d’utiliser une nouvelle lame et de la remplacer de temps en temps pour maintenir le tranchant. Les extrémités de l’aorte ne sont pas utilisées Après avoir coupé chaque anneau, utilisez une pince à épiler pour le transférer très doucement dans un nouveau plat contenant du PBS froid.

Placez tous les anneaux dans la même plaque contenant le PBS pour vous assurer que le test est randomisé. Étant donné que chaque segment de l’aorte a un potentiel angiogénique quelque peu différent, gardez les anneaux sur de la glace. Ensuite, préparez la plaque de dosage à l’aide des pointes de pipette pré-refroidies.

Ajouter à chaque puits dans une plaque de 48 puits autour d’une goutte de 150 microlitres de BME froid, la goutte se solidifie en un dôme à mi-mouvement. Le BME permet le transport de substances, la chimiotaxie des cellules et, surtout, la différenciation et la migration cellulaires qui conduisent à la formation de nouveaux vaisseaux. Les puits périmétriques sont remplis de PBS Pour éviter la déshydratation du BME, laissez la chute de BME se solidifier à 37 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes. Une fois que le BME s’est solidifié, soulevez soigneusement un anneau aortique de la boîte de Pétri à l’aide d’une pince à épiler afin d’éviter tout dommage, l’anneau doit être transféré à l’intérieur de la goutte de lipide qui se forme entre les pointes de la pince à épiler. En raison de la tension superficielle liquide, placez un seul anneau aortique en haut au centre de chaque dôme et incubez pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius sur le dessus de chaque anneau, ajoutez 150 microlitres supplémentaires de BME et incubez pendant 20 à 30 minutes.

À 37 degrés Celsius, l’anneau est maintenant enfermé dans BME et de dosage. Des matériaux peuvent être ajoutés à la plaque pour lancer le test. Supplément Pres précédemment préparé en milieu libre de sérum endothélial humain avec soit le matériel expérimental, soit le supplément de croissance des cellules endothéliales comme contrôle positif pour un contrôle négatif.

Utilisez le milieu seul. Ajoutez 500 microlitres de milieu de pré-supplément dans chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant six à 12 jours. Pendant cette période d’incubation, examinez la plaque au microscope et recherchez des vaisseaux sortant de l’aorte et des vaisseaux matures avancés identifiés par d’autres vaisseaux ramifiés.

Devrait s’étendre à partir du tissu de l’anneau en trois dimensions, photographier les anneaux entre le sixième et le 12e jour sous un stéréoscope à contraste de phase standard. De plus, collectez des surnageants à différents jours entre le sixième et le 12e jour et stockez-les à quatre degrés pour une utilisation dans la journée ou Eloqua et stockez-les à moins 20 ou moins 80 pour une utilisation future. Les surnageants peuvent être analysés par diverses techniques telles que Eliza pour le vgf ou le dosage des graisses pour les niveaux d’oxyde nitrique.

Ces images ont été recueillies 12 jours après la mise en place des anneaux dans les puits et l’incubation, avec l’une ou l’autre des cultures, soit le milieu observé dans la rangée supérieure des images, soit l’ECGS utilisé comme témoin positif de la germination des récipients observée. Dans le panneau inférieur. Chaque image est un instantané représentatif de quatre des 12 anneaux, qui est généralement utilisé dans le test par condition.

Le coin de chaque anneau aortique dans chaque puits séparé est noir. Lorsqu’ils sont photographiés de cette façon, les anneaux aortiques qui ont été exposés à l’ECGS montrent une croissance des vaisseaux et les flèches pointent vers plusieurs des nombreux vaisseaux qui se sont formés. Chaque vaisseau est caractérisé par des chaînes de cellules endothéliales avec des ramifications occasionnelles indiquant qu’elles sont matures.

Aucun récipient de germination ne peut être observé dans la culture. Puits moyens dans le panneau supérieur, Nous venons de vous montrer comment effectuer le dosage du cor aortique lors de cette procédure. Il est important de se rappeler de travailler avec précision et de comprendre leurs conditions.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.