Encyclopedia of Experiments: Biology
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- धुले हुए स्केट वाले कीड़े से शुरुआत करें और एसडीएस, डिटर्जेंट और डीडीटी युक्त लाइसिस बफर को जोड़ें, जो कि एक कमाई करने वाला एजेंट है। यह कोशिका विच्छेदन के लिए शरीर को उजागर करने वाले कीड़े के सुरक्षात्मक क्यूटिकल को तोड़ता है। सेल लाइसिस और मृत्यु को कम करने के लिए लाइसिस बफर के लंबे समय तक संपर्क में रहने से बचें।
इसके बाद, लाइसिस रिएजेंट्स को ठंडे आइसोलेशन बफर के कई वॉश के साथ हटा दें। यह महत्वपूर्ण है कि यह बफर सेल डेथ को रोकने के लिए सही ऑस्मोलैरिटी का हो। सेल कनेक्शन के लिए सेल को ब्रेकडाउन करने के लिए प्रोटीज एंजाइम का इस्तेमाल करें। ट्यूब वॉल के खिलाफ मिश्रण को पाइप करके मैकेनिकल एनर्जी के साथ होमोजेनाइजेशन प्रोसेस में मदद करें।
प्रदूषण को रोकने के लिए एंजाइम रिएक्शन और एंटीबायोटिक्स को रोकने के लिए सीरम युक्त मीडिया जोड़ें। अधिकतर मलबे को हटाने के लिए कई बार गोली और सैंपल धोएं।
अंत में, ट्यूब को बर्फ पर रखें ताकि गुरुत्वाकर्षण तलछट के लिए अनुमति दी जा सके। क्यूटिकल या सेल झुरमुट के अवशेषों सहित मलबा बाहर निकल जाएगा, जबकि मीडिया की शीर्ष परत में अलग कोशिकाओं को निलंबित किया जाएगा । इन कोशिकाओं का उपयोग अल्पकालिक खेती के लिए या विशिष्ट कोशिका आबादी को FACS या इम्यूनोप्रिपिटेशन द्वारा अलग करने के लिए किया जा सकता है ।
उदाहरण प्रोटोकॉल में, हम उन कोशिकाओं को अलग और विश्लेषण करने के लिए रुचि के न्यूरॉन्स में GFP व्यक्त ट्रांसजेनिक कीड़े को अलग करेंगे।
- जानवरों को इकट्ठा करने के बाद, उन्हें पांच मिनट के लिए 1,600 बार जी पर अपकेंद्री करें। M9 मीडिया के 1 मिलीलीटर में सभी सुपरनेट को हटा दें और कीड़े को फिर से निलंबित करें। 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट रिफ्यूज़ ट्यूब पर निलंबन स्थानांतरित करें।
कीड़े को गोली मारने के लिए पांच मिनट तक 1,600 बार जी पर सेंट्रलाइज करें। 200 माइक्रोलीटर एसडीएस-डीडीटी बफर डालें और कमरे के तापमान पर पांच मिनट तक इनक्यूबेट करें। यदि को हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जाए तो अब कीड़े को शरीर के साथ झुर्रियां दिखाई देने चाहिए।
इसके बाद, बर्फ-ठंडे आइसोलेशन बफर के 800 माइक्रोलीटर जोड़ें और धीरे-धीरे ट्यूब को फ्लिक करके मिलाएं। कीड़े को गोली मारने के लिए एक मिनट के लिए 13,000 बार जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट्ट निकालें और 1 मिलीलीटर आइसोलेशन बफर से धोएं।
इस अपकेंद्रित्र और धोने की प्रक्रिया को कुल पांच बार दोहराएं, जिससे हर बार आइसोलेशन बफर को सावधानी से हटाना सुनिश्चित किया जा सके। इसके बाद, आइसोलेशन बफर में भंग स्ट्रेप्टोमाइसेस ग्रिसेस से प्रोटीज़ मिश्रण के 100 माइक्रोलीटर को लें, गोली के लिए।
कमरे के तापमान पर 10 से 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। ट्यूब के नीचे के मुकाबले 200 माइक्रोलीटर माइक्रोपिपेट टिप के साथ 60 से 70 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके यांत्रिक व्यवधान लागू करना सुनिश्चित करें। पाचन के चरण को निर्धारित करने के लिए, पाचन मिश्रण के 1 से 5 माइक्रोलीटर निकालें, इसे एक ग्लास स्लाइड पर छोड़ दें, और ऊतक संस्कृति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इसका निरीक्षण करें।
पांच से सात मिनट के बाद, कीड़े के टुकड़ों में एक दिखने वाला कम छल्ली होना चाहिए और कोशिकाओं का घोल आसानी से दिखाई देगा। 10% एफबीएस और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लीबोविट्ज के L15 मध्यम पूरक के 900 माइक्रोलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकें।
10,000 बार जी पर और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए गोली अलग टुकड़े और कोशिकाओं को गोली के लिए। गोली कोशिकाओं को दो बार और ठंडा L15 पूरक मीडिया के साथ धोने प्रति धोने मीडिया के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर । L15 पूरक मीडिया के 1 मिलीलीटर में गोली की कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें ।
फिर, शीर्ष परत लें, जो लगभग 700 से 800 माइक्रोलीटर है, और इसे माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। अलग-थलग कोशिकाओं के 10 से 25 माइक्रोलीटर के सेल घनत्व को मापने के लिए स्वचालित सेल काउंटर या हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करें।
