Dosage de l’immunofluorescence CTC : une technique pour caractériser les cellules tumorales circulantes

JoVE Encyclopedia of Experiments

Recherche sur le cancer

0 vues • 4:05 min • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- Pour commencer, diluez les cellules tumorales circulantes isolées ou CTC à la concentration requise à l’aide d’une solution anti-liaison qui protège les cellules des dommages causés par le cisaillement des fluides et la pression. Ensuite, assemblez une lame de microscope recouverte de polylysine et une carte de filtre de cytocentrifugeuse dans un ensemble d’entonnoir de cytocentrifugeuse. Transfert de la suspension cellulaire dans l’orifice de l’entonnoir de l’ensemble, suivi d’une cytocentrifugation.

La force centrifuge concentre et dépose une monocouche de cellules sur une zone circulaire de la lame. Isolez la zone déposée avec les cellules à l’aide d’un isolateur en silicone. Une fois sèches, fixez les cellules à l’aide de paraformaldéhyde. Ensuite, incubez les cellules avec une solution bloquante appropriée contenant des protéines qui se lient facilement à tous les sites de liaison non spécifiques à la surface de la cellule.

Maintenant, marquez les cellules avec une solution d’anticorps d’intérêt marquée par fluorescence. Les anticorps marqués au fluorophore reconnaissent et se lient à des molécules cibles spécifiques à la surface de la cellule. Lavez l’échantillon pour éliminer tous les anticorps non liés. Ajoutez une solution de montage pour préparer l’échantillon à l’imagerie.

À l’aide d’un microscope à fluorescence, on détecte la lumière émise par les conjugués anticorps-fluorophore liés aux antigènes cibles sur les CTC. Dans ce protocole, nous effectuerons un test d’immunofluorescence des CTC dans des échantillons de patients atteints de cancer du poumon non à petites cellules.

- Pour la coloration par immunofluorescence, comptez les cellules dans un hémocytomètre et diluez l’échantillon enrichi à 1 fois 10 à la cinquième cellule par 100 microlitres de concentration de solution anti-liaison de 0,2 %. Ensuite, utilisez un coton-tige imbibé de 50 microlitres de solution anti-liante pour humidifier le contour de la chambre d’échantillon et placez une lame de verre de polylysine dans la chambre d’échantillon.

Fermez la chambre et pipetez de haut en bas trois fois pour enduire une pointe de micropipette avec la solution de liaison avant de remettre l’échantillon en suspension dans les 100 derniers microlitres du surnageant. Transférez la solution cellulaire dans la chambre d’échantillonnage et cytospinnez l’échantillon dans une centrifugeuse dédiée à 400 rotations par minute pendant 4 minutes à faible accélération.

À la fin de la centrifugation, placez un isolateur en silicone autour de la zone de dépôt et laissez sécher la lame sous une enceinte de sécurité microbiologique pendant deux minutes. Ensuite, fixez l’échantillon de cytospun avec 100 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 minutes à température ambiante, suivis de trois lavages de 2 minutes avec 200 microlitres de PBS par lavage à température ambiante.

Après le dernier lavage, bloquez toute liaison non spécifique par une incubation de 30 minutes dans un réactif de blocage à température ambiante suivie d’un marquage avec 100 microlitres de la solution d’anticorps d’intérêt. Placez la lame étiquetée dans une boîte de Pétri de 100 x 15 millilitres sur un morceau de papier absorbant imbibé de 2 millilitres d’eau stérile et placez la boîte fermée à 4 degrés Celsius pendant la nuit, à l’abri de la lumière.

Le lendemain matin, lavez l’échantillon trois fois avec du PBS comme indiqué et montez l’échantillon avec 10 microlitres d’une solution de montage appropriée et une lamelle en verre. Scellez ensuite la lamelle avec du vernis à ongles transparent.

11:31

Utilisation de la tomographie par Micro-calculé pour l'évaluation des tumeurs du développement et de suivi de la réponse au traitement dans un modèle murin de cancer du poumon

Vidéos connexes

0 Vues

10:49

Automated panneau Multiplex Immunofluorescence pour des études sur des échantillons de tissus fixés au formol carcinome Immuno-oncologie

Vidéos connexes

0 Vues

10:29

Caractérisation semi-automatique De MD-L1 et recensement des cellules tumorales circulantes de patients atteints d'immunofluorescence

Vidéos connexes

0 Vues

07:32

Isolement rapide des cellules tumorales circulantes viables partir d'échantillons sanguins des patients

Vidéos connexes

0 Vues

04:32

Dosage de l’immunofluorescence : une méthode pour identifier les cellules tumorales capturées sur un fil médical

Vidéos connexes

0 Vues

14:14

Adaptation des semi-automatique de circulation des cellules tumorales (CTC) Essais pour les applications cliniques et précliniques de recherche

Vidéos connexes

0 Vues

08:10

Captage et sortie de Viable cellules tumorales circulantes du sang

Vidéos connexes

0 Vues

09:32

Multiplexés Immunofluorescence analyse et Quantification d’intratumorale PD-1+ + Tim-3 CD8+ T Cells

Vidéos connexes

0 Vues

10:56

Caractérisation des cellules tumorales à l’aide d’un fil médical pour capturer des cellules tumorales circulantes : une approche 3D basée sur Immunofluorescence et ADN poisson

Vidéos connexes

0 Vues

07:47

Les lignées cellulaires tumorales circulantes : un outil innovant pour la recherche fondamentale et translationnelle

Vidéos connexes

0 Vues

Dernière mise à jour : 15 août 2026