Dosage de l’immunoprécipitation de la chromatine : une technique pour étudier les interactions protéine-ADN dans les cellules

- L’immunoprécipitation de la chromatine, ou ChIP, est une technique utilisée pour déterminer les interactions protéine-ADN dans les cellules. Les protéines se lient à des sites spécifiques de l’ADN et régulent l’expression des gènes. Tout d’abord, stabilisez le complexe ADN-protéine avec du formaldéhyde. Le formaldéhyde réticule les protéines à la séquence d’ADN associée en formant des liaisons covalentes.

Ensuite, utilisez un tampon de lyse approprié pour lyser les cellules afin de libérer de la chromatine contenant les complexes ADN-protéines réticulés. Centrifuger la suspension et soniser le surnageant pour obtenir des fragments de chromatine. Par la suite, étiquetez l’échantillon avec un anticorps approprié qui se lie spécifiquement à la protéine liée à l’ADN.

Ajoutez des billes magnétiques spécialisées à l’échantillon. La perle reconnaît l’anticorps et s’y lie. Utilisez un aimant pour collecter les billes magnétiques avec le complexe anticorps-protéine-ADN. Lavez l’échantillon pour éliminer la chromatine non liée ou les anticorps. Ajoutez un tampon à haute concentration en sel au complexe et incubez à des températures plus élevées pour inverser les liaisons croisées des protéines d’ADN.

À l’aide d’un aimant, prélevez le surnageant contenant l’ADN et les protéines. Ajoutez l’enzyme protéinase K pour dégrader les protéines de l’échantillon. Ajoutez un tampon approprié pour précipiter l’ADN et utilisez-le pour une analyse plus approfondie. Le protocole suivant démontrera l’immunoprécipitation de la chromatine dans les cellules de leucémie lymphoïde chronique afin d’identifier les gènes cibles de NFAT2.

- Tout d’abord, préparez 20 microlitres de billes enrobées de protéine A pour chaque précipitation dans un tube de 1,5 millilitre. Laissez les billes se déposer sur une grille magnétique pendant une minute et retirez le surnageant. Ensuite, lavez les billes avec 40 microlitres de 1x tampon ChIP 1 pour chaque 20 microlitres de billes enrobées de protéine A en pipetant de haut en bas.

Laissez les billes se déposer sur une grille magnétique pendant une minute et retirez le surnageant. Répétez ce processus de lavage trois fois de plus avant de remettre les billes en suspension dans leur volume d’origine de 1x tampon ChIP 1. Ajoutez de la BSA, un inhibiteur de protéase, un tampon 5x ChIP et de l’eau de qualité ChIP-seq aux billes. Ensuite, ajoutez la chromatine cisaillée.

Utilisez 10 microgrammes d’anticorps anti-NFAT2 pour capturer NFAT2 et 2,5 microgrammes d’anticorps IgG comme contrôle. Incuber les mélanges pendant la nuit à 4 degrés Celsius sur une roue tournant à six tr/min. Le lendemain, faites tourner les tubes pendant cinq secondes à 7 000 fois g et incubez-les sur la grille magnétique pendant une minute.

Ensuite, aspirez le surnageant et lavez les billes une fois avec les tampons de lavage 1, 2, 3 et 4, consécutivement. Faites tourner les tubes pendant cinq secondes à 7 000 fois g avant d’incuber les tubes sur le support magnétique pendant une minute. Après cela, retirez le surnageant et ajoutez le tampon de lavage suivant.

Après le dernier lavage, essorez les tubes pendant cinq secondes à 7 000 fois g. Incuber les tubes sur la grille magnétique pendant une minute. Retirez le surnageant et prélevez les billes dans 100 microlitres de tampon d’élution 1. Ensuite, incubez les tubes sur la roue rotative pendant 30 minutes.

Ensuite, faites tourner brièvement les tubes et placez-les sur une grille magnétique pendant une minute. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et ajoutez 4 microlitres de tampon d’élution 2. Pour créer le contrôle d’entrée, mélangez 1 microlitre de chromatine cisaillée avec 99 microlitres de tampon d’élution un et 4 microlitres de tampon d’élution deux. Ensuite, incubez les échantillons pendant quatre heures à 65 degrés Celsius en secouant.

Après cela, ajoutez 100 microlitres d’isopropanol à 100 % dans les tubes. Vortex et faites tourner les échantillons pendant cinq secondes à 7 000 fois g. Ajoutez ensuite 10 microlitres de billes magnétiques à chaque échantillon. Vortex et incuber les échantillons sur une roue rotative à température ambiante pendant une heure.

Ensuite, faites tourner brièvement les tubes et placez-les sur une grille magnétique pendant une minute. Aspirez le surnageant et remettez les billes en suspension dans 100 microlitres de tampon de lavage. Retournez les tubes pour les mélanger et incubez-les pendant cinq minutes sur une roue rotative à température ambiante. Ensuite, centrifugez brièvement les tubes. Placez-les dans un support magnétique pendant une minute et utilisez une pipette pour retirer le surnageant.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon de lavage deux. Retournez les tubes pour les mélanger et incubez-les pendant cinq minutes sur une roue rotative à température ambiante. Après cela, centrifugez brièvement les tubes et placez-les dans un support magnétique pendant une minute. Retirez le tampon de lavage deux, par aspiration, et remettez les billes en suspension dans 55 microlitres de tampon d’élution.

Pour éluer l’ADN précipité, incubez les échantillons dans une roue rotative à température ambiante pendant 15 minutes. Après cela, faites tourner brièvement les tubes et placez-les dans un support magnétique pendant une minute. Enfin, transférez le surnageant dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre.