Évaluation des foyers de dommages à l’ADN : pour identifier les foyers de dommages à l’ADN induits par les radiations dans les lignées cellulaires cancéreuses à l’aide de la coloration par immunofluorescence

- Les rayonnements ionisants induisent différents types de dommages à l’ADN, tels que les cassures simple brin ou SSB et les ruptures double brin ou DSB. Les cassures simple brin ou SSB se produisent lorsque le rayonnement endommage les bases et clive le squelette de l’ADN, tandis que les cassures double brin, DSB, se développent lorsque deux SSB se produisent sur des brins d’ADN opposés. La première étape de la formation des DSB est la phosphorylation de l’histone H2AX, qui peut être visualisée par coloration par immunofluorescence.

Pour effectuer une coloration par immunofluorescence, ajoutez des anticorps primaires à un échantillon fixé sur une lamelle placée dans une boîte de Pétri. Les anticorps se lient à la protéine d’histones phosphorylée gamma-H2AX. Incuber l’échantillon et le laver avec du PBS pour éliminer les anticorps non liés. Ensuite, ajoutez des anticorps secondaires porteurs de fluorophores, qui reconnaissent les anticorps primaires et se lient à eux. Ajoutez la quantité souhaitée de colorant fluorescent DAPI pour contre-colorer les noyaux.

Montez délicatement la lamelle sur une lame de verre à l’aide d’un support de montage et observez les cellules au microscope fluorescent. Les foyers gamma-H2AX apparaissent sous forme de points fluorescents distincts dans les cellules cancéreuses irradiées. Dans le protocole suivant, nous effectuerons une coloration par immunofluorescence de lignées cellulaires irradiées de cancer du côlon humain afin d’identifier les foyers de réparation de l’ADN induits par les radiations.

- Après l’irradiation, retirez le milieu des cellules attachées et lavez-les une fois avec 2,5 millilitres de PBS. Ensuite, fixez les cellules avec 1 millilitre d’éthanol à 70 % pendant 10 minutes. Pour perméabiliser les cellules, retirez l’éthanol et lavez-les avec 2,5 millilitres de PBS. Ajoutez doucement 1 millilitre de Triton X-100 à 0,2 % dans du PBS pour couvrir les lamelles et incubez les cellules pendant cinq minutes à température ambiante. Lavez les cellules trois fois avec du PBS et bloquez la perméabilisation avec 1 millilitre de BSA à 2 %, dilué dans du PBS. Ensuite, incubez les cellules pendant au moins 30 minutes avec le BSA à 2 %. Pour colorer les cellules, ajoutez la quantité appropriée d’anticorps primaires dilués dans du PBS avec BSA, comme recommandé dans le manuscrit du texte. Ensuite, couvrez la boîte de Pétri et placez-la dans une boîte en plastique avec de la lignine hydratée pour maintenir l’humidité. Incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Après l’incubation, effectuez trois lavages avec du PBS et ajoutez la quantité appropriée d’anticorps secondaires. Remettez le plat dans la boîte en plastique avec de la lignine hydratée et incubez-le pendant au moins 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, répétez les lavages avec du PBS et ajoutez 100 microlitres de DAPI dilués à une concentration finale de 1 microgramme par millilitre pour contre-colorer les noyaux.

Incuber les cellules pendant un maximum de 2 minutes à température ambiante et répéter les lavages avec du PBS. Après le dernier lavage, retirez le PBS et placez délicatement une lamelle sur le support de montage, en évitant la formation de bulles d’air. Scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles et laissez le support de montage durcir avant d’effectuer la microscopie à fluorescence.

• DNA Damage Foci - Indication of DNA repair sites post-damage such as those induced by radiation.
• Gamma H2AX Staining - Method used to visualize phosphorylated histone proteins post DNA damage.
• Primary Foci - The initiating DNA repair sites after DNA damage or radiation.
• H2AX Immunofluorescence - Method of visualizing phosphorylated gamma H2AX by fluorescence.
• Radiation Induced DNA Damage - DNA damage including breaks caused by exposure to ionizing radiation.

• Gamma H2AX and DNA damage - Gamma H2AX is a marker for DNA damage (e.g., radiation-induced damage).
• Use of Immunofluorescence Staining - Helps visualize gamma H2AX (e.g., to track DNA repair).
• Formation of DNA Damage Foci - They are formed following exposure to radiation (e.g., in a cell).
• Connection to Experimental Procedure - Demonstrates how the staining technique aids in visualizing DNA damage.

• What is DNA damage foci and its role in DNA repair post-radiation?
• What is the significance of gamma H2AX staining for DNA damage?
• How does the experimental procedure visualize the radiation-induced DNA damage?

• Practical Applications - DNA damage foci visualization can help study damage repair (e.g., cancer research).
• Industry Impact - Such studies are crucial in healthcare (e.g., development of radiation therapies).
• Societal Importance - Understanding of DNA repair can lead to better therapies (e.g., cancer treatments).
• Link to Scientific Advancements - Supports the development of targeted therapeutic interventions.