Application de Micro-irradiation Laser pour examen du Single et Double brin pause réparation dans les cellules de mammifères

L’objectif global de cette procédure est d’induire des dommages à l’ADN dans une région subnucléaire d’une cellule à l’aide d’un laser de microscopie fluorescente confocale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés de réparation de l’ADN, telles que la façon dont les protéines sont recrutées et conservées sur les sites de dommages à l’ADN. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de visualiser en temps réel la protéine d’intérêt, ce qui permet de construire le profil de recrutement et de rétention.

Commencez cette procédure en plaçant une lame chambrée contenant les cellules d’intérêt dans un incubateur de scène maintenu à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Enregistrez les champs d’image à l’aide d’une platine de microscope automatisé codée. Sélectionnez une caractéristique reconnaissable du récipient de culture, comme la barrière entre les puits.

Collectez une image et enregistrez l’emplacement X-Y. Cela permettra d’aligner et d’enregistrer les emplacements X-Y des champs sélectionnés après la préparation de l’échantillon. Une fois l’alignement de l’image terminé, sélectionnez un champ pour la micro-irradiation et concentrez l’échantillon.

Pour les cellules exprimant des protéines marquées par fluorescence, sélectionnez le plan focal avec la section efficace nucléaire maximale dans le canal fluorescent d’intérêt. Il est crucial de se concentrer sur la section efficace maximale du noyau, car cela permet de s’assurer que le point focal est centré sur le noyau pour surveiller le recrutement de la protéine d’intérêt sur le site des dommages induits. Sélectionnez une caractéristique claire dans le noyau, comme un nucléole, et déplacez le plan focal de haut en bas tout en observant ce changement d’apparence.

Le véritable plan focal se situera dans la transition de la lumière à l’obscurité. Pour effectuer la mise au point de l’échantillon, sélectionnez le plan focal dans lequel la fonction sélectionnée présente le contraste le plus net. L’étape suivante consiste à enregistrer la position du domaine d’intérêt.

Créez une région carrée d’intérêt de trois pixels sur trois, ou ROI, dans le logiciel du microscope. Placez ce retour sur le noyau d’une cellule à endommager et définissez ce retour sur investissement pour qu’il soit le retour sur investissement endommagé. Collectez une image pré-dommage, y compris la position du retour sur investissement des dommages.

Acquérir une image contenant un champ clair dans le canal de fluorescence pour la protéine d’intérêt. Les cellules sont maintenant prêtes pour la micro-irradiation laser. Pour cette démonstration, le laser de 405 nanomètres sera utilisé à 100 % de puissance.

La dose laser de 405 nanomètres est contrôlée en modulant la vitesse de balayage et en effectuant un balayage du retour sur investissement des dommages sélectionné. Dans cette expérience, utilisez huit et 0,5 images par seconde pour la micro-irradiation à 405 nanomètres. La sélection de la puissance laser appropriée pour endommager les cellules est essentielle pour séparer les différentes voies de réparation de l’ADN.

Effectuez l’acquisition d’images en accéléré des canaux de fond clair et de fluorescence après des dommages. Ajustez la durée et la fréquence du time-lapse pour optimiser la collecte de données, en capturant idéalement l’accumulation de la protéine fluorescente au moment des dommages, le ROI et sa dissociation au cours de l’expérience. Une fois le parcours temporel terminé, sélectionnez un nouveau champ de cellules pour les dommages et continuez la micro-irradiation et l’imagerie en accéléré jusqu’à ce que le nombre souhaité de cellules endommagées soit atteint.

Il est recommandé d’utiliser 10 à 25 cellules par condition sélectionnée. Pour augmenter le nombre total de cellules pour l’analyse par immunofluorescence, endommagez des champs supplémentaires dans le récipient de culture afin de générer une évolution temporelle multi-champs de la réponse post-dommage. Notez l’emplacement X-Y de chaque champ et l’heure à laquelle les dommages se sont produits.

Les cellules peuvent être réparées immédiatement après les dommages ou laissées à réparer pendant des périodes de temps sélectionnées avant la fixation. Pour commencer cette analyse, ouvrez les images acquises dans une application d’analyse d’images telle que NIS-Elements. Pour chaque cellule à mesurer, générez d’abord un ROI de référence qui représente le noyau.

Utilisez un algorithme de seuillage sur le signal de fluorescence qui contient les pixels constituant le noyau, puis convertissez cette zone en ROI. Ensuite, créez un retour d’intérêt de six pixels sur six et placez-le sur le retour sur investissement des dégâts. Ce retour sur investissement plus important est désormais le retour sur investissement des dommages pour l’analyse.

Pour chaque cellule à mesurer, notez l’intensité moyenne de fluorescence pour les ROI de référence et les dommages ROI. Pour chaque image de la trajectoire temporelle, ajustez le retour d’intérêt de référence pour vous assurer que la zone nucléaire est couverte avec précision par le retour d’intérêt et ajustez le retour d’intérêt des dommages pour vous assurer que l’endroit endommagé est couvert. Enregistrez l’intensité moyenne de fluorescence du signal fluorescent dans chaque retour d’intérêt pour chaque image du parcours temporel.

Pour chaque cellule, normalisez l’intensité moyenne de la fluorescence du retour sur investissement des dommages à celle de son retour sur investissement de référence correspondant dans chaque image du time-lapse. Ici, l’intensité moyenne de la fluorescence nucléaire est utilisée comme retour sur investissement de référence et la normalisation est effectuée en soustrayant l’intensité moyenne de fluorescence du retour sur investissement de référence de l’intensité moyenne de fluorescence du retour sur investissement des dommages. Répétez la normalisation pour toutes les cellules endommagées ainsi que pour au moins deux cellules de contrôle non endommagées.

Enfin, représenter graphiquement les valeurs d’intensité normalisées au fil du temps pour montrer les changements dans la dynamique du recrutement en fonction du traitement expérimental. Les cellules exprimant de manière stable XRCC1-GFP ont été irradiées et imagées avant et après l’induction des dommages. Le ROI du recrutement de XRCC1-GFP a été observé et la dynamique du recrutement a été mesurée.

La formation de cassures double brin a été examinée à l’aide de deux marqueurs. Pour les deux marqueurs, la stimulation à faible dose de deux secondes à 355 nanomètres n’induit aucune réponse à cinq minutes et 20 minutes et une réponse faible et variable à 10 minutes après l’irradiation. La micro-irradiation à haute dose de 10 secondes à 355 nanomètres induit une augmentation du signal fluorescent dans le ROI des dommages à cinq, 10 et 20 minutes après l’irradiation, qui est réduite à 40 minutes.

Ces résultats indiquent que les marqueurs de cassures double brin de l’ADN répondent à une micro-irradiation de 355 nanomètres de manière dose-dépendante. En revanche, la stimulation laser de 405 nanomètres a entraîné une accumulation significative des deux marqueurs dans le retour sur investissement des dommages, quelle que soit la dose appliquée. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ quatre heures pour 10 cellules si elle est exécutée correctement.

Lors de l’exécution de cette technique, il est important d’adapter la longueur d’onde du laser et la puissance appliquée au processus de réparation surveillé. À la suite de cette procédure, l’immunofluorescence peut être réalisée pour répondre à des questions sur le recrutement de protéines supplémentaires ou les changements dans l’état de phosphorylation ou d’autres modifications post-traductionnelles. Cette technique permet aux chercheurs d’explorer le recrutement dynamique des protéines de réparation de l’ADN et de mieux déterminer comment les domaines et les mutations protéiques affectent la reconnaissance et la réponse aux dommages à l’ADN.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser un microscope confocal à balayage laser pour induire des dommages à l’ADN et surveiller le recrutement des protéines de réparation de l’ADN. N’oubliez pas que travailler avec des lasers et des produits chimiques tels que le formaldéhyde peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que des équipements de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.