Name: Application de Micro-irradiation Laser pour examen du Single et Double brin pause réparation dans les cellules de mammifères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Découvrez la micro-irradiation laser pour étudier la réparation de l'ADN dans les cellules de mammifères. Cette technique permet de visualiser en temps réel le recrutement des protéines XRCC1-GFP aux sites de dommages.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Samuel H. Wilson à la National Institute of Environmental Health Sciences pour les lignées de cellules utilisées dans ce travail.

<ol><li>Luijsterburg, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+and+reversible+assembly+of+a+multiprotein+DNA+repair+complex+ensures+accurate+target+site+recognition+and+efficient+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic and reversible assembly of a multiprotein DNA repair complex ensures accurate target site recognition and efficient repair.</a> J Cell Biol. 189 (3), 445-463 (2010).</li>
<li>Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+mammalian+NER+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Dynamics of mammalian NER proteins.</a> DNA Repair (Amst). 10 (7), 760-771 (2011).</li>
<li>Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+history+of+laser+scissors+%28microbeams%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A history of laser scissors (microbeams).</a> Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).</li>
<li>Cremer, C., Cremer, T., Zorn, C., Schoeller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+laser+uv-microirradiation+%28lambda+%3D+2573+A%29+on+proliferation+of+Chinese+hamster+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of laser uv-microirradiation (lambda = 2573 A) on proliferation of Chinese hamster cells.</a> Radiat Res. 66 (1), 106-121 (1976).</li>
<li>Cremer, C., Cremer, T., Fukuda, M., Nakanishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+laser--UV+microirradiation-induced+DNA+photolesions+by+immunofluorescent+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Detection of laser--UV microirradiation-induced DNA photolesions by immunofluorescent staining.</a> Hum Genet. 54 (1), 107-110 (1980).</li>
<li>Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+system+for+laser-UVA-microirradiation+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells.</a> J Microsc. 209, (Pt 2) 71-75 (2003).</li>
<li>Kielbassa, C., Roza, L., Epe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength+dependence+of+oxidative+DNA+damage+induced+by+UV+and+visible+light%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Wavelength dependence of oxidative DNA damage induced by UV and visible light.</a> Carcinogenesis. 18 (4), 811-816 (1997).</li>
<li>Kielbassa, C., Epe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+induced+by+ultraviolet+and+visible+light+and+its+wavelength+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">DNA damage induced by ultraviolet and visible light and its wavelength dependence.</a> Methods Enzymol. 319, 436-445 (2000).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+laser+systems+to+study+cellular+responses+to+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 37 (9), 68(2009).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+repair+processes+for+oxidative+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (38), 13738-13743 (2004).</li>
<li>Krasin, F., Hutchinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand+breaks+and+alkali-labile+bonds+induced+by+ultraviolet+light+in+DNA+with+5-bromouracil+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Strand breaks and alkali-labile bonds induced by ultraviolet light in DNA with 5-bromouracil in vivo.</a> Biophys J. 24 (3), 657-664 (1978).</li>
<li>Krasin, F., Hutchinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+breaks+from+single+photochemical+events+in+DNA+containing+5-bromouracil%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Double-strand breaks from single photochemical events in DNA containing 5-bromouracil.</a> Biophys J. 24 (3), 645-656 (1978).</li>
<li>Rosenstein, B. S., Setlow, R. B., Ahmed, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+dye+Hoechst+33258+in+a+modification+of+the+bromodeoxyuridine+photolysis+technique+for+the+analysis+of+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Use of the dye Hoechst 33258 in a modification of the bromodeoxyuridine photolysis technique for the analysis of DNA repair.</a> Photochem Photobiol. 31 (3), 215-222 (1980).</li>
<li>Cremer, T., Peterson, S. P., Cremer, C., Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microirradiation+of+Chinese+hamster+cells+at+wavelength+365+nm%3A+effects+of+psoralen+and+caffeine%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Laser microirradiation of Chinese hamster cells at wavelength 365 nm: effects of psoralen and caffeine.</a> Radiat Res. 85 (3), 529-543 (1981).</li>
<li>Limoli, C. L., Ward, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+introducing+double-strand+breaks+into+cellular+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">A new method for introducing double-strand breaks into cellular DNA.</a> Radiat Res. 134 (2), 160-169 (1993).</li>
<li>Carlsson, K., Mossberg, K., Helm, P. J., Philip, J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0739626092900178">Use of UV excitation in confocal laser scanning fluorescence microscopy.</a> Micron and Microscopica Acta. 23 (4), 413-428 (1992).</li>
<li>Stelzer, E. H. K., Haar, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1076567008702738">Confocal Microscopy: Recent Developments.</a> Advances in Imaging and Electron Physics. 106, 293-345 (1999).</li>
<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li>
<li>Tashiro, S., Walter, J., Shinohara, A., Kamada, N., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad51+accumulation+at+sites+of+DNA+damage+and+in+postreplicative+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rad51 accumulation at sites of DNA damage and in postreplicative chromatin.</a> J Cell Biol. 150 (2), 283-291 (2000).</li>
<li>Gassman, N. R., Stefanick, D. F., Kedar, P. S., Horton, J. K., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactivation+of+PARP+triggers+nonhomologous+end-joining+in+repair-deficient+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hyperactivation of PARP triggers nonhomologous end-joining in repair-deficient mouse fibroblasts.</a> PLoS One. 7 (11), 49301(2012).</li>
<li>Bolin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+cyclin-dependent+kinase+5+depletion+on+poly%28ADP-ribose%29+polymerase+activity+and+responses+to+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The impact of cyclin-dependent kinase 5 depletion on poly(ADP-ribose) polymerase activity and responses to radiation.</a> Cell Mol Life Sci. 69 (6), 951-962 (2012).</li>
<li>Godon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP+inhibition+versus+PARP-1+silencing%3A+different+outcomes+in+terms+of+single-strand+break+repair+and+radiation+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PARP inhibition versus PARP-1 silencing: different outcomes in terms of single-strand break repair and radiation susceptibility.</a> Nucleic Acids Res. 36 (13), 4454-4464 (2008).</li>
<li>Hanssen-Bauer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC1+coordinates+disparate+responses+and+multiprotein+repair+complexes+depending+on+the+nature+and+context+of+the+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">XRCC1 coordinates disparate responses and multiprotein repair complexes depending on the nature and context of the DNA damage.</a> Environ Mol Mutagen. 52 (8), 623-635 (2011).</li>
<li>Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback-regulated+poly%28ADP-ribosyl%29ation+by+PARP-1+is+required+for+rapid+response+to+DNA+damage+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 35 (22), 7665-7675 (2007).</li>
<li>Mortusewicz, O., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+dynamics+of+regulatory+protein+recruitment+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal dynamics of regulatory protein recruitment at DNA damage sites.</a> J Cell Biochem. 104 (5), 1562-1569 (2008).</li>
<li>Mortusewicz, O., Rothbauer, U., Cardoso, M. C., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recruitment+of+DNA+Ligase+I+and+III+to+DNA+repair+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Differential recruitment of DNA Ligase I and III to DNA repair sites.</a> Nucleic Acids Res. 34 (12), 3523-3532 (2006).</li>
<li>Solarczyk, K. J., Zarębski, M., Dobrucki, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+local+DNA+damage+by+visible+light+to+study+chromatin+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Inducing local DNA damage by visible light to study chromatin repair.</a> DNA Repair (Amst). 11 (12), 996-1002 (2012).</li>
<li>Gassman, N. R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-irradiation+tools+to+visualize+base+excision+repair+and+single-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair.</a> DNA Repair (Amst). 31, 52-63 (2015).</li>
<li>Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+near+infrared+femtosecond+lasers+as+sub-micron+radiation+microbeam+for+cell+DNA+damage+and+repair+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Use of near infrared femtosecond lasers as sub-micron radiation microbeam for cell DNA damage and repair studies.</a> Mutat Res. 704 (1-3), 38-44 (2010).</li>
<li>Ferrando-May, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highlighting+the+DNA+damage+response+with+ultrashort+laser+pulses+in+the+near+infrared+and+kinetic+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling.</a> Front Genet. 4, 135(2013).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+Werner+protein+at+DNA+double-strand+breaks+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Accumulation of Werner protein at DNA double-strand breaks in human cells.</a> J Cell Sci. 118, Pt 18 4153-4162 (2005).</li>
<li>Salmon, T. B., Evert, B. A., Song, B., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+consequences+of+oxidative+stress-induced+DNA+damage+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Biological consequences of oxidative stress-induced DNA damage in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 32 (12), 3712-3723 (2004).</li>
<li>Caldecott, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+single-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">DNA single-strand break repair.</a> Exp Cell Res. 329 (1), 2-8 (2014).</li>
<li>London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+XRCC1-mediated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">The structural basis of XRCC1-mediated DNA repair.</a> DNA Repair (Amst). 30, 90-103 (2015).</li>
<li>Moser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sealing+of+chromosomal+DNA+nicks+during+nucleotide+excision+repair+requires+XRCC1+and+DNA+ligase+III+alpha+in+a+cell-cycle-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Sealing of chromosomal DNA nicks during nucleotide excision repair requires XRCC1 and DNA ligase III alpha in a cell-cycle-specific manner.</a> Mol Cell. 27 (2), 311-323 (2007).</li>
<li>Campalans, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+spatiotemporal+patterns+and+PARP+dependence+of+XRCC1+recruitment+to+single-strand+break+and+base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct spatiotemporal patterns and PARP dependence of XRCC1 recruitment to single-strand break and base excision repair.</a> Nucleic Acids Res. 41 (5), 3115-3129 (2013).</li>
<li>Cooke, M. S., Lunec, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCooke%2C+MS+%22Immunochemical+detection+of+oxidative+DNA+damage.+Vol.+I%22">Immunochemical detection of oxidative DNA damage. Vol. I</a>. , World Scientific. 275-293 (2003).</li>
<li>Rossner, P., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+detection+of+oxidatively+damaged+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Immunochemical detection of oxidatively damaged DNA.</a> Free Radic Res. 46 (4), 492-522 (2012).</li>
<li>Cleaver, J. E., Feeney, L., Revet, I. Phosphorylated H2Ax is not an unambiguous marker for DNA double-strand breaks. Cell Cycle. 10 (19), 3223-3224 (2011).</li>
<li>Rybak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+level+phosphorylation+of+histone+H2AX+on+serine+139+%28%CE%B3H2AX%29+is+not+associated+with+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Low level phosphorylation of histone H2AX on serine 139 (γH2AX) is not associated with DNA double-strand breaks.</a> Oncotarget. 7 (31), 49574-49587 (2016).</li>
<li>Haince, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1-dependent+kinetics+of+recruitment+of+MRE11+and+NBS1+proteins+to+multiple+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">PARP1-dependent kinetics of recruitment of MRE11 and NBS1 proteins to multiple DNA damage sites.</a> J Biol Chem. 283 (2), 1197-1208 (2008).</li>
<li>Caldecott, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-strand+break+repair+and+genetic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-strand break repair and genetic disease.</a> Nat Rev Genet. 9 (8), 619-631 (2008).</li>
<li>Lomax, M. E., Gulston, M. K., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+aspects+of+clustered+DNA+damage+induction+by+ionising+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Prot+Dosimetry%22%5BJournal%5D)">Chemical aspects of clustered DNA damage induction by ionising radiation.</a> Radiat Prot Dosimetry. 99 (1-4), 63-68 (2002).</li>
<li>Ma, W., Westmoreland, J. W., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkylation+base+damage+is+converted+into+repairable+double-strand+breaks+and+complex+intermediates+in+G2+cells+lacking+AP+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Alkylation base damage is converted into repairable double-strand breaks and complex intermediates in G2 cells lacking AP endonuclease.</a> PLoS Genet. 7 (4), 1002059(2011).</li>
<li>Siddiqi, M. A., Bothe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-+and+double-strand+break+formation+in+DNA+irradiated+in+aqueous+solution%3A+dependence+on+dose+and+OH+radical+scavenger+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Single- and double-strand break formation in DNA irradiated in aqueous solution: dependence on dose and OH radical scavenger concentration.</a> Radiat Res. 112 (3), 449-463 (1987).</li>
<li>Sano, Y., Watanabe, W., Matsunaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore-assisted+laser+inactivation--towards+a+spatiotemporal-functional+analysis+of+proteins%2C+and+the+ablation+of+chromatin%2C+organelle+and+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Chromophore-assisted laser inactivation--towards a spatiotemporal-functional analysis of proteins, and the ablation of chromatin, organelle and cell function.</a> J Cell Sci. 127, (Pt 8) 1621-1629 (2014).</li>
<li>Wojtovich, A. P., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+ROS+production%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of ROS production.</a> Redox Biol. 2, 368-376 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Utilisant les conditions décrites ici, un microscope confocal avec une UV ou laser à 405 nm, soit intégrés par le fabricant ou ajoutés par l’utilisateur final, peut induire des lésions de l’ADN dans le noyau d’une cellule et permettre le recrutement de protéines de réparation d’ADN sur le site de a induit des lésions de l’ADN à surveiller. Toutefois, comme il est indiqué dans le protocole et les résultats représentatifs, sélection de longueur d’onde, appliqué de puissance, et caractérisation de dommages sont toutes importantes questions auxquelles il faudra répondre tout d’abord par l’utilisateur afin d’étudier un ADN spécifique réparer la voie. En outre, il y a autres considérations dans une conception expérimentale qui doit également être considérée par les utilisateurs.
Afin de surveiller le comportement de la protéine dans des cellules vivantes post micro-irradiation, une protéine fluorescent étiquetée doit être créée. La disponibilité d’une large gamme de protéines fluorescentes qui peuvent être séparés spectralement propose des outils pour créer des fusions de protéine qui peuvent être utilisées pour caractériser les réponses cellulaires à l’induction de dommages à l’ADN. Permet de transfection transitoire de protéines fluorescentes d’intérêt pour le dépistage rapide des problèmes potentiels, les mutations ou inhibiteurs de la même, tandis que les cellules transfectées stablement offrent plus de contrôle sur les niveaux d’expression et permettent d’autres biochimiques caractérisations à accomplir, valider les résultats de micro-irradiation. Des protéines fluorescentes spectralement distinctes peuvent également être utilisés dans la même cellule pour surveiller les interactions entre les protéines dans la même voie ou dans des voies différentes. Protéines fluorescentes également éliminent la nécessité d’anticorps spécifiques pour chaque protéine d’intérêt et permettre aux cellules vivantes suivi du comportement de protéine pendant de longues périodes de temps après l’induction de dommages.
Cependant, l’utilisation de protéines fluorescentes a aussi des inconvénients. Sans antécédents génétiques déficients dans les protéines d’intérêt, seront en compétition avec les protéines fluorescent étiquetés protéines endogènes. Conjugaison du marqueur fluorescent à l’extrémité N ou C de la protéine peut altérer le repliement des protéines, entravent les interactions protéine-protéine clé ou bloquent les signaux de la translocation ; modifier fonction et potentiellement un impact dynamique de recrutement. Ces effets ont été démontrés dans un certain nombre de rapports où immunofluorescence démontré recrutement radicalement différent et des temps de rétention des protéines endogènes à la site de dommages28. Utilisation de transfection transitoire ou clones stables peut également altérer la réponse observée, généralement par le biais de variations dans les niveaux d’expression de protéine. En outre, l’utilisation de protéines fluorescentes multiples en une seule expérience peut également changer la dynamique du recrutement, si le taux de protéines ne sont pas équilibrés bien ou si le recrutement de la plus grande protéine fluorescent-étiquetées bloque le recrutement d’autres protéines . Enfin, les protéines fluorescentes peuvent agir comme agents de sensibilisation faible, augmentant la formation d’espèces réactives de l’oxygène et susceptibles de modifier l’ADN des dommages mélanges induite46,47. Malgré ces inconvénients, les protéines fluorescentes offrent un certain nombre d’avantages distincts dans l’étude ADN réparez avec micro-irradiation, et si les utilisateurs intègrent des contrôles appropriés, tels que la caractérisation de dommages décrits ici, ils peuvent fournir un nouvel aperçu en dommages réponse et protéines interactions3.
Si l’imagerie de cellules vivantes n’est pas nécessaire, immunofluorescence peut être utilisé pour surveiller la réponse aux dommages induits. Par la fixation des cellules à des moments précis après induction de dommages et de coloration avec des anticorps spécifiques pour les protéines et les lésions d’intérêt, des clichés statiques d’induction de dommages et le recrutement et la rétention de réparation protéines peuvent être construits. Anticorps peuvent être utilisés pour surveiller le recrutement de plusieurs protéines d’intérêt et/ou de modifications post-traductionnelles induites par la réponse aux dommages de l’ADN. Utilisation de l’immunofluorescence élimine le besoin de protéines fluorescentes et permet pour le comportement de la protéine endogène à examiner. Toutefois, cette méthode a aussi ses inconvénients. Anticorps hautement spécifiques sont nécessaires, et perméabilisation et les procédures de blocage doivent être optimisés pour permettre une détection de recrutement avec une intensité de signal suffisant. Procédures de fixation ne sont pas instantanées, et cette contrainte physique limite la résolution temporelle de cette approche. Cartographie du site de l’induction de dommages donc des cellules peuvent être re-localisés après coloration peut également présenter des défis importants. Le microscope confocal utilisé dans ce travail permet d’enregistrement basé sur l’image comme décrit ci-dessus, alors les cellules endommagées peuvent être déplacés avec une grande précision. Si l’étape d’inscription ou de la lamelle gravé n’est pas disponible, le temps d’investissement impliquée dans les cellules puisqu’il déplace sans inscription étape, couplé avec le délai inhérent entre l’induction des dommages et le recrutement imagé, peuvent rendre immunofluorescence attrayant pour certains utilisateurs. Cependant, le plus précis et complet micro-irradiation expérimentaux intégrera ces types d’approches en parallèle avec l’utilisation de protéines fluorescentes, comme décrit dans le protocole présenté.
Ici, l’imagerie de cellules vivantes et immunofluorescence est utilisé pour démontrer l’utilité de micro-irradiation laser. Immunofluorescence permet d’examiner avec précision le mélange de dommages à l’ADN créé et le recrutement des protéines induites par chaque puissance de laser, qui nous permettent de mieux interpréter les altérations observées dans le recrutement et la rétention de XRCC1-GFP. Selon ces résultats, l’utilisation du 405 nm laser devrait être limitée à l’examen des protéines BER et SSBR. En outre, le protocole expérimental optimal comprendrait des mesures de puissance après l’objectif, une caractérisation du mélange plein de dégâts pour chaque lignée cellulaire utilisée et la validation du recrutement et rétention chez fluorescent étiqueté protéines avec immunofluorescence. De toute évidence, matériel, du temps et des considérations de coût pourraient rendre ces modèles expérimentaux optimales impossible pour certains utilisateurs. Toutefois, l’importance de chacun de ces éléments est démontré ici, et utilisateurs devraient garder ces considérations à l’esprit au début des expériences d’irradiation micro.

Microscopie de fluorescence est devenue une technique puissante pour visualiser l’architecture cellulaire, examiner la localisation des protéines et surveiller les interactions protéine-protéine et protéine-ADN. Par microscopie fluorescente pour étudier les réponses de dommages de l’ADN après l’application de l’ADN global endommageant des agents, tels que les ultraviolets (UV), des rayonnements ionisants, oxydants chimiques ou agents alkylants et/ou agents chimiothérapeutiques a donné un aperçu nouveau l’initiation, de signalisation et le recrutement de l’ADN réparation des protéines vers des sites de l’ADN des dommages1,2. Toutefois, ces mondiaux et endommageant les événements asynchrones sont limitatifs, si des informations détaillées sur l’ordre de recrutement, de la cinétique de l’association ou la dissociation, et les relations entre les principales protéines de réparation d’ADN sont recherchées. Heureusement, les progrès dans les microscopes confocaux à balayage laser, plus large disponibilité d’induisant des dommages longueurs d’onde du laser et des améliorations en protéines fluorescentes au cours des 25 dernières années ont fourni chercheurs avec des outils améliorés pour l’examen de ces aspects de l’ADN réparation, grâce à l’induction de dommages à l’ADN ciblée.
L’irradiation des cellules avec laser micromadriers afin d’étudier les fonctions cellulaires et subcellulaires est un outil bien établi dans la cellule et rayonnement biologie3. Application de cette technique à l’étude de la réparation de l’ADN a émergé lorsque Cremer et collègues de travail utilisé un UV très axée (257 nm) système microfaisceaux laser pour induire des lésions de l’ADN sur un spot dans l’ovaire de hamster chinois (CHO) de 0,5 µm cellules4 et établi l’induction de ADN photolesions par ce système5. Tout en offrant des améliorations significatives par rapport aux méthodes microfaisceaux UV dans le temps, l’adoption de la présente endommageant le système a été limitée en raison de son spécialisés mis en place et son incapacité à générer des doubles brins (CDB)6. L’enquête subséquente d’une variété d’UVB (290-320 nm) et UV-une longueur d’onde (320-400 nm) par un certain nombre de groupes ont révélé que les photoproduits UV, oxydation fondent des lésions, simples brins (BSN) et CDB peut être induite dépend de la longueur d’onde du laser et sous tension4,7,8,9,10 (évaluée à 3). En outre, des combinaisons de ces UV-B et UV-A longueurs d’onde avec sensibilisation des agents, comme le psoralène, bromodéoxyuridine (BrdU) et des colorants de Hoechst, ont également été trouvés à induire des lésions de l’ADN dépend de la longueur d’onde et de puissance, durée de l’exposition, si la puissance nécessaire pour induire des dégâts est souvent abaissé en présence de ces agents11,12,13,14,15. Ces progrès étendu l’utilisation du micro-irradiation, s’il y avait des obstacles encore techniques à résoudre pour la généralisation de ces méthodes.
Cremer et ses collaborateurs ont grandement avancer le domaine de la micro-irradiation en ciblant précisément le microfaisceaux UV pour appliquer l’énergie néfaste importantes sur une zone très localisée dans la cellule. Microscopes confocaux et systèmes de microdissection laser avancée, lumière ciblé a été plus largement accessible ; Toutefois, les sources UV de couplage aux étendues et traitant les aberrations chromatiques, qu'ils induisent toujours présenté des défis importants pour la plupart utilisateurs3,6,16. Comme les colorants traceurs gagné en popularité dans les années 1990, optique capable de se concentrer et capture fluorescence UV et excités devenue plus largement disponible16et améliorations à balayage laser offert aux utilisateurs la possibilité de créer très concentré UV taches d’excitation au sein de cellules6,17. Cependant, ce n’est que le début des années 2000 que l’impact réel de cette combinaison de poutres ciblés avec des lasers d’intensité plus élevées a été estimé, lorsque de nombreux rapports ont émergé démontrant que les ruptures de brins d’ADN peuvent être induites avec et sans sensibilisants dans le UV-A rang6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24, 25,26et même à plus la longueurs d’onde visibles comme 488 nm27. Ces progrès autorisés pour l’adoption plus généralisée de la technique de micro-irradiation sur un certain nombre de systèmes commerciaux. Parallèlement à ces développements, techniques de deux photons également émergé qui a permis à induction précise des lésions de l’ADN ; même si ces progrès ne seront pas abordés ici, il y a un certain nombre d’articles de revue traitant ces méthodologies9,28,29,30.
Avec l’accessibilité actuelle des microscopes confocaux capables d’apporter fortement focalisé de lumière UV et de la disponibilité répandue de protéines fluorescentes pour permettre un suivi en temps réel des protéines de réparation de l’ADN, sont devenus des techniques micro-irradiation outils puissants pour l’examen ADN dommages réponse et la réparation des voies. Toutefois, les utilisateurs doivent être conscients que la génération de dommages à l’ADN est fortement tributaire de la longueur d’onde du laser et la force appliquée à la région sub nucléaire. Utilisation d’UV-C (~ 260 nm) longueurs d’onde permettent l’excitation directe de l’ADN et une sélectivité élevée pour l’induction de l’UV photoproduits7,8. UV-B et les longueurs d’onde UV-A produisent des mélanges de dommages à l’ADN (lésion base, SSBs et CDB), dépendant de la puissance appliquée et l’arrière-plan cellulaire utilisé7. Photosensibilisateurs endogènes et anti-oxydant chez les cellules ciblées peuvent influer sur les mélanges de dommages d’ADN produites par ces longueurs d’onde. En outre, l’utilisation de photosensibilisateurs exogènes (BrdU, etc.) peut-être aider à réduire l’énergie nécessaire pour l’induction de dommages à l’ADN. Toutefois, ces agents peuvent induire des lésions de l’ADN par eux-mêmes, et ils peuvent modifier le cycle cellulaire et structure de la chromatine, donc leur utilisation peut entraîner des effets indésirables qui doivent être prises en considération par l’utilisateur. Avant d’utiliser le micro-irradiation pour étudier la réparation et réponse aux dommages de l’ADN, un examen attentif de la voie de réparation d’ADN d’intérêt, les longueurs d’ondes disponibles pour l’utilisation et le mélange de dommages d’ADN créé est donc requis.
Ici, les micro-irradiation laser est effectué à deux longueurs d’onde couramment utilisés, 355 nm et 405 nm, sans sensibilisants pour démontrer les mélanges des lésions de l’ADN induite par ces longueurs d’onde et les influences de ces mélanges de dommages ont sur l’examen de la réparation deSSBs et CDB. les utilisateurs doivent être conscients que ces longueurs d’onde ne créent pas une seule espèce de brins ou de lésions de base. Afin de distinguer les voies de réparation de l’ADN, les utilisateurs doivent soigneusement contrôle la puissance appliquée sur une région spécifique du noyau et caractériser les dommages provoqués à l’aide de plusieurs marqueurs de rupture de brin et les anticorps de lésion de l’ADN. Si correctement appliqué et caractérisés, micro-irradiation laser peut enrichir certaines espèces de dommages à l’ADN, permettant aux utilisateurs d’évaluer la réparation des lésions de base et BSN ou BDB, avec une certaine spécificité. Par conséquent, nous avons fourni une méthode permettant aux utilisateurs d’effectuer des micro-irradiation laser reproductible, caractériser les mélanges de dommages d’ADN induites par la dose appliquée laser et effectuer des analyses de données.

<table><tbody><tr><td>Nikon A1rsi microscope confocal à balayage laser</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements logiciel</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>355 nm laser</td><td>PicoQuant VisUV</td><td></td><td>Source de rayonnement</td></tr><tr><td>Galvanomètre photoactivation miniscanner</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope lame photodiode capteur de puissance</td><td>THORLabs</td><td>S170C</td><td></td></tr><tr><td>Capteur de puissance à photodiode à fibre</td><td>THORLabs</td><td>S150C</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de puissance et d’énergie optique numérique</td><td>portable THORLabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td></td><td></td><td>De Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS</td></tr><tr><td>Minimal essential media</td><td>Hyclone</td><td>SH3026501</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovin</td><td>serum Atlanta biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>XRCC1-GFP</td><td>Origene</td><td>RG204952</td><td></td></tr><tr><td>Jetprime</td><td>Polyplus transfection</td><td>11407</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>ThermoFisher</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>4 chambres</td><td>ThermoFisher</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>8 chambres</td><td>ThermoFisher</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Anti 53BP-1</td><td>Novus</td><td>NB100304</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-histone H2AX&nbsp ;</td><td>Millipore</td><td>05-636-I</td><td></td></tr><tr><td>Anti cyclobutane pyrimidine</td><td>dimère Cosmo Bio clone</td><td>CAC-NM-DND-001</td><td></td></tr><tr><td>Anti 8-oxo-2&acute ;-désoxyguanosine&nbsp ;</td><td>Trevigen</td><td>4354-MC-050</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 chèvre anti-souris</td><td>ThermoFisher</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 546 chèvre anti-lapin</td><td>ThermoFisher</td><td>A11010</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phénylindole (DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>R37606</td><td>Attention toxique !</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>ThermoFisher</td><td>0780</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>ThermoFisher</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>37 % Formaldéhyde</td><td>ThermoFisher</td><td>9311</td><td>Attention toxique !</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135</td><td>Attention toxique !</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>SA49</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Attention toxique !</td></tr><tr><td>Chlorhydrate Tris</td><td>Amresco</td><td>O234</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

application de micro-irradiation laser pour examen du single et double brin pause réparation dans les cellules de mammifères

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Voies de réparation de l’ADN hautement coordonnées existent pour détecter, excise et remplacer les bases de l’ADN endommagés et coordonnée de la réparation des ruptures de brins d’ADN. Alors que les techniques de biologie moléculaire ont clarifié la structure, les fonctions enzymatiques et cinétique des protéines de réparation, il y a toujours un besoin de comprendre comment la réparation est coordonnée au sein du noyau. Micro-irradiation laser offre un outil puissant pour induire des dommages à l’ADN et surveiller le recrutement des protéines de réparation. Induction de dommages à l’ADN par laser micro-irradiation peut se produire avec une gamme de longueurs d’onde, et utilisateurs fiable peuvent induire des cassures monocaténaires, lésions base et double brins avec un éventail de doses. Ici, les micro-irradiation laser est utilisé pour examiner réparation des simples et doubles brins induites par deux communes confocal laser longueur d’onde, 355 nm et 405 nm. En outre, bonne caractérisation de la dose appliquée laser pour induire des mélanges dommage spécifique est décrite, donc de façon reproductible les utilisateurs peuvent effectuer analyse et acquisition de données micro-irradiation laser.

Caractérisation des lésions de l’ADN induite par Induction des lésions base et brins dépend de la dose de laser appliquée à la zone sélectionnée du nucléaire et le microenvironnement cellulaire du modèle cellulaire utilisé7. Des protéines fluorescentes fusionnés pour réparer des protéines, comme XRCC1, 53BP1, Ku70 ou Rad51, fournir utile simple et doubles chapelet pause marqueurs permettant d’établir l’énergie minimale nécessaire pour voir l’accumulation d’une protéine fluorescente dans un dommage ROI qui précède la arrière-plan fluorescence9,19,31. Une fois que les conditions qui provoquent une réponse sont trouvent, il est essentiel pour caractériser le mélange de dommages induit par cette longueur d’onde spécifique et de la dose. Atténuation de la dose et la durée à la longueur d’onde utilisée peut permettre à l’utilisateur afin de minimiser la formation de mélanges complexes de dommages. Laser de faible des doses UV-A ont été démontrés pour produire principalement SSBs et une petite quantité de base lésions, appropriées pour l’étude de SSBR et BER voies10,28. Augmenter la dose crée des lésions plus complexes base, oxydants et UV induite et induit un nombre plus important de CDB7,10. Alors que l’induction d’une seule espèce de dommages à l’ADN est utiles pour l’examen des voies de réparation de l’ADN spécifiques, il est plus probable que les utilisateurs sont induisant un mélange de lésions de l’ADN, avec une lésion spécifique comme BSN étant beaucoup plus fréquentes que les lésions de base ou de la CDB. Ceci est similaire aux mélanges de dommages d’ADN induites par des agents chimiques comme le peroxyde d’hydrogène (H2O2) ou méthyl méthanesulfonate (MMS)32. Les utilisateurs doivent être conscients lorsqu’ils signalent des résultats qui endommagent les mélanges peuvent survenir, et caractérisation minutieuse de la dose et les lésions sur le site de dommages induits sont nécessaires pour garantir la reproductibilité et la comparabilité des résultats.
Dans les études micro-irradiation, XRCC1-GFP est souvent utilisé comme marqueur pour l’induction des lésions base et BSN9,28. XRCC1 est une protéine d’échafaudage qui joue un rôle important dans la réparation de la SSB (SSBR) et excision de base (BER) de réparation et participe également aux autres voies de réparation, comme nucleotide excision repair (TNS)33,34,35 . Il joue un rôle de coordination important dans la réparation de l’ADN, en interaction avec un certain nombre de protéines clés, y compris le ribose polymérase 1 (PARP-1), l’ADN polymérase β (Pol β) et DNA ligase III. Nous avons utilisé XRCC1-GFP stablement exprimé dans les cellules CHO-K1 pour déterminer les doses de laser requises pour générer des BSN et BDB. Tout d’abord, nous avons identifié la dose minimale nécessaire pour induire un recrutement observable de XRCC1-GFP pour chaque longueur d’onde (Figure 1). Pour la longueur d’onde 355 nm, un temps de pause 2 s sur les dommages définis ROI a généré un signal fluorescent accru au sein de ce ROI, indiquant l’induction de dommages à l’ADN qui a été détecté sur le fond (Figure 1A). Pour 405 nm, une vitesse de balayage de 8fps était nécessaire pour générer un recrutement observable aux dommages ROI (Figure 1A). La dose a été augmentée ensuite (10 s de 355 nm et 0,5 ips pour 405 nm) pour créer une plus intense endommager ROI (Figure 1A).
Recrutement et rétention de XRCC1-GFP sur le site de dommages induits a été ensuite suivi par imagerie timelapse. Rétention de la protéine sur le site de dommages à l’ADN peut indiquer la réparation de l’ADN en cours, tandis que la dissociation de la protéine provenant du site de dommages induits est souvent considérée comme un marqueur pour BER ou SSBR. Cependant, il n’y a eu aucune preuve claire liant la dissociation de XRCC1 de sites induite par laser de l’ADN des dommages avec l’achèvement de la réparation. Recrutement de la protéine sur le site de dommages est mesurée en signalant l’intensité moyenne du signal fluorescent dans le ROI endommagé sur le signal fluorescent moyens mesuré pour le noyau entier (Figure 1B). Ce type de normalisation aide les fluctuations d’intensité adresse du signal nucléaire, bien que les autres techniques de normalisation peuvent être employés selon la distribution cellulaire de la protéine d’intérêt. Ici, XRCC1 est localisée dans le compartiment nucléaire, donc les mesures de normalisation pour le domaine nucléaire la redistribution du signal aux dommages ROI. L’intensité moyenne fluorescente de retour sur investissement est alors enregistrée pour chaque image dans le timelapse, y compris l’image de dommage avant et représentées graphiquement en fonction du temps (Figure 1C).
Ensuite, nous avons caractérisé outre les lésions induites par les deux doses de laser sélectionnés pour étudier la formation de base de l’ADN. Tout d’abord, CPD, une volumineuse lésion provoquée par les UV, la formation a été sondée par immunofluorescence comme marqueur des lésions de type TNS (Figure 2A). Ensuite, la base induite par oxydation lesion8-oxodG a été sondé comme marqueur des lésions de type BER (Figure 2B). Aucune augmentation significative des lésions CPD ont été observés à l’exposition de faible dose pour les deux longueurs d’onde (2 s de 355 nm et 8fps 405 nm), tandis que la haute dose de traitement à deux longueurs d’onde (10 s de 355 nm et 0,5 ips pour 405 nm) n’a montré une augmentation significative dans fluorescentes signal observé dans les dommages ROI (Figure 2A). Un diagramme de dispersion des CPD ROI intensité moyenne pour chaque cellule endommagée montre l’hétérogénéité dans la formation de lésions et détection à longueurs d’onde et de doses, ce qui indique qu’un faible niveau de lésions CPD peut-être être présent à des doses plus faibles, mais la charge n’est peut-être pas significativement détecté jusqu'à ce qu’une dose plus élevée est appliquée. Le diagramme de dispersion suggère également cette inefficacité dans la détection des anticorps qui peut-être limiter la quantification précise de ces mélanges de dommages.
C’est davantage mis en évidence dans la détection des lésions de l’ADN induites par oxydation par le marqueur 8-oxodG. ROI a observé aucune augmentation nette en signal fluorescent dans le dommage pour 8-oxodG à la longueur d’onde laser ou dose utilisée (Figure 2B). L’anticorps utilisé pour ce travail est compatible avec les précédentes publications9,10,36; Toutefois, il est à noter qu’il peut y avoir des limites à observer la formation de 8-oxodG avec anticorps37,38. Confirmation de l’absence de lésions induites par oxydation est également recommandée par un deuxième jalon, comme le recrutement de 8-Oxoguanine DNA Glycosylase (OGG1), l’enzyme responsable de l’enlèvement de 8-oxodG de l' ADN10. Nous n’avons pas observé OGG1 recrutement sur nos sites de dommages d’ADN ; Toutefois, la formation de faibles niveaux d’altération de l’ADN induite par oxydation ne peut être écartée complètement.
Enfin, nous avons examiné la formation des CDB à l’aide de deux marqueurs, γH2AX et 53BP-1, à la sélectionnerdoses d laser par immunofluorescence (Figure 3 &#38; 4). ΓH2AX est couramment utilisé comme marqueur de pause strand, mais sa spécificité pour la CDB a été remise en question dans un certain nombre de rapports39,40. En outre, c’est un événement de phosphorylation qui se propage sur le site de pause strand, localisation du signal à une rupture de brins peut donc être limitée en raison de cette propagation du signal. Par conséquent, alliant γH2AX 53BP-1 permet une évaluation plus précise de formation de l’ORD dans le ROI des dommages.
La réponse de γH2AX et 53BP-1 micro-irradiation est longueur d’onde et dose-dépendante. La faible dose (2 s) stimulation à 355 nm ne suscite aucune réaction à 5 et 20 min et une irradiation faible et variable de réponse de post 10 min (Figure 3A) pour chaque marqueur. La dose élevée (10 s) 355 nm micro-irradiation induit un signal fluorescent accru dans le ROI des dommages à 5, 10 et 20 min après irradiation qui est réduite à 40 min (Figure 3B). Ces résultats indiquent que prudent titrage de la dose de 355 nm est nécessaire pour minimiser la Croix-stimulation des voies de réparation, comme en témoigne la détection réduite de la double brin pause marqueur γH2AX aux points temps précoce (&#60; 20 min) à faible dose appliqué.
Des expériences similaires ont été effectuées à l’aide de basse (8 i/s) et une dose élevée (0,5 ips) 405 nm laser la stimulation (Figure 4). À cette longueur d’onde une accumulation importante de l’intensité de fluorescence dans le ROI des dommages a été observée pour les 53BP-1 et γH2AX quelle que soit la dose appliquée, ce qui indique que ces doses produisent un mélange complexe de brins simples et doubles presque immédiatement après l’induction de dommages à l’ADN (Figure 4). En outre, les fortes doses de 405 émission nm γH2AX pan-nucléaire coloration moins de 10 min d’induction de dommages (Figure 4B, en bas) une augmentation qui est difficile détection des dommages ROI au rapport, tandis que l’accumulation de 53BP-1 est plus contenus dans les dommages ROI.
Ces résultats démontrent clairement que 405 nm micro-irradiation n’est pas approprié pour la surveillance SSBR ou BER, et que plusieurs marqueurs ADN adduits et cassures de brins devraient être utilisées pour caractériser complètement les lésions induites et les réponses de réparation de l’ADN.
Modification de la dose-dépendante dans le recrutement et la rétention de XRCC1-GFP Une fois que les lésions de l’ADN induites a été caractérisée, micro-irradiation laser peut être une plate-forme idéale pour étudier la dynamique des protéines de réparation de l’ADN. La cinétique de rétention et la dissociation de la GFP-XRCC1 montre une dépendance de dose (Figure 1), qui n’est pas surprenante compte tenu de l’induction de mélanges différents dommages de chaque longueur d’onde. Les plus fortes doses d’irradiation (10 s et fps 0,5) montrent un recrutement d’intensité plus élevé de XRCC1-GFP par rapport aux faibles doses et de rétention de le XRCC1-GFP sur le site de dommages au cours de temps de 20 min (Figure 1C). Cela indique que les dommages à l’ADN créé aux doses plus élevées pour les 355 et 405 nm sont probablement ne pas résolu au cours de l’expérience, ce qui concorde avec l’apparence et la rétention des marqueurs, des γH2AX et des 53BP-1 ORD (Figures 3 &#38; 4 ).
Fait intéressant, les doses plus faibles de dommages (2 s et 8fps) montrent recrutement rapide de XRCC1-GFP vers les sites de dommages et de la dissociation de XRCC1-GFP au cours temps expérimental à des niveaux d’irradiation préalable (Figure 1C). Sans la caractérisation complète du mélange des dommages, ceci peut conduire à la conclusion que BSN et lésions base sont complètement résolues à l’aide de ces conditions dommageables. Toutefois, la présence de γH2AX et 53BP-1 à 40 min pour 355 nm et à 5 min du 405 nm peut conduire à des interprétations différentes. Pour la dose de s 355 nm 2, le mélange de dommages peut être majoritairement SSBs, alors l’apparition des marqueurs ORD 40 min peut indiquer que certaines lésions non réparées peuvent être conduit à la CDB ou que CDB générée par cette énergie est réparées sur une échelle de temps plus longue. Différences d’échelle de temps entre réparation SSBR et Ord ont été rapportées antérieurement28,41,,42. De même, la dissociation de faible dose (8 i/s) 405 nm peut indiquer un faible niveau de BSN ou un clustering de BSN qui sont transforment rapidement à la CDB, qui se distingue par la haute endommager ADN micro-irradiation et autre nuisibles des agents précédemment43, 44 , 45.
Ensemble, ces résultats soulignent l’importance de caractériser les mélanges de dommages induits et utilisant l’ADN de plusieurs protéines de réparation et marqueurs pour interpréter le recrutement et la rétention de l’ADN réparation protéines aux sites des dommages induits.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig1.jpg"> 
Figure 1 . Micro-irradiation laser induit le recrutement de XRCC1-GFP.  (A) CHO-K1 cellules exprimant de manière stable XRCC1-GFP ont été irradiés et imagés avant et immédiatement après l’induction de dommages. Les flèches indiquent l’emplacement de dose d’irradiation micro et barre d’échelle est 10 µm. B recrutement est mesurée en déterminant l’intensité moyenne fluorescente dans le ROI des dommages et en normalisant à l’intensité de fluorescence moyenne du noyau entier. (C) dynamique de recrutement peut être mesurée pour chaque image de timelapse. Graphiques sont représentatives des deux expériences indépendantes avec barres d’erreur qui représente le SEM (n = 24). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig2.jpg"> 
Figure 2 . Micro-irradiation laser induit des dommages de nucléotides.  Cellules CHO-K1 ont été soumis au laser micro-irradiation et fixés immédiatement après l’induction de dommages. 8-oxodG adduits et immunofluorescence ont été effectué pour détecter les CPD. (A) haut, diagramme de dispersion de la fluorescence de ROI moyenne intensités observées dans les cellules endommagées après coloration de la CPD. Bas, images représentatives de coloration de la CPD. Les flèches indiquent l’emplacement du micro-irradiation et la barre d’échelle est de 10 µm (n = 12). (B) les images représentatives pour la coloration de la 8-oxodG. Flèchesindiquer l’emplacement du micro-irradiation et la barre d’échelle est 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig3.jpg"> 
Figure 3 . Marqueurs d’ADN double brin pause répondent à 355 nm micro-irradiation dans une façon dose-dépendante.  Cellules CHO-K1 ont été soumis à une irradiation-micro et fixés à la fois points indiqués après stimulation. Immunofluorescence pour la DSB marqueurs γH2AX et 53BP-1 a été réalisée. (A) Nuage de points de dégâts normalisée ROI signifie les intensités de fluorescence mesurées pour les cellules intactes et endommagés. Barres d’erreur représentent le SEM (n = 12). (B) les images représentatives pour γH2AX et coloration 53BP-1. Les flèches indiquent l’emplacement du micro-irradiation et la barre d’échelle est 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig4.jpg"> 
La figure 4. Marqueurs d’ADN double brin pause répondent fermement à 405 nm micro-irradiation. Cellules CHO-K1 ont été soumis à une irradiation-micro et fixés à la fois points indiqué après stimulation. Immunofluorescence pour la DSB marqueurs γH2AX et 53BP-1. (A) Nuage de points de dégâts normalisée ROI signifie les intensités de fluorescence mesurées pour les cellules intactes et endommagés. Barres d’erreur représentent le SEM (n = 12). (B) les images représentatives pour γH2AX et coloration 53BP-1. Les flèches indiquent l’emplacement du micro-irradiation et la barre d’échelle est 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig4large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Confocal fluorescence microscopie et laser micro-irradiation offre des outils pour induisant des dommages à l’ADN et le suivi de la réponse des protéines de réparation d’ADN dans certaines zones Sub nucléaires. Cette technique a grandement avancer nos connaissances sur la détection des dommages causés, de signalisation et de recrutement. Ce manuscrit montre ces technologies afin d’examiner la réparation de rupture de brins simples et doubles.

Application de Micro-irradiation Laser pour examen du Single et Double brin pause réparation dans les cellules de mammifères

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

L'objectif général de cette procédure est d'induire un dommage de l'ADN dans une région sous-nucléaire d'une cellule à l'aide d'un laser de microscopie à fluorescence confocale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la réparation de l'ADN, telles que la manière dont les protéines sont recrutées et retenues aux sites de dommages de l'ADN. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet une visualisation en temps réel de la protéine d'intérêt, ce qui permet d'établir le profil de son recrutement et de sa rétention.Commencez cette procédure en plaçant une lame à chambre contenant les cellules d'intérêt dans un incubateur de platine maintenu à 37 degrés Celsius et à 5 % de dioxyde de carbone. Enregistrez les champs d'image à l'aide d'une platine motorisée codée de microscope. Sélectionnez une caractéristique reconnaissable du récipient de culture, comme la barrière entre les puits.Acquérez une image et enregistrez la position X-Y. Cela permettra l'alignement et la mise en correspondance des positions X-Y des champs sélectionnés après la préparation de l'échantillon. Une fois la mise en correspondance des images terminée, sélectionnez un champ pour la micro-irradiation et focalisez l'échantillon.Pour les cellules exprimant des protéines marquées par un fluorophore, sélectionnez le plan focal présentant la section transversale nucléaire maximale dans le canal de fluorescence d'intérêt. Il est essentiel de se focaliser sur la section transversale maximale du noyau, car cela garantit que le point focal est centré sur le noyau afin de suivre le recrutement de la protéine d'intérêt au site de dommages induits. Choisissez une structure bien définie à l'intérieur du noyau, comme le nucléole, et déplacez le plan focal vers le haut et vers le bas tout en observant ce changement d'apparence.Le plan focal réel se situe dans la zone de transition entre la lumière et l'obscurité. Pour focaliser l'échantillon, sélectionnez le plan focal dans lequel la caractéristique choisie présente le contraste le plus net. La prochaine étape consiste à enregistrer la position du champ d'intérêt.Créez une région d'intérêt carrée de trois pixels sur trois, ou ROI, dans le logiciel du microscope. Placez ce ROI au-dessus du noyau d'une cellule à endommager et définissez ce ROI comme étant le ROI endommagé. Acquérez une image préalable à l'endommagement incluant la position du ROI d'endommagement.Acquérir une image contenant le champ clair dans le canal de fluorescence pour la protéine d'intérêt. Les cellules sont désormais prêtes pour l'irradiation micro-laser. Pour cette démonstration, le laser de 405 nanomètres sera utilisé à une puissance de 100 %.La dose du laser de 405 nanomètres est contrôlée en modulant la vitesse de balayage et en effectuant un seul balayage de la région d'intérêt sélectionnée pour l'endommagement. Dans cette expérience, utilisez huit et 0,5 image par seconde pour la micro-irradiation à 405 nanomètres. Le choix de la puissance laser appropriée pour endommager les cellules est essentiel afin de distinguer les différentes voies de réparation de l'ADN.Réalisez une acquisition d'images en laps de temps des canaux en champ clair et en fluorescence après le dommage. Ajustez la durée et la fréquence du laps de temps afin d'optimiser la collecte de données, en capturant idéalement l'accumulation de la protéine fluorescente dans la région d'intérêt (ROI) du dommage et sa dissociation au cours du temps de l'expérience. Une fois le cours temporel terminé, sélectionnez un nouveau champ de cellules à endommager et poursuivez l'irradiation microscopique et l'acquisition d'images en laps de temps jusqu'à atteindre le nombre souhaité de cellules endommagées.Il est recommandé d'avoir de 10 à 25 cellules par condition sélectionnée. Pour augmenter le nombre total de cellules destinées à l'analyse en immunofluorescence, endommagez des champs supplémentaires dans le récipient de culture afin de générer un suivi temporel multifocal de la réponse post-lésion. Enregistrez la position X-Y de chaque champ ainsi que l'heure à laquelle l'endommagement s'est produit.Les cellules peuvent être fixées immédiatement après le dommage ou laissées en réparation pendant des intervalles de temps choisis avant la fixation. Pour commencer cette analyse, ouvrez les images acquises dans une application d'analyse d'images telle que NIS-Elements. Pour chaque cellule à mesurer, créez d'abord une ROI de référence représentant le noyau.Utilisez un algorithme de seuil sur le signal de fluorescence contenant les pixels formant le noyau, puis convertissez cette zone en une région d'intérêt (ROI). Ensuite, créez une ROI de six pixels par six pixels et placez-la au-dessus de la ROI de dommage. Cette ROI plus grande devient maintenant la ROI de dommage pour l'analyse.Pour chaque cellule à mesurer, enregistrez l'intensité moyenne de fluorescence pour les régions d'intérêt (ROI) de référence et de dommage. Pour chaque image de la série temporelle, ajustez la ROI de référence afin de couvrir précisément la zone nucléaire, et ajustez la ROI de dommage afin de garantir que la zone endommagée est bien incluse. Enregistrez l'intensité moyenne de fluorescence du signal fluorescent à l'intérieur de chaque ROI pour chaque image de la série temporelle.Pour chaque cellule, normalisez l'intensité moyenne de fluorescence de la région d'intérêt (ROI) lésée par rapport à celle de sa région de référence correspondante dans chaque image de la série temporelle. Ici, l'intensité moyenne de fluorescence nucléaire est utilisée comme ROI de référence, et la normalisation est effectuée en soustrayant l'intensité moyenne de fluorescence du ROI de référence de l'intensité moyenne de fluorescence du ROI lésé. Répétez la normalisation pour toutes les cellules endommagées ainsi que pour au moins deux cellules contrôles non endommagées.Enfin, représentez graphiquement les valeurs d'intensité normalisées en fonction du temps pour montrer les changements dans la dynamique de recrutement en fonction du traitement expérimental. Des cellules exprimant de façon stable XRCC1-GFP ont été irradiées et observées en microscopie avant et après l'induction de dommages. Le recrutement de XRCC1-GFP vers la région d'intérêt (ROI) endommagée a été observé et la dynamique de recrutement mesurée.La formation des cassures double brin a été examinée à l'aide de deux marqueurs. Pour les deux marqueurs, la deuxième stimulation à faible dose à 355 nanomètres n'entraîne aucune réponse à cinq minutes et à 20 minutes, et une réponse faible et variable à 10 minutes après l'irradiation. La micro-irradiation de 10 secondes à forte dose à 355 nanomètres induit un signal fluorescent accru au sein de la région d'intérêt (ROI) lésée à cinq, 10 et 20 minutes après l'irradiation, qui diminue à 40 minutes.Ces résultats indiquent que les marqueurs de cassures double brin de l'ADN réagissent à une micro-irradiation à 355 nanomètres de manière dépendante de la dose. En revanche, une stimulation au laser à 405 nanomètres a entraîné une accumulation significative des deux marqueurs au sein de la région d'intérêt endommagée, quelle que soit la dose appliquée. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ quatre heures pour 10 cellules, si elle est effectuée correctement.Lors de l'utilisation de cette technique, il est important d'ajuster la longueur d'onde du laser et la puissance appliquée au processus de réparation en cours de surveillance. Après cette procédure, une immunofluorescence peut être réalisée afin de répondre à des questions concernant le recrutement de protéines supplémentaires ou des modifications de l'état de phosphorylation ou d'autres modifications post-traductionnelles. Cette technique permet aux chercheurs d'explorer le recrutement dynamique des protéines de réparation de l'ADN et de mieux déterminer comment les domaines protéiques et les mutations influencent la reconnaissance et la réponse aux dommages de l'ADN.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser un microscope confocal à balayage laser pour induire des dommages de l'ADN et suivre le recrutement des protéines de réparation de l'ADN. N'oubliez pas que travailler avec des lasers et des produits chimiques tels que le formaldéhyde peut être extrêmement dangereux, et que des précautions, comme le port d'équipements de protection individuelle, doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.

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Cet article décrit la GFP basée sur la...

L&#39;analyse de l&#39;ADN double-brin Break (ORD) de réparation dans les cellules de mammifères

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Analyse des molécule laser Localisés psoralène adduits

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Ce protocole décrit une méthode non invasive pour identifier efficacement les cellules en phase S pour les études de microscopie en aval, telles que la mesure du recrutement des protéines de réparation de l’ADN par micro-irradiation laser.

Micro-irradiation laser pour étudier le recrutement de l’ADN pendant la phase S

Ce manuscrit fournit un protocole pour l’analyse des cassures double brin de l’ADN par la microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1.

La microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 pour l’analyse de la Formation et la réparation des cassures Double brin de l’ADN

En Indonésie, la biopsie des gangudes sentinelles (BNS) n'est pas pratiquée régulièrement pour la chirurgie du cancer du sein en raison de la limitation de fournir un traceur radio-isotope et un isosulfan ou un colorant bleu breveté (PBD). Pour surmonter cet obstacle, nous avons appliqué 1% de colorant bleu méthylène (MBD) comme un seul agent pour cartographier les nœuds sentinelles (SN).

L'application de 1% de méthylène Blue Dye comme une technique unique dans le cancer du sein Sentinel Node Biopsie

Réparation des cassures double brin de l’ADN est un processus dynamique, qui exige non seulement la formation de complexes de réparation sur les sauts, mais également leur résolution après que la lésion est adressée. Ici, nous utilisons la microscopie d’immunofluorescence pour les pauses bicaténaire transitoires et de longue durée comme outil de disséquer ce mécanisme de maintenance du génome.

Caractériser les processus de réparation de l’ADN à des cassures de l’ADN bicaténaires durables et transitoires de la microscopie par Immunofluorescence

Découvrez la micro-irradiation laser pour étudier la réparation de l'ADN dans les cellules de mammifères. Cette technique permet de visualiser en temps réel le recrutement des protéines XRCC1-GFP aux sites de dommages.

Application de Micro-irradiation Laser pour examen du Single et Double brin pause réparation dans les cellules de mammifères

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