PAR-Clip - Une méthode pour identifier transcriptome à l'échelle des sites de liaison des protéines liant l'ARN

L’objectif général de cette procédure est de déterminer les sites de liaison à l’échelle du transcriptome des protéines de liaison à l’ARN ou RVP. Ceci est accompli en utilisant d’abord des analogues nucléosidiques photoréactifs pour le marquage in vivo des transcrits naissants. La deuxième étape de la procédure consiste à réticuler l’ARN et les protéines de liaison à l’ARN par une lumière UV de 365 nanomètres.

La troisième étape de la procédure consiste à immunoprécipiter la protéine de liaison à l’ARN étudiée et à récupérer la réticulation à l’ARN. La dernière étape de la procédure consiste à convertir l’ARN en une banque de CD NA et une séquence profonde. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent les sites de liaison à l’échelle du transcriptome des RVP et permettent de définir l’élément de reconnaissance de l’ARN et ses préférences de liaison.

Bonjour, je m’appelle Marcus Hoffner du laboratoire de Tom SEL à l’Université Rockefeller de New York. Aujourd’hui, nous allons présenter une méthode appelée par lip ou photoable rib nucleoside analog enhanced crosslinking and immunoprecipitation. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour identifier sur un transcriptome par son écaillaire, les sites de liaison des protéines de liaison à l’ARN et leurs motifs et préférences de liaison.

D’accord, alors commençons. La réticulation UV in vivo commence dans une hotte à flux laminaire. Dans ce protocole, nous utiliserons l’IGF marqué, deux BP, une cellule, comme modèle exemplaire en utilisant une technique stérile.

Développer HEK 2 93 cellules exprimant de manière stable le drapeau HA marqué IGF deux BP un sous le contrôle d’un répresseur Tet dans un milieu de culture cellulaire HEK 2 93 utiliser entre 100 et 400 fois 10 à la sixième cellule et les faire croître jusqu’à environ 80 % de fluidité. 14 heures avant la réticulation, les cellules avaient l’analogue riboside photoréactif pour la thio uridine ou pour SU directement dans le milieu de culture cellulaire. Alternativement, six èmes guines ou six SG peuvent être utilisés après l’ajout du riboside photoréactif induire l’expression du drapeau HA marqué IGF deux BP un par l’ajout de cellules doxycycline sont ensuite incubés pendant la nuit dans un incubateur cellulaire.

Ensuite, décantez le milieu de croissance. Ensuite, lavez une fois les cellules avec 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate glacée par plaque. Retirez ensuite complètement le PBS par décantation.

Placez les plaques découvertes sur un plateau avec de la glace et irradiez-les avec une lumière UV de 365 nanomètres dans un enjambeur de liaison 2, 400 réticulant UV ou équivalent suite à un rayonnement UV, grattez les cellules avec un policier en caoutchouc dans un millilitre de PBS par plaque. Transférez les cellules dans des tubes de centrifugation de 50 millilitres et centrifugez-les à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le super nom et conservez la pastille de cellule.

À ce stade, les granules de cellules peuvent être congelées dans de l’azote liquide et stockées à moins 80 pendant au moins 12 mois. Pour poursuivre la procédure, mettez la pastille en suspension en trois volumes d’un tampon de lyse X NP 40 et incubez sur de la glace pendant 10 minutes. Éliminer le lysat cellulaire par centrifugation à 13 000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, clarifiez davantage le lysat en le filtrant à travers un filtre à seringue à membrane de cinq microns. Enfin, ajoutez les ARN T un à une concentration finale d’une unité par microlitre et incubez dans un bain-marie à 22 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, refroidissez la réaction sur de la glace pendant cinq minutes.

Suite à une réticulation UV in vivo. Préparez les billes magnétiques pour l’immunoprécipitation. Transférez 10 microlitres de particules magnétiques de protéine G de billes de dyne par un mil de lysat cellulaire dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre.

Placez ensuite le tube contenant les billes sur un support magnétique pendant une à deux minutes. Retirez le surnageant et ajoutez un millilitre de tampon de phosphate de citrate dans le tube pendant qu’il se trouve sur le séparateur magnétique. Ensuite, bouchez le tube et vortex l’échantillon pour remettre les billes en suspension.

Centrifugez brièvement pour recueillir les billes restantes dans le capuchon du tube. Répétez ce lavage avec un millilitre supplémentaire de tampon de phosphate de citrate. Après le lavage, suspendre les billes et le tampon phosphate de citrate à un volume de deux fois le volume initial de la suspension de betterave.

Ajoutez ensuite 0,25 milligramme d’anticorps monoclonaux Anti-Flag M pour un millilitre de suspension de battement. Incuber la suspension sur une roue rotative pendant 40 minutes à température ambiante après l’incubation, laver les billes deux fois dans un millilitre de tampon de phosphate de citrate comme décrit précédemment, ce lavage sert à éliminer tout anticorps non lié après le lavage Resus, suspendre les billes et le tampon de phosphate de citrate comme avant quatre. Pour commencer l’immunoprécipitation, ajoutez les billes magnétiques conjuguées d’anticorps fraîchement préparées aux ARN T un lysat cellulaire traité.

Transférez le mélange dans des tubes de centrifugation de 15 millilitres et tournez pendant une heure à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, récupérez les billes magnétiques, jetez les billes de surnageant en suspension dans un millilitre de tampon de lavage IP et transférez-les dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre. Lavez les billes comme décrit ci-dessus deux fois dans un millilitre de tampon de lavage IP.

Après le lavage final, suspendez les billes dans le volume de cordon d’origine du tampon de lavage IP. Ajoutez ensuite RNAT un à une concentration finale de 100 unités par microlitre. Incuber la suspension de perles dans un bain-marie à 22 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Ensuite, refroidissez la suspension sur de la glace pendant cinq minutes. Ensuite, lavez les perles trois fois dans un millilitre de tampon de lavage à haute teneur en sel. Ensuite, mettez les billes en suspension dans un volume de billes d’origine de tampon de déphosphorylation.

Ajouter la phosphatase alcaline intestinale de veau à une concentration finale de 0,5 unité par microlitre et incuber la suspension pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Lavez les billes deux fois dans un millilitre de tampon de lavage à la phosphatase, puis deux fois de plus dans une polynucléotide kinase ou un tampon PNK sans DTT. Enfin, remettez les billes en suspension dans un volume de bille d’origine de la mémoire tampon PNK.

Commencer le radiomarquage de l’ARN réticulé. Ajoutez gamma 32 PATP et T quatre PNK à un volume de bille d’origine de la suspension de bille fraîchement préparée. Incuber la suspension pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, ajoutez un TP non radioactif à la suspension et incubez-le pendant cinq minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez les billes magnétiques cinq fois avec 800 microlitres de tampon PNK sans DTT. Enfin, remettez en suspension les billes dans 70 microlitres de page FDS.

Incuber la suspension du radiomarqueur pendant cinq minutes dans un bloc chauffant à 95 degrés Celsius pour dénaturer et libérer les protéines de liaison à l’ARN immunoprécipité avec l’ARN réticulé. Ensuite, retirez les billes magnétiques sur le séparateur et transférez le super natin dans un tube de micro-centrifugeuse propre de 1,5 millilitre Chargez 40 microlitres de suade par puits d’un novox bis triss quatre à 12 % de gel poly acrylamide préfabriqué et faites fonctionner le gel pendant 55 minutes à 200 volts. Une fois que le gel a coulé, démontez la chambre de gel et démontez les plaques, en laissant le gel monté sur une plaque pour faciliter l’alignement du gel sur l’impression du papier de l’imageur phospho.

Implantez trois minuscules morceaux de gel radioactif de manière asymétrique aux coins du gel. Enveloppez le gel dans un film plastique tel que Saran wrap pour éviter toute contamination. Exposez le gel à un écran vide d’imageur phospho pendant une heure et celui-ci sur un imageur phospho.

Ensuite, alignez le gel sur l’impression de l’imageur phospho à l’aide des morceaux de gel implantés pour l’orientation. Découpez les bandes qui correspondent à la taille attendue de la protéine de liaison à l’ARN ou RBP. Transférez les bandes dans un tube MIDI dtu dialyzer et ajoutez 800 microlitres d’un tampon de course XSDS électro élué.

Le complexe réticulé R-N-A-R-B-P à 100 volts pendant deux heures selon les instructions du fabricant. Suite à l’électro-élution. Ajoutez le tampon protéinase K et la protéinase K incubez la solution pendant 30 minutes à 55 degrés Celsius.

Récupérer l’ARN par extraction à l’alcool isoamylique phénol chloroforme acide, suivie d’une extraction au chloroforme. Ajoutez ensuite un microlitre de glycogène et précipitez l’ARN en ajoutant trois volumes d’éthanol. Enfin, dissolvez la pastille obtenue dans 10,5 microlitres d’eau.

Une fois que l’ARN a été récupéré, faites-le passer par un protocole standard de préparation de banque d’ADNC et effectuez une analyse bioinformatique minutieuse des lectures de séquences. Les résultats représentatifs pour un clip par réalisé avec des cellules HK 2 93 exprimant le drapeau Hha, l’IGF marqué, deux BP un sont montrés avec les analogues nucléosidiques photoréactifs quatre SU et six SG L’efficacité de réticulation du riboside photoréactif alternatif six SG est généralement inférieure à celle de quatre su. L’efficacité de réticulation plus faible pourrait entraîner un fond plus élevé de séquences dérivées de fragments d’ARN cellulaires abondants et, par conséquent, davantage de cellules devraient être initialement utilisées pour l’expérience.

Différents analogues photoréactifs de l’uridine par clip sont comparés à la réticulation ou au clip traditionnel UV 2 54 nanomètres, comme on le voit ici. La réticulation des protéines d’ARN UV 2 54 nanomètres a une efficacité de réticulation limitée. L’intensité de la bande radioactive de taille appropriée indique si l’expérience par clip a fonctionné et si suffisamment d’ARN a été isolé pour passer par un protocole de séquençage de petit ARN.

La fréquence des mutations caractéristiques dans les lectures séquencées après analyse bioinformatique est indicative de séquences réticulées réussies. Ces mutations sont des transitions T deux C lors de l’utilisation de quatre SU et G deux transitions A lors de l’utilisation du succès. G.La caractéristique déterminante de park lip est la possibilité de dériver l’emplacement de la réticulation en marquant une mutation caractéristique résidant dans les banques de CD NA préparées à partir des ARN récupérés.

Cela permet de séparer facilement le signal dérivé d’ARN spécifiquement liés, du bruit des séquences dérivées de fragments co-isolés d’ARN cellulaires abondants. Nous vous avons donc montré aujourd’hui comment isoler des segments d’ARN, spécifiquement reconnus par les protéines de liaison à l’ARN. Lors de cette procédure.

Il est important de travailler sans ARN. Voilà. Merci d’avoir regardé et bonne chance pour les expériences.