Name: PAR-Clip - Une méthode pour identifier transcriptome à léchelle des sites de liaison des protéines liant lARN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Découvrez la méthode PAR-CLIP pour identifier les sites de liaison des protéines liant l'ARN à l'échelle du transcriptome. Cette technique utilise des analogues nucléosidiques photoréactifs et le réticulage UV pour étudier les interactions ARN-protéines.

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Nous remercions les membres du laboratoire Tuschl des discussions utiles. MH est soutenu par le Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD). Ce travail a été soutenu par le Fonds national suisse de Grant # 3100A0-114001 à MZ; TT est un enquêteur HHMI, et de travailler dans son laboratoire a été financée par des subventions du NIH et de GM073047 MH08442 et la Fondation Starr.

Le protocole ci-dessous décrit la procédure de PAR-Clip pour cellules HEK293 exprimant DRAPEAU / HA-taggés IGF2BP1 lors de l'induction par la doxycycline. Nous allons utiliser un anticorps anti-FLAG pour immunoprécipitation. PAR-Clip fonctionnera avec n'importe quel lignée cellulaire exprimant des niveaux détectables de l'endogène, sans étiquette ARN protéine de liaison (RBP) d'intérêts si un anticorps efficace pour immunoprécipitation est disponible. Cellules Expansion <ol><li> Développer FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 cellules dans un milieu de croissance. Nous vous recommandons d'utiliser entre 100 à 400 x 10 6 cellules (environ 10 à 40 cm 15 assiettes de culture cellulaire) comme point de départ. Cultivez-les à environ 80% de confluence. </li><li> 14 h avant réticulation ajouter un) 4-thiouridine à une concentration finale de 100 uM (1:1000 v / v d'un M 1 4-thiouridine solution stock) directement au milieu de culture cellulaire et b) induire l'expression de l'indicateur / HA taggés IGF2BP1 par addition de 1 ug / ml de doxycycline (1:10.000 v / v de 10 mg / ml solution stock doxycycline). REMARQUE: au lieu de 4-thiouridine vous pouvez également utiliser 100 uM de 6-thioguanosine. </li></ol> Réticulation UV <ol><li> Laver les cellules une fois avec 10 ml PBS glacé par plaque et retirez PBS complètement. </li><li> Placez les plaques sur un plateau avec de la glace et irradier découverts à 0,15 J / cm 2 de 365 nm de lumière UV dans un Stratalinker 2400 (Stratagene) ou un appareil similaire. </li><li> Racler les cellules off avec une spatule en caoutchouc dans 1 ml de PBS par plaque, le transfert de 50 tubes de centrifugation ml et recueillir par centrifugation à 500 g pendant 5 min à 4 ° C et jeter le surnageant. 100 x 10 6 cellules HEK293 (10 15 cm plaques) donnera environ. 1 ml de cellule humide de granules. </li><li> (Optionnel) Sauf si vous voulez continuer directement avec la lyse cellulaire, choc geler les cellules dans l'azote liquide et stocker granulés à -80 ° C. Les culots cellulaires peuvent être conservés pendant au moins 12 mois. </li></ol> Lyse cellulaire et RNaseT1 digérer <ol><li> Relevez culot cellulaire de cellules réticulées dans 3 volumes de tampon de lyse NP40 1x et incuber sur de la glace pendant 10 min. </li><li> Lysat à cellules claires par centrifugation à 13000 xg pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Effacer le lysat encore en le filtrant à travers un filtre à membrane de 0,2 um seringue (Acrodisc Pall ou équivalent). </li><li> Ajouter ribonucléase T1 (Fermentas, 10000 U / pl) à une concentration finale de 1 U / pl et incuber dans un bain-marie pendant 15 min à 22 ° C. Refroidir la réaction par la suite pour 5 min sur la glace avant de procéder. </li></ol> Immunoprécipitation et la récupération des fragments d'ARN cibles réticulé Utiliser le séparateur magnétique Suivez ces directives tout au long de la préparation de l'échantillon pour empêcher les billes magnétiques de se dessécher. <ol><li> Placer le tube contenant les billes sur le support magnétique pour 1 2 minutes. </li><li> Ajouter le tampon dans le tube alors que le tube est sur le séparateur magnétique. </li><li> Boucher le tube, le retirer du séparateur magnétique, et remettre en suspension les perles. Vous pouvez remettre en suspension les perles en feuilletant le tube avec votre doigt ou d'utiliser un Vortexer fixé à 5 6. </li><li> Centrifuger brièvement pour ramasser toutes les billes qui peuvent rester dans le bouchon du tube. </li><li> Répétez les étapes 1 à 4 selon les besoins. </li></ol> Préparation des billes magnétiques <ol><li> Transférer 10 ul de particules magnétiques Dynabeads protéines G (Invitrogen) lysat par cellule ml (pour une expérience typique elle devrait être d'env. 40 50 ul de billes) à un tube de 1,5 ml. Lavez perles deux fois avec 1 ml de tampon citrate-phosphate. </li><li> Remettre en suspension dans un volume double de tampon citrate-phosphate par rapport au volume initial de billes en suspension. </li><li> Ajouter 0,25 pg d'anti-FLAG anticorps monoclonal M2 (Sigma) par ml de suspension et incuber sur une roue en rotation pendant 40 min à température ambiante. </li><li> Lavez perles deux fois dans 1 ml de tampon citrate-phosphate pour éliminer l'anticorps non liés. </li><li> Remettre les billes dans le double du volume de tampon citrate-phosphate par rapport au volume initial de billes en suspension. </li></ol> Immunoprécipitation (IP), deuxième RNase T1 digestion, et la déphosphorylation <ol><li> Ajouter 20 ul d'anticorps fraîchement préparés conjugués des billes magnétiques par ml de lysat partielle RNase T1 cellule traitée et incuber dans 15 ml tubes de centrifugation sur une roue en rotation pendant 1 h à 4 ° C. </li><li> Recueillir des billes magnétiques sur un collecteur de particules magnétiques de 15 et 50 tubes de centrifugation ml (Invitrogen) et le transfert des tubes de 1,5 ml de microcentrifugation. </li><li> Lavez perles 3 fois dans 1 ml de tampon de lavage IP. </li><li> Ajouter RNaseT1 (Fermentas, 10000 U / pl) à une concentration finale de 100 U / ul et incuber la suspension de billes dans un bain-marie pendant 15 min à 22 ° C. Refroidir la suite sur la glacependant 5 min. </li><li> Lavez 3 fois en perles de 1 ml de tampon de lavage haute-sel. </li><li> Perles Remettre en suspension dans 1 volume de tampon de déphosphorylation </li><li> Ajouter phosphatase intestinale de veau alcaline (CIAP, ONE) à une concentration finale de 0,5 U / pl, et incuber la suspension pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Lavez perles fois dans 1 ml de tampon de lavage phosphatase </li><li> Laver deux fois en perles kinase (PNK) tampons polynucléotide sans DTT (la concentration la TNT nécessaires à la réaction enzymatique est suffisamment élevée pour endommager les billes magnétiques). </li><li> Resuspendre perles perles en un seul volume initial de tampon PNK </li></ol> Le marquage des segments d'ARN aux protéines réticulées immunoprécipité <ol><li> Pour la suspension de billes décrites ci-dessus, ajouter Υ-32 P-ATP à une concentration finale de 0,5 pCi / ul et T4 PNK (ONE) à 1 U / ul dans un volume de billes d'origine. Incuber la suspension pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter ATP non radioactif pour obtenir une concentration finale de 100 uM et incuber pendant encore 5 min à 37 ° C. </li><li> Laver les billes magnétiques 5 fois avec 800 pl d'PNK tampon sans TNT. </li><li> Resuspendre les perles dans 70 ul de tampon de chargement SDS-PAGE. </li></ol> SDS-PAGE et électroélution des réticulé ARN-protéine complexes à partir de tranches de gel <ol><li> Incuber la suspension radiomarqué pendant 5 min dans un bloc chauffant à 95 ° C pour dénaturer et la libération de la RBP immunoprécipités avec l'ARN réticulé et vortex. </li><li> Retirez les billes magnétiques sur le séparateur et le transfert du surnageant dans un tube de centrifugeuse propre de 1,5 ml. </li><li> Charge 40 ul du surnageant par puits d'une Novex Bis-Tris à 4-12% (Invitrogen) en gel de polyacrylamide préfabriqué et exécuter le gel pendant 55 min à 200 V. </li><li> Démonter la chambre de gel et de démanteler le gel, la laissant monté sur une plaque. Pour faciliter l'alignement du gel à l'impression sur papier phosphorimager, nous recommandons l'implantation de trois minuscules morceaux de gel radioactifs asymétrique à trois des quatre coins du gel. Morceaux de gel radioactifs peuvent être recueillies à partir de gels qui ont été précédemment utilisé pour purifier radiomarqué oligonucléotides synthétiques. Envelopper le gel dans un film plastique (par exemple, Saran) pour éviter toute contamination. </li><li> Exposer le gel d'un écran blanchi phosphorimager pendant 1 h et de visualiser sur un phosphorimager. </li><li> Aligner le gel sur le dessus de l'impression phosphorimager utilisant les morceaux de gel implanté pour l'orientation. Découpez les bandes qui correspondent à la taille attendue de la RBP (IGF2BP1, env. 75 kDa) et transférer dans un tube D-Tube dialyseur Midi et ajouter 800 ul 1x tampon SDS cours d'exécution. </li><li> Electroelute réticulé ARN-RBP complexes en 1x SDS courir tampon à 100 V pendant 2 h. excisés du gel et électro dans un Midi D-Tube dialyseur (Novagen) dans 800 pi de tampon SDS fonctionne selon les instructions du fabricant. </li></ol> Protéinase K digestion <ol><li> Ajouter un volume égal de tampon 2x protéinase K par rapport à la electroeluate, suivie par l'ajout de protéinase K (Roche) à une concentration finale de 1,2 mg / ml. Incuber pendant 30 min à 55 ° C. </li><li> Récupérer l'ARN par acides phénol / chloroforme / IAA d'extraction (25:24:1, pH 4,0), suivie par une extraction au chloroforme. Ajouter 1 l de glycogène (10 mg / ml stock) précipiter l'ARN en ajoutant 3 volumes d'éthanol. Dissoudre le culot dans l'eau 10,5 pi. </li></ol> la préparation d'ADNc et le séquençage de profondeur Réaliser l'ARN récupérés par un protocole standard d'ADNc préparation décrit à l'origine pour le clonage de petits ARN régulateurs 19. La première étape, la ligature adaptateur 3 ', a été réalisée comme décrit sur une échelle de 20 ul avec 10,5 ul de l'ARN récupérés. Utilisez le séquençage Solexa adaptateur ensembles décrits. Selon la quantité d'ARN récupérés, 5'-adaptateur-3'-adaptateur de produits sans inserts peuvent être détectées après amplification de l'ADNc par PCR comme des bandes supplémentaires. Dans de tels cas, le produit d'accise plus de PCR de taille attendue à partir d'un NuSieve 3% à faible point de fusion gel d'agarose, éluer le produit de PCR à partir des morceaux de gel en utilisant le kit GelElute (Qiagen) et la séquence en utilisant la technologie Solexa. Un séquençage Solexa courir offre habituellement entre 6 et 10 millions de séquences qui sont assez lit pour une couverture du transcriptome gamme de sites de liaison des protéines liant l'ARN. Analyse bioinformatique Attention analyse bioinformatique de la séquence de lit doit être fait pour obtenir un aperçu significatif dans les sites pour la liaison à l'ARN RBP examinés, tels que l'élément de reconnaissance d'ARN, les régions préférées liant le RBP a (exonique vs intronique, séquence codante vs non traduite séquence). La séquence lit doivent être alignés contre les bases de données du génome et de l'Est. Nous utilisons habituellement lit Mapping unique dans le génome avec jusqu'à un décalage, l'insertion ou la suppression de construire des grappes de la séquence lit qui peuvent ensuite être analysés ultérieurement. La fréquence des mutations caractéristiques de la grappe séquencé lit, T pour les transitions C en utilisant 4-SU et G à A transitions en utilisant 6-SG, sont révélateurs de séquences avec succès réticulé. Dans notre expérience, les ARN non réticulé étiquetés avec 4-SU montrent un taux de mutation de fond d'environ 20%. Ce taux est augmente à env. 50-80% sur la réticulation. Une description détaillée de l'analyse bioinformatique peut être trouvée dans le matériel supplémentaire de la publication par Hafner et al. 18 Étapes facultatives Détermination du taux d'incorporation de 4-thiouridine en ARN total Isoler l'ARN total à partir de la lignée cellulaire exprimant de façon stable le RBP d'intérêt après plus en milieu supplémenté avec 100 uM 4SU 16 h avant la récolte. Comme contrôle, la récolte des cellules cultivées sans ajout 4SU. Isoler l'ARN total par addition de 3 volumes de réactif Trizol (Sigma) pour les culots lavés suivant les instructions du fabricant. était encore purifier l'ARN total en utilisant Qiagen RNeasy selon le protocole du fabricant. Pour éviter l'oxydation des 4SU pendant l'isolement de l'ARN et l'analyse, ajouter 0,1 mM dithiothréitol (DTT) pour les tampons de lavage et ultérieures étapes enzymatiques. Digest et déphosphorylé ARN total à nucléosides unique pour l'analyse HPLC comme décrit avant le 20. Brièvement, dans un volume de 30 ul, incuber 40 ug d'ARN total ont été purifiées pendant 16 h à 37 ° C avec 0,4 U de phosphatase alcaline bactérienne (biochimique Worthington) et 0,09 venin de serpent U phosphodiestérase (Worthington Biochemical). En tant que norme de référence, utiliser un ARN de synthèse 4SU marqué, (nous en standard l'utilisation CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U) et également l'objet de compléter la digestion enzymatique. Séparez les mélanges résultant de ribonucléosides par HPLC sur une découverte Supelco C18 (phase greffée de particules de silice uM 5, 250 x 4,6 mm) colonne en phase inverse (Bellefonte PA, USA). Tampons HPLC sont 0,1 M dans l'acétonitrile TEAA 3% (A) et 90% d'acétonitrile dans de l'eau (B). Utilisez un gradient isocratique: 0% de B pendant 15 min, 0 à 10% de B pendant 20 min, 10 à 100% de B pendant 30 min. Appliquer un B 5 min à 100% lavez appliquée entre les courses pour nettoyer la colonne HPLC. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2034/2034fig1.jpg" alt="Figure 1"> La figure 1 (droite) montre un résultat représentatif d'une PAR-Clip réalisé avec des lignées cellulaires exprimant DRAPEAU / HA-taggés avec 4 IGF2BP1-SU et 6-SG. Notez que l'efficacité de réticulation de la 6-SG pour IGF2BP1 est inférieur au rendement de réticulation pour 4-SU. L'efficacité plus faible réticulation se traduira par un fond plus élevé des séquences dérivées de fragments d'ARN cellulaires abondants et donc vous devriez considérer élargissement de l'expérience lors de l'utilisation moins efficace nucléosides photoréactif. Le panneau de gauche de la figure 1 montre une comparaison de l'utilisation de différents analogues de l'uridine photoréactif qui pourrait être potentiellement utilisé pour PAR-Clip rapport aux traditionnels UV 254 nm de réticulation. L'intensité de la bande radioactive de la bonne longueur vous donne une bonne idée si l'expérience PAR-Clip a travaillé et que vous avez isolé l'ARN suffisantes pour mener à bien un petit protocole de séquençage de l'ARN (étape par étape pour la préparation de la description banque d'ADNc de petites séquençage des ARN peut être trouvée dans 19). La fréquence des mutations caractéristiques de la lecture séquencé, T pour les transitions C en utilisant 4-SU et G à A transitions en utilisant 6-SG, sont révélateurs de séquences avec succès réticulé. Dans notre expérience, les ARN non réticulé étiquetés avec 4-SU montrent un taux de mutation de fond d'environ 20%. Ce taux est augmente à env. 50-80% sur la réticulation.

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</ol>

TT est un conseiller cofondateur et scientifique à Alnylam Pharmaceuticals et un conseiller de Regulus Therapeutics.

Tampons et réactifs La croissance moyenne des cellules HEK293 <ul><li> DMEM </li><li> 10% de FBS </li><li> 2 mM de L-Glutamine </li><li> 100 U / ml de pénicilline </li><li> 100 U / ml de streptomycine </li><li> 100 pg / ml d&#39;hygromycine </li><li> 15 pg / ml blasticidine </li></ul> Solution stock 4-thiouridine (1 M) <ul><li> 260,27 mg de 4-thiouridine </li><li> 1 ml de DMSO </li></ul> Doxycycline stock (10 mg / ml) <ul><li> 10 mg doxycycline </li><li> 1 ml de DMSO </li></ul> 1x tampon de lyse NP40 Préparer un stock de tampon 5x sans DTT et les inhibiteurs de protéase. Ajouter la TNT et inhibiteur de la protéase directement avant l&#39;expérience. <ul><li> HEPES 50 mM, pH 7,5 </li><li> 150 mM de KCl </li><li> 2 mM d&#39;EDTA </li><li> 1 mM NaF </li><li> 0,5% (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM de DTT </li><li> complète l&#39;EDTA-libres cocktail inhibiteur de protéase (Roche) </li></ul> Tampon citrate-phosphate <ul><li> 4,7 g / l d&#39;acide citrique </li><li> 9,2 g / l de Na 2 HPO 4 </li><li> pH 5,0 </li></ul> IP-tampon de lavage <ul><li> 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 </li><li> 300 mM de KCl </li><li> 0,05% (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM de DTT (ajouter directement avant l&#39;expérience) </li><li> complète l&#39;EDTA-libres cocktail inhibiteur de protéase (Roche) (ajouter directement avant l&#39;expérience) </li></ul> Tampon de lavage haute-sel <ul><li> 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 </li><li> 500 mM de KCl </li><li> 0,05% (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM de DTT (ajouter directement avant l&#39;expérience) </li><li> complète l&#39;EDTA-libres cocktail inhibiteur de protéase (Roche) (ajouter directement avant l&#39;expérience) </li></ul> La déphosphorylation de tampon <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 </li><li> 100 mM de NaCl </li><li> MgCl2 10 mM </li><li> DTT 1 mM </li></ul> Tampon de lavage Phosphatase <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 20 mM d&#39;EGTA </li><li> 0,5% (v / v) NP40 </li></ul> Polynucléotide kinase (PNK) tampon sans TNT <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> NaCl 50 mM </li><li> MgCl2 10 mM </li></ul> PNK tampon <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> NaCl 50 mM </li><li> MgCl2 10 mM </li><li> DTT 5 mM </li></ul> Tampon SDS Chargement de la page <ul><li> Glycérol à 10% (v / v) </li><li> 50 mM Tris-HCl, pH 6,8 </li><li> 2 mM d&#39;EDTA </li><li> 2% (p / v) SDS </li><li> 100 mM de DTT </li><li> 0,1% de bleu de bromophénol </li></ul> 2x protéinase K tampons <ul><li> 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 150 mM de NaCl </li><li> 12,5 mM EDTA </li><li> 2% (p / v) SDS </li></ul>

par-clip - une méthode pour identifier transcriptome à l&#39;échelle des sites de liaison des protéines liant l&#39;arn

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

Transcrits d&#39;ARN sont soumis à la régulation des gènes post-transcriptionnel en interagissant avec des centaines de protéines liant l&#39;ARN (pratiques commerciales restrictives) et microARN complexes contenant ribonucléoprotéine (miRNPs) qui sont souvent exprimés dans une cellule de type dépendante. Pour comprendre comment l&#39;interaction de ces facteurs liant l&#39;ARN affecte la régulation de la transcription individuels, des cartes à haute résolution in vivo des protéines-ARN interactions sont nécessaires 1. Une combinaison de facteurs génétiques, des approches biochimiques et informatiques sont généralement appliqués pour identifier l&#39;ARN-RBP ou de l&#39;ARN-RNP interactions. Profilage biopuces de l&#39;ARN associés aux pratiques commerciales restrictives immunopurifié (RIP-Chip) 2 définit les objectifs à un niveau du transcriptome, mais son application est limitée à la caractérisation des interactions cinétiquement stable et seulement dans de rares cas 3,4 permet d&#39;identifier l&#39;élément de reconnaissance RBP (RRE ) dans l&#39;ARN cible de long. Plus directe informations sur le site RBP cible est obtenu en combinant dans réticulation UV vivo 5,6 avec l&#39;immunoprécipitation 7-9 suivie de l&#39;isolement de segments d&#39;ARN réticulé et séquençage d&#39;ADNc (CLIP) 10. CLIP a été utilisé pour identifier les cibles d&#39;un certain nombre de pratiques commerciales restrictives 11-17. Toutefois, CLIP est limitée par la faible efficacité des UV à 254 nm ARN-protéine de réticulation, et l&#39;emplacement de la réticulation n&#39;est pas facilement identifiable au sein de l&#39;fragments séquencés réticulés, ce qui rend difficile de séparer les UV réticulé cibler des segments d&#39;ARN à partir de fond non réticulé fragments d&#39;ARN également présent dans l&#39;échantillon. Nous avons développé une approche puissante de réticulation basé sur des cellules de déterminer à haute résolution et du transcriptome à l&#39;échelle des sites de liaison des pratiques commerciales restrictives cellulaire et miRNPs que nous appelons PAR-Clip (photoactivables-ribonucléoside-Enhanced réticulation et immunoprécipitation) (voir Fig. 1A pour un aperçu de la méthode). La méthode repose sur l&#39;incorporation d&#39;analogues ribonucléoside photoréactif, tels que le 4-thiouridine (4-SU) et 6-thioguanosine (6-SG) dans transcrits d&#39;ARN naissantes par des cellules vivantes. L&#39;irradiation des cellules par la lumière UV de 365 nm induit réticulation efficace de photoréactif nucléoside marqué ARN cellulaires aux pratiques commerciales restrictives qui interagissent. Immunoprécipitation de la RBP de l&#39;intérêt est suivie de l&#39;isolement de l&#39;ARN réticulé et coimmunoprecipitated. L&#39;ARN isolé est transformée en une banque d&#39;ADNc et profonde séquencé en utilisant la technologie Solexa. Un trait caractéristique de banques d&#39;ADNc préparées par RAP-Clip est que la position précise de réticulation peuvent être identifiés par des mutations qui résident dans l&#39;ADNc séquencés. Lorsque vous utilisez 4-SU, séquences réticulés thymidine à la transition cytidine, tandis que l&#39;aide de 6-SG résultats dans la guanosine à l&#39;adénosine mutations. La présence des mutations dans les séquences réticulé permet de les séparer du fond de séquences dérivées d&#39;ARN cellulaires abondants. Application de la méthode à un certain nombre de protéines liant l&#39;ARN diversifié a été signalé dans Hafner et al. 18

Transcrits d&#39;ARN sont soumis à régulation post-transcriptionnelle vaste qui est médiée par une multitude d&#39;action trans protéines liant l&#39;ARN (pratiques commerciales restrictives). Nous présentons ici une méthode généralisable pour identifier précisément et à l&#39;échelle du transcriptome à l&#39;échelle des sites liaison à l&#39;ARN de pratiques commerciales restrictives.

PAR-Clip - Une méthode pour identifier transcriptome à l&#39;échelle des sites de liaison des protéines liant l&#39;ARN

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

L’objectif général de cette procédure est de déterminer les sites de liaison à l’échelle du transcriptome des protéines de liaison à l’ARN ou RVP. Ceci est accompli en utilisant d’abord des analogues nucléosidiques photoréactifs pour le marquage in vivo des transcrits naissants. La deuxième étape de la procédure consiste à réticuler l’ARN et les protéines de liaison à l’ARN par une lumière UV de 365 nanomètres.La troisième étape de la procédure consiste à immunoprécipiter la protéine de liaison à l’ARN étudiée et à récupérer la réticulation à l’ARN. La dernière étape de la procédure consiste à convertir l’ARN en une banque de CD NA et une séquence profonde. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent les sites de liaison à l’échelle du transcriptome des RVP et permettent de définir l’élément de reconnaissance de l’ARN et ses préférences de liaison.Bonjour, je m’appelle Marcus Hoffner du laboratoire de Tom SEL à l’Université Rockefeller de New York. Aujourd’hui, nous allons présenter une méthode appelée par lip ou photoable rib nucleoside analog enhanced crosslinking and immunoprecipitation. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour identifier sur un transcriptome par son écaillaire, les sites de liaison des protéines de liaison à l’ARN et leurs motifs et préférences de liaison.D’accord, alors commençons. La réticulation UV in vivo commence dans une hotte à flux laminaire. Dans ce protocole, nous utiliserons l’IGF marqué, deux BP, une cellule, comme modèle exemplaire en utilisant une technique stérile.Développer HEK 2 93 cellules exprimant de manière stable le drapeau HA marqué IGF deux BP un sous le contrôle d’un répresseur Tet dans un milieu de culture cellulaire HEK 2 93 utiliser entre 100 et 400 fois 10 à la sixième cellule et les faire croître jusqu’à environ 80 % de fluidité. 14 heures avant la réticulation, les cellules avaient l’analogue riboside photoréactif pour la thio uridine ou pour SU directement dans le milieu de culture cellulaire. Alternativement, six èmes guines ou six SG peuvent être utilisés après l’ajout du riboside photoréactif induire l’expression du drapeau HA marqué IGF deux BP un par l’ajout de cellules doxycycline sont ensuite incubés pendant la nuit dans un incubateur cellulaire.Ensuite, décantez le milieu de croissance. Ensuite, lavez une fois les cellules avec 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate glacée par plaque. Retirez ensuite complètement le PBS par décantation.Placez les plaques découvertes sur un plateau avec de la glace et irradiez-les avec une lumière UV de 365 nanomètres dans un enjambeur de liaison 2, 400 réticulant UV ou équivalent suite à un rayonnement UV, grattez les cellules avec un policier en caoutchouc dans un millilitre de PBS par plaque. Transférez les cellules dans des tubes de centrifugation de 50 millilitres et centrifugez-les à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le super nom et conservez la pastille de cellule.À ce stade, les granules de cellules peuvent être congelées dans de l’azote liquide et stockées à moins 80 pendant au moins 12 mois. Pour poursuivre la procédure, mettez la pastille en suspension en trois volumes d’un tampon de lyse X NP 40 et incubez sur de la glace pendant 10 minutes. Éliminer le lysat cellulaire par centrifugation à 13 000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Après la centrifugation, clarifiez davantage le lysat en le filtrant à travers un filtre à seringue à membrane de cinq microns. Enfin, ajoutez les ARN T un à une concentration finale d’une unité par microlitre et incubez dans un bain-marie à 22 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, refroidissez la réaction sur de la glace pendant cinq minutes.Suite à une réticulation UV in vivo. Préparez les billes magnétiques pour l’immunoprécipitation. Transférez 10 microlitres de particules magnétiques de protéine G de billes de dyne par un mil de lysat cellulaire dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre.Placez ensuite le tube contenant les billes sur un support magnétique pendant une à deux minutes. Retirez le surnageant et ajoutez un millilitre de tampon de phosphate de citrate dans le tube pendant qu’il se trouve sur le séparateur magnétique. Ensuite, bouchez le tube et vortex l’échantillon pour remettre les billes en suspension.Centrifugez brièvement pour recueillir les billes restantes dans le capuchon du tube. Répétez ce lavage avec un millilitre supplémentaire de tampon de phosphate de citrate. Après le lavage, suspendre les billes et le tampon phosphate de citrate à un volume de deux fois le volume initial de la suspension de betterave.Ajoutez ensuite 0,25 milligramme d’anticorps monoclonaux Anti-Flag M pour un millilitre de suspension de battement. Incuber la suspension sur une roue rotative pendant 40 minutes à température ambiante après l’incubation, laver les billes deux fois dans un millilitre de tampon de phosphate de citrate comme décrit précédemment, ce lavage sert à éliminer tout anticorps non lié après le lavage Resus, suspendre les billes et le tampon de phosphate de citrate comme avant quatre. Pour commencer l’immunoprécipitation, ajoutez les billes magnétiques conjuguées d’anticorps fraîchement préparées aux ARN T un lysat cellulaire traité.Transférez le mélange dans des tubes de centrifugation de 15 millilitres et tournez pendant une heure à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, récupérez les billes magnétiques, jetez les billes de surnageant en suspension dans un millilitre de tampon de lavage IP et transférez-les dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre. Lavez les billes comme décrit ci-dessus deux fois dans un millilitre de tampon de lavage IP.Après le lavage final, suspendez les billes dans le volume de cordon d’origine du tampon de lavage IP. Ajoutez ensuite RNAT un à une concentration finale de 100 unités par microlitre. Incuber la suspension de perles dans un bain-marie à 22 degrés Celsius pendant 15 minutes.Ensuite, refroidissez la suspension sur de la glace pendant cinq minutes. Ensuite, lavez les perles trois fois dans un millilitre de tampon de lavage à haute teneur en sel. Ensuite, mettez les billes en suspension dans un volume de billes d’origine de tampon de déphosphorylation.Ajouter la phosphatase alcaline intestinale de veau à une concentration finale de 0,5 unité par microlitre et incuber la suspension pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Lavez les billes deux fois dans un millilitre de tampon de lavage à la phosphatase, puis deux fois de plus dans une polynucléotide kinase ou un tampon PNK sans DTT. Enfin, remettez les billes en suspension dans un volume de bille d’origine de la mémoire tampon PNK.Commencer le radiomarquage de l’ARN réticulé. Ajoutez gamma 32 PATP et T quatre PNK à un volume de bille d’origine de la suspension de bille fraîchement préparée. Incuber la suspension pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.Ensuite, ajoutez un TP non radioactif à la suspension et incubez-le pendant cinq minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez les billes magnétiques cinq fois avec 800 microlitres de tampon PNK sans DTT. Enfin, remettez en suspension les billes dans 70 microlitres de page FDS.Incuber la suspension du radiomarqueur pendant cinq minutes dans un bloc chauffant à 95 degrés Celsius pour dénaturer et libérer les protéines de liaison à l’ARN immunoprécipité avec l’ARN réticulé. Ensuite, retirez les billes magnétiques sur le séparateur et transférez le super natin dans un tube de micro-centrifugeuse propre de 1,5 millilitre Chargez 40 microlitres de suade par puits d’un novox bis triss quatre à 12 % de gel poly acrylamide préfabriqué et faites fonctionner le gel pendant 55 minutes à 200 volts. Une fois que le gel a coulé, démontez la chambre de gel et démontez les plaques, en laissant le gel monté sur une plaque pour faciliter l’alignement du gel sur l’impression du papier de l’imageur phospho.Implantez trois minuscules morceaux de gel radioactif de manière asymétrique aux coins du gel. Enveloppez le gel dans un film plastique tel que Saran wrap pour éviter toute contamination. Exposez le gel à un écran vide d’imageur phospho pendant une heure et celui-ci sur un imageur phospho.Ensuite, alignez le gel sur l’impression de l’imageur phospho à l’aide des morceaux de gel implantés pour l’orientation. Découpez les bandes qui correspondent à la taille attendue de la protéine de liaison à l’ARN ou RBP. Transférez les bandes dans un tube MIDI dtu dialyzer et ajoutez 800 microlitres d’un tampon de course XSDS électro élué.Le complexe réticulé R-N-A-R-B-P à 100 volts pendant deux heures selon les instructions du fabricant. Suite à l’électro-élution. Ajoutez le tampon protéinase K et la protéinase K incubez la solution pendant 30 minutes à 55 degrés Celsius.Récupérer l’ARN par extraction à l’alcool isoamylique phénol chloroforme acide, suivie d’une extraction au chloroforme. Ajoutez ensuite un microlitre de glycogène et précipitez l’ARN en ajoutant trois volumes d’éthanol. Enfin, dissolvez la pastille obtenue dans 10,5 microlitres d’eau.Une fois que l’ARN a été récupéré, faites-le passer par un protocole standard de préparation de banque d’ADNC et effectuez une analyse bioinformatique minutieuse des lectures de séquences. Les résultats représentatifs pour un clip par réalisé avec des cellules HK 2 93 exprimant le drapeau Hha, l’IGF marqué, deux BP un sont montrés avec les analogues nucléosidiques photoréactifs quatre SU et six SG L’efficacité de réticulation du riboside photoréactif alternatif six SG est généralement inférieure à celle de quatre su. L’efficacité de réticulation plus faible pourrait entraîner un fond plus élevé de séquences dérivées de fragments d’ARN cellulaires abondants et, par conséquent, davantage de cellules devraient être initialement utilisées pour l’expérience.Différents analogues photoréactifs de l’uridine par clip sont comparés à la réticulation ou au clip traditionnel UV 2 54 nanomètres, comme on le voit ici. La réticulation des protéines d’ARN UV 2 54 nanomètres a une efficacité de réticulation limitée. L’intensité de la bande radioactive de taille appropriée indique si l’expérience par clip a fonctionné et si suffisamment d’ARN a été isolé pour passer par un protocole de séquençage de petit ARN.La fréquence des mutations caractéristiques dans les lectures séquencées après analyse bioinformatique est indicative de séquences réticulées réussies. Ces mutations sont des transitions T deux C lors de l’utilisation de quatre SU et G deux transitions A lors de l’utilisation du succès. G.La caractéristique déterminante de park lip est la possibilité de dériver l’emplacement de la réticulation en marquant une mutation caractéristique résidant dans les banques de CD NA préparées à partir des ARN récupérés.Cela permet de séparer facilement le signal dérivé d’ARN spécifiquement liés, du bruit des séquences dérivées de fragments co-isolés d’ARN cellulaires abondants. Nous vous avons donc montré aujourd’hui comment isoler des segments d’ARN, spécifiquement reconnus par les protéines de liaison à l’ARN. Lors de cette procédure.Il est important de travailler sans ARN. Voilà. Merci d’avoir regardé et bonne chance pour les expériences.

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