Knockout de plusieurs gènes médié par le concatérateur CRISPR : une technique permettant d’inactiver simultanément plusieurs gènes par une voie d’arrivée d’extrémité non homologue dans les cellules intestinales de souris

Pour éliminer simultanément plusieurs gènes à l’aide du système CRISPR-concatemer-Cas9, commencez par un tube contenant la suspension de cellules intestinales de souris. Complétez le tube avec des vecteurs CRISPR-concatemer contenant la cassette d’expression pour plusieurs ARN guides, ou ARNg, intégrés les uns à côté des autres.

Chaque cassette d’ARNg est conçue sur mesure pour éliminer individuellement le gène prévu. Ajoutez des vecteurs d’expression codant pour l’endonucléase Cas9 dans le même tube. Électroporer le mélange cellule-plasmide - une technique qui utilise le courant électrique pour faciliter l’entrée des plasmides dans la cellule. À l’intérieur de la cellule, la co-expression du concatère CRISPR et du vecteur Cas9 forme respectivement des séquences d’ARNg et des nucléases Cas9.

Chaque séquence d’ARNg se lie à l’enzyme Cas9 correspondante, formant plusieurs complexes d’ARNg Cas9 qui se fixent aux sites cibles du génome de l’hôte. Cette liaison active l’enzyme Cas9, qui produit une entaille dans les deux brins d’ADN en amont du site du motif adjacent au protospacer, ou PAM. Il en résulte une cassure double brin, ou DSB, dans l’ADN cible.

En l'absence de toute séquence homologue au gène cible, le mécanisme de réparation endogène de la cellule, appelé jonction d'extrémité non homologues, est déclenché, permettant aux protéines de réparation et aux molécules de kinase de se lier au site de rupture. Plus tard, l’enzyme ligase répare le DSB, ce qui entraîne des modifications de la séquence du gène cible. Ces modifications perturbent la fonction des gènes, entraînant l’inactivation de plusieurs gènes.