Édition de gènes médiée par transposon PiggyBac dans les iPSC humaines : une procédure pour intégrer le gène d’intérêt dans les iPSC humaines à l’aide du système de transposon PiggyBac

Rincez la culture humaine d’iPSC avec du PBS sans calcium ni magnésium, avant de traiter les cellules avec un réactif de dissociation cellulaire pendant 5 à 10 minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules ont commencé à se détacher du récipient de culture, utilisez une pipette P1000 pour dissocier doucement les cellules manuellement 3 à 4 fois.

Transférez les cellules dans un tube de 15 millilitres et portez le volume final à 10 millilitres avec du PBS frais sans calcium ni magnésium, pour compter. Collecter 1 x 10⁶ cellules par centrifugation, et remettre en suspension la pastille dans 100 microlitres de tampon R du kit d’électroporation.

Ajoutez 4,5 microgrammes d’ADN plasmidique vecteur transposable et 0,5 microgramme d’ADN plasmidique transposase PiggyBac pour la transfection. Transfect avec le système d'électroporation de la cellule selon les instructions du fabricant, avec les paramètres indiqués. Alors. Ensemencez les cellules dans un milieu iPSC humain complété par 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK Y-27632 dans une boîte recouverte d’une matrice de 6 millimètres.