Réaction en chaîne de la polymérase quantitative pour dénombrer les bactériophages

Pour énumérer les bactériophages par réaction en chaîne par polymérase quantitative, qPCR, obtenez un cocktail de réaction qPCR contenant de l’ADN polymérase Taq, des amorces, des désoxynucléotides triphosphates (dNTP) et des molécules de colorant rapporteur fluorescent dans un tampon optimisé. Transférer dans les puits d'une plaque qPCR.

Ajouter des bactériophages traités thermiquement. Le traitement thermique libère l’ADN des bactériophages à partir des particules de bactériophages. Scellez la plaque en empêchant l’évaporation du mélange. Chargez la plaque dans le système qPCR, en réglant les conditions de cycle appropriées.

Le chauffage à des températures élevées dénature l’ADN double brin en brins simples. Il active également l’ADN polymérase Taq. Le recuit provoque la liaison d’amorces spécifiques à la séquence aux brins d’ADN complémentaires du bactériophage. L'extension permet à l'ADN polymérase Taq activée d'ajouter des dNTP à l'extrémité 3' de l'amorce, prolongeant le brin d'ADN en croissance dans la direction 5' à 3'.

Les molécules de colorant s’intercalent dans l’ADN double brin nouvellement synthétisé, provoquant une augmentation de l’intensité de la fluorescence. Chaque cycle de PCR double la quantité d’ADN cible, augmentant ainsi l’intensité de la fluorescence.

Déterminez le cycle de seuil, Ct, valeur à partir duquel la fluorescence mesurée dépasse le niveau de fond.

La valeur Ct est inversement proportionnelle à la quantité d’ADN de départ, chaque génome de bactériophage équivalant à une particule de bactériophage, ce qui facilite la quantification des bactériophages à partir de la courbe standard de l’ADN des bactériophages.

Post-amplification, effectuez une analyse de la courbe de fusion, en augmentant progressivement la température de réaction. À une température de fusion spécifique, la moitié de l’ADN se sépare en brins simples, libérant des molécules de colorant et provoquant une diminution soudaine de la fluorescence.

Une température de fusion distincte, unique pour le produit qPCR, valide la spécificité du produit.