Détection d'immunofluorescence Deux analogues de la thymidine (CldU et UDI) dans les tissus primaires
7 décembre 2010
Nous avons tiré une stratégie afin de détecter l'incorporation séquentielle des analogues de la thymidine (CldU et UDI) dans les tissus de souris adultes de quantifier deux tours successifs de la division cellulaire. Cette stratégie est utile pour détecter le renouvellement des cellules de la longue durée de vie des tissus, la transformation oncogène, ou de transit d'amplification des cellules.
Bonjour et bienvenue dans le protocole de coloration Calor D-U-I-D-U. Aujourd'hui, notre vidéo commencera par l'étape trois : la réhydratation, la perméabilisation et la récupération de l'antigène. Commencez par charger vos lames dans le porte-lame.
Une fois vos lames chargées, placez-les dans un bain de xylène pendant cinq minutes. Suivra un deuxième bain de xylène, là encore pendant cinq minutes.
Continuez à réhydrater vos lames en les transférant dans une solution d'éthanol, en commençant par la solution à 100 % et en terminant à 50 %. Vous terminerez la réhydratation des lames en les plaçant pendant cinq minutes dans un XPBS afin de rendre les membranes cellulaires perméables. Immergez vos lames dans une solution de Triton X 0,2 % pendant cinq minutes. Préparez vos lames pour la récupération des antigènes tissulaires par micro-ondes en les plaçant dans un récipient en verre contenant un volume suffisant de tampon citrate de sodium 0,01 molaire pour que la solution recouvre cinq centimètres au-dessus du haut des lames.
Pour compenser les pertes par évaporation, faire chauffer les lames au micro-ondes jusqu'à ce que la solution entre en ébullition. Cela devrait prendre entre trois et dix minutes à puissance maximale. Vérifier que les lames sont en ébullition.
Réduisez la puissance du micro-ondes entre 10 et 80 % et poursuivez l'ébullition lente des lames pendant 20 minutes supplémentaires. Après ébullition, placez le bécher contenant les lames sur le plan de travail afin de permettre un refroidissement progressif pendant environ deux heures, jusqu'à ce qu'elles atteignent la température ambiante. Vérifiez que les lames sont à température ambiante.
Immerger les lames dans de l'acide chlorhydrique naturel 1,5 pendant 40 minutes à température ambiante. Retirer les lames de l'acide chlorhydrique et les placer pendant cinq minutes dans un lavage XPBS. Cela sera suivi d'un deuxième lavage XPBS.
Retirez vos lames de la solution d'accès XPBS à l'aide d'un stylo à cire imperméable. Entourez chaque section de tissu et replacez la lame dans le PBS. Préparez une chambre d'incubation humide en plaçant une serviette en papier humide au fond d'un récipient hermétique.
Préparer une solution de blocage contenant 10 % de sérum d'hybridation dilué dans du XPBS. Il est important de recouvrir entièrement chaque section de tissu avec la solution, pour des échantillons de tissu d'environ un sur 1,5 centimètre. Un volume de 50 microlitres de solution de blocage est suffisant.
Préparez l'anticorps primaire IDU en diluant des antisérums anti-BRDU de souris dans 5 % de sérum de âne. Ajoutez une concentration de un à 250. Déposez la solution primaire sur chaque section de lame à l’aide d’une pipette.
Placez vos lames dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius. Pour une incubation nocturne, préparez un lavage de haute stringence. Le TBST fonctionne bien.
Placer les lames dos à dos. Mettre les lames dans environ 35 à 40 millilitres de solution TBST. Placer les tubes dans un incubateur agité pour culture bactérienne à 37 degrés Celsius.
Laissez-les agiter pendant 20 minutes à 25 tr/min. Placez maintenant vos lames dans un support. Mettez vos lames dans un XPBS pour un lavage au PBS de cinq minutes.
Cela se fera par un deuxième lavage au XPBS pendant cinq minutes. Préparez la solution d'anticorps primaire CLDU en diluant l'anticorps anti-BRDU de rat dans 5 % de sérum d'âne. Ajoutez une concentration de un à 250 sur les lames posées sur une serviette en papier, puis délimitez avec un crayon à cire.
Utilisez une pipette pour recouvrir chaque section de tissu de solution primaire de CLDU. Utilisez environ 50 microlitres de solution afin de vous assurer que chaque section de tissu est entièrement recouverte. Placez vos lames dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pour une incubation nocturne.
Placez vos lames dans un support, puis immergez-les dans un bain de PBS 1X pendant cinq minutes. Placez vos lames dans un second bain de PBS 1X pendant cinq minutes. Préparez les anticorps secondaires en diluant les anticorps CY deux anti-RAD de l’âne et PS cinq anti-muse de l’âne dans du sérum d’âne à 5 % ; le DPI sera également utilisé pour la coloration nucléaire. Recouvrez complètement les sections de tissu avec les anticorps secondaires.
50 microlitres de solution devraient suffire pour recouvrir complètement votre tissu. Placez la chambre d'hydratation dans un endroit sombre à température ambiante pour une incubation d'une heure. Placez vos lames dans un support, puis immergez-les dans un bain de PBS 1X pendant cinq minutes.
Placez vos lames dans un deuxième lavage avec du PBS pendant cinq minutes. Éliminez l'excès de solution de PBS en tapotant sur une serviette en papier. Ensuite, prenez un milieu de montage anti-décoloration au gel d'or prolongé et déposez une petite goutte sur chaque section de tissu.
Prenez une lamelle et placez-la délicatement sur vos sections de lame. Utilisez la serviette en papier comme presse pour expulser les bulles d'air éventuellement piégées entre vos sections de lame et la lamelle. Enfin, utilisez la pointe d'une pipette pour éliminer les bulles d'air résiduelles éventuelles. Observez votre tissu d'intérêt à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’une source de lumière à haute énergie et de plusieurs canaux fluorescents afin de quantifier les résultats.
Commencez par dénombrer le nombre de cellules positives à Dabi. Dénombrer le nombre de cellules positives à CLDU en utilisant l'image à deux canaux SI. Dénombrer le nombre de cellules positives à IDU en utilisant l'image à cinq canaux SCI.
Enfin, comptez les cellules doublement marquées positivement en basculant entre le fichier image du canal SCI deux et celui du canal SCI cinq.
Aperçu
Cet article présente une méthode permettant de détecter l'incorporation séquentielle d'analogues de la thymidine (CldU et IdU) dans des tissus de souris adultes, ce qui permet de quantifier deux cycles successifs de division cellulaire. Cette technique est utile pour l'étude du renouvellement cellulaire dans les tissus à longue durée de vie, de la transformation oncogénique et des cellules amplificatrices transitoires.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Neurosciences
- Oncologie
Contexte
- Les analogues de thymidine sont utilisés pour marquer les cellules en division.
- La compréhension de la division cellulaire est essentielle pour l'étude de la régénération tissulaire.
- Le renouvellement cellulaire est important tant en physiologie normale que dans les états pathologiques.
- Un marquage séquentiel peut fournir des informations sur la dynamique des populations cellulaires.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour quantifier la division cellulaire dans les tissus.
- Évaluer les implications du renouvellement cellulaire dans divers contextes biologiques.
- Approfondir la compréhension des processus oncogéniques par l'analyse de la division cellulaire.
Méthodes utilisées
- Incorporation séquentielle de CldU et d'IdU dans les tissus de souris.
- Microscopie fluorescente pour la visualisation des cellules marquées.
- Quantification des cellules positives pour DAB, CldU et IdU.
- Utilisation d'anticorps spécifiques pour la détection des analogues de la thymidine.
Résultats principaux
- Détection réussie de la division cellulaire séquentielle dans des échantillons tissulaires.
- Analyse quantitative des taux de renouvellement cellulaire.
- Identification de marqueurs potentiels de transformation oncogénique.
- Éléments de compréhension du comportement des cellules amplificatrices transitoires.
Conclusions
- La méthode développée offre une approche robuste pour l'étude de la division cellulaire.
- Les résultats contribuent à la compréhension de la dynamique des tissus dans la santé et la maladie.
- Cette technique peut être appliquée à divers domaines de recherche, notamment l'oncologie et la médecine régénérative.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
La quantification précise des divisions cellulaires successives permet une détection mécanistique des risques lors de la validation de cibles en clarifiant la dynamique proliférative dans des systèmes pertinents pour la maladie. Cette approche renforce la fiabilité prédictive des modèles précliniques en distinguant les réponses prolifératives transitoires de celles qui sont durables, ce qui oriente l'identification des candidats prometteurs et le tri des portefeuilles de projets. L'applicabilité de cette méthode aux tissus à longue durée de vie améliore la découverte de biomarqueurs translationnels en oncologie et en médecine régénérative.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en mesurant deux cycles successifs de division cellulaire dans un tissu primaire.
- Valeur opérationnelle : Permet une validation fonctionnelle de cibles grâce à la visualisation directe de la cinétique proliférative dans des modèles de maladie.
- Valeur prédictive : Soutient la réduction des risques mécanistiques en quantifiant les taux de renouvellement cellulaire, fournissant ainsi des indications sur la pertinence de la cible et la modulation des voies biologiques.
Développement de tests et criblage
- Préparation des tests : Prépare des systèmes biologiques validés pour l'évaluation de composés en aval à l'aide de protocoles standardisés de coloration immunohistochimique.
- Résultats quantitatifs : Génère des décomptes mesurables de cellules positives à la DAB, à la CldU et à l'IdU, permettant des points terminaux de criblage reproductibles.
- Extensibilité : Optimisé pour l'administration à faible dose d'analogues de thymidine par l'eau de boisson, permettant des études à administration chronique dans des modèles précliniques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Appliqué pour identifier la transformation oncogénique et évaluer la contribution des cellules amplificatrices transitoires à la croissance tissulaire.
- Continuité translationnelle : Relie la découverte à la validation préclinique en fournissant des données quantitatives sur la prolifération dans différents types de tissus.
- Décisions ajustées au risque : Guide les stratégies d'avancement en précisant si la croissance observée résulte d'une activité des cellules souches ou d'une expansion des cellules amplificatrices transitoires.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, de la validation de la cible jusqu'à l'identification de composés précliniques, en fournissant des paramètres de prolifération qui soutiennent les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin à chaque étape.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en quantifiant la synthèse séquentielle de l'ADN en réponse à des perturbations pharmacologiques ou génétiques.
- Écrans : Fournit des sections de tissus prêtes à l'analyse avec une détection standardisée de l'incorporation d'analogues de thymidine pour le criblage de composés.
- Analytique : Permet la comparaison des indices de prolifération entre différentes conditions grâce à la séparation des canaux fluorescents et à la quantification des cellules doublement positives.
- Recherche translationnelle : Relie la phase initiale de découverte à la validation préclinique en suivant la dynamique des lignées cellulaires dans des tissus pertinents pour les maladies humaines.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour des études longitudinales de la prolifération dans plusieurs domaines thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles en fournissant une preuve directe de l'historique des divisions cellulaires.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à des protocoles standardisés de perméabilisation, de récupération des antigènes et de marquage immunohistochimique multiplexe.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant une réduction précoce des risques associés aux cibles en fonction de leur responsabilité dans la prolifération cellulaire.
- Impact sur le portefeuille : Favorise une priorisation ajustée au risque en distinguant les effets thérapeutiques sur les compartiments des cellules souches et des cellules progénitrices.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en immunohistochimie et en microscopie fluorescente pour la détection multiplexe.
- Dépend de l'accès à une infrastructure de récupération d'antigènes (micro-ondes, tampon citrate) et à des capacités d'incubation séquentielle d'anticorps.
- Exige une standardisation inter-équipes des protocoles de blocage, de lavage et de montage afin de minimiser les effets de lot.
- L'adaptation à différents systèmes modèles nécessite la validation de la spécificité des anticorps et de la perméabilité des tissus dans chaque contexte.
- Les limites pratiques incluent le masquage potentiel d'épitopes et la nécessité d'optimiser les schémas de dosage des analogues pour éviter la toxicité.
